專利名稱：真菌絲氨酸蛋白酶及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于各種應(yīng)用，特別是洗衣洗滌劑和餐具洗滌劑的真菌絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明涉及編碼所述酶的核酸分子、重組載體、用于產(chǎn)生所述酶的宿主細(xì)胞、包含所述酶的酶組合物以及用于制備這類組合物的方法。本發(fā)明還涉及所述酶或包含所述酶的組合物的各種用途。背景微生物蛋白酶是最重要的水解酶之一，并應(yīng)用于各個(gè)工業(yè)部門，例如洗滌劑、食品、皮革、制藥、診斷學(xué)、廢物管理和銀回收。微生物的胞外蛋白酶占全球工業(yè)用酶總銷售的主要部分，超過三分之一(Cherry和Fidantsef，2003)。大約90 %的商用蛋白酶是洗滌劑酶 (Gupta等，2002)。主要是中性和堿性的大多數(shù)商用蛋白酶由屬于芽孢桿菌屬(Bacillus) 的生物產(chǎn)生?？莶輻U菌蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶或由芽孢桿菌屬菌種產(chǎn)生的枯草桿菌蛋白酶構(gòu)成工業(yè)用蛋白酶的最大亞類。這些酶作為洗滌劑的蛋白降低組分或添加劑在商業(yè)上具有重要性。目前在使用中的商用洗滌劑制品包含來源于芽孢桿菌屬菌種的天然存在的堿性絲氨酸蛋白酶或者是來自芽孢桿菌屬菌種的重組蛋白酶制備物(MaUrer，2004)。通過位點(diǎn)定向誘變和/或隨機(jī)誘變，已開發(fā)出催化效率得到改進(jìn)和/或?qū)囟?、氧化劑和變化的洗滌條件具有更好穩(wěn)定性的天然酶的變體。商用蛋白酶的實(shí)例為例如枯草桿菌蛋白酶 Carlsberg (Alcalase , Novozymes, DK)、枯草桿菌蛋白酶 309 (Savinase Novozymes, DK)、枯草桿菌蛋白酶 147 (Esperase ,Novozymes, DK)、Purafect (Genencor Inc., USA)>Kannase (Novozymes, DK)、Purafect ⑧Ox, Properase (Genencor Inc. , USA)及 BLAP S 和 X 系列(Henkel，DE)。也已從包括酵母和絲狀真菌在內(nèi)的真核生物中分離出若干堿性絲氨酸蛋白酶(EC 3. 4. 21)和編碼這些酶的基因。美國專利號3，652，399和EP 519229 (Takeda Chemical Industries, Ltd.，JP)公開了來自鐮孢屬(Fusarium)(無性態(tài)，有性型)或赤霉屬(Gibberella)(有性態(tài)，無性型)、特別是來自鐮孢屬菌種S-19-5(ATCC 20192，IFO 8884)、亞麻尖鐮孢(F. oxysporum f. sp. Lini) (IF0 5880)或小麥赤霉(G. saubinetti) (ATCC 20193，IF06608)的堿性蛋白酶用于洗滌劑和其它清潔劑組合物的配制中。美國專利號5，288, 627 (NovoNordisk A/S，DK)公開了包含分離的絲氨酸蛋白酶的內(nèi)切蛋白酶制備物，所述絲氨酸蛋白酶顯示與來源于尖鐮孢(F. oxysporum)DSM沈72的蛋白酶的免疫化學(xué)同一性。WO 88/03946 和 WO 89/04361 (Novo Industri A/S，DK)公開了包含蛋白酶和脂肪酶的加酶洗滌劑添加劑和洗滌劑組合物，其中真菌蛋白酶來源于鐮孢屬，特別是尖鐮孢或腐皮鐮孢(F. solani)。W089/06270中公開了包含只對一個(gè)或兩個(gè)特定氨基酸附近的肽鍵具有特異性的蛋白酶的洗滌劑添加劑。W01994025583(NOVONOrdisk A/S，DK)公開了可來源于鐮孢屬菌種(特別是尖鐮孢(DSM 2672)菌株)的有活性的胰蛋白酶樣蛋白酶，和編碼所述酶的DNA序列。來源于鐮孢屬菌種BLB(FERM BP-10493)的新的蛋白酶的氨基酸序列公開于WO 2006101140 (S0DX Co. Ltd，Nakamura)。同樣，有研究報(bào)道了來自真菌菌種(例如念球?qū)?Tritirachium)和耳霉屬(Conidiobolus))的堿性蛋白酶(有關(guān)綜述見Anwar和 Saleemuddin,1998)。亦從若干專利申請知曉真菌絲氨酸蛋白酶在不同應(yīng)用中的用途。例如，WO 1992018599 (NovoNordisk A/S)中公開了纖維素酶和蛋白酶(特別是來自鐮孢屬菌種DSM 沈72的胰蛋白酶樣蛋白酶)的組合作為洗滌劑添加劑或洗滌劑組合物。這類洗滌劑組合物還可包含可逆的蛋白酶抑制劑用于穩(wěn)定WO 1992003529和WO 1992005239 (NovoNordisk A/S)中公開的酶。用酶雜合體去除或漂白纖維素織物的染污或污漬的方法公開于WO 1997028243 (NovoNordisk A/S)，所述酶雜合體包含催化活性氨基酸序列，如與包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列連接的蛋白酶。WO 1997002753 (NovoNordisk A/S)公開了使用脂肪酶和優(yōu)選為獲自鐮孢屬的絲氨酸蛋白酶的蛋白酶溫和清洗受污染的加工設(shè)備的方法。由于節(jié)能需要，洗滌溫度逐步下降。另外，當(dāng)今消費(fèi)者需求和無法耐受高溫的合成纖維使用的增加改變了洗滌習(xí)慣，趨于采用低洗滌溫度。EP (^90567和EP 0290569 (Novo Nordisk A/S,DK)公開了來自放線菌(達(dá)松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei))和真菌(馬昆德擬青霉(Paecilomyces marquandii))微生物的低溫堿性蛋白酶。社會(huì)經(jīng)濟(jì)挑戰(zhàn)和政府法規(guī)迫使洗滌劑行業(yè)考慮許多環(huán)境因素，不僅僅包括使用更溫和的化學(xué)品，這可以較少的量使用，因此留下更少的環(huán)境廢物痕跡，而且還包括節(jié)能的需要。洗滌劑酶，特別是蛋白酶，是洗滌劑組合物中的重要成分。通過降低洗滌溫度而節(jié)能的要求和無法耐受高溫的合成纖維使用的增加以及目前的生活方式已改變消費(fèi)者的習(xí)慣趨于低洗滌溫度，并且產(chǎn)生了對在低溫下有效的新的酶的需求。盡管已發(fā)表了許多專利公告、綜述和文章的事實(shí)，其中在例如EP (^90567和EP 0290569 (Novo Nordisk A/S,DK)中公開了來源于各種微生物的絲氨酸蛋白酶，例如來自放線菌(達(dá)松維爾擬諾卡氏菌)和真菌(馬昆德擬青霉)微生物的低溫堿性蛋白酶，但是仍強(qiáng)烈需要這樣的備選絲氨酸蛋白酶，其特別在低、中溫范圍內(nèi)適合并有效改變、降解和去除蛋白質(zhì)物質(zhì)，而且在性質(zhì)極為不同的洗滌劑存在下是穩(wěn)定的。洗滌劑行業(yè)在使其新產(chǎn)品適應(yīng)消費(fèi)者的習(xí)慣和要求、適應(yīng)新的紡織品和新的洗滌機(jī)的性質(zhì)方面取得極大的進(jìn)步。顯然，在開發(fā)新的洗滌劑(特別是洗衣組合物和餐具洗滌組合物)時(shí)，必需滿足各種不同的快速變化的需求。為了滿足洗滌劑行業(yè)和政府法規(guī)的所有各不相同的要求，用于洗滌劑組合物的新的絲氨酸蛋白酶成分應(yīng)不僅僅能夠在寬的PH 和溫度范圍內(nèi)完成其任務(wù)，并且在各種條件(包括與各種不同洗滌劑組合的機(jī)械和化學(xué)干預(yù))下保持穩(wěn)定，而且還需要的是絲氨酸蛋白酶可大量生產(chǎn)，其可因易于從發(fā)酵液和菌絲體中分離而進(jìn)行有成本效益的下游加工。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供真菌來源的絲氨酸蛋白酶，其具有廣泛的底物特異性、在寬的PH范圍內(nèi)具有活性，并具有寬廣的最適溫度，即在低溫和中等溫度兩者下均起作用。用于洗衣洗滌劑和餐具洗滌劑的絲氨酸蛋白酶還必須在洗滌劑存在下穩(wěn)定，或者與洗滌劑相容。具體地講，本發(fā)明的目的是提供絲氨酸蛋白酶，其能夠在比目前市售的酶制品低的溫度下去除蛋白質(zhì)物質(zhì)，包括洗滌衣物和餐具的污漬，從而節(jié)約能源。真菌絲氨酸蛋白酶可在高產(chǎn)真菌宿主中產(chǎn)生，并且容易進(jìn)行其下游加工，例如發(fā)酵液和菌絲體的分離。
本發(fā)明涉及真菌絲氨酸蛋白酶，其具有絲氨酸蛋白酶活性，并包含SEQ ID NO 18 限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列或與SEQ ID NO 18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列有至少81%同一性的氨基酸序列。本發(fā)明的酶可獲自銳頂鐮孢菌(Fusarium acuminatum)，更優(yōu)選可獲自保藏菌株 CBS 124084。所述酶的分子量介于25和35kDa之間。在pH 9下，酶的最適溫度范圍為 30°C-70°C。所述酶在50°C、至少pH 6-pH 12pH的范圍下具有最適pH。采用15分鐘反應(yīng)時(shí)間和酪蛋白作為底物來測定最適溫度和最適PH。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶能夠在洗滌劑存在下在10°C和60°C之間降解或去除蛋白質(zhì)污漬。本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶由分離的多核苷酸序列編碼，所述多核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與下述質(zhì)粒PALK2530中所包含的多核苷酸序列雜交，所述質(zhì)粒pALK2530包含核苷酸序列SEQ ID No :12，保藏于保藏號DSM 22208的大腸桿菌(E. coli)RF7803中。所述酶由分離的多核苷酸序列編碼，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID N0:18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列或與SEQ ID NO 18限定的成熟Fa_RF7182的氨基酸序列有至少81%同一性的氨基酸序列的多肽。優(yōu)選所述酶由包含核苷酸序列SEQ ID NO 17的分離核酸分子編碼。本發(fā)明的全長真菌絲氨酸蛋白酶由pALK2531中所包含的多核苷酸序列編碼，所述pALK2531保藏于保藏號DSM 22209的大腸桿菌RF7879中。真菌絲氨酸蛋白酶由重組表達(dá)載體產(chǎn)生，所述載體包含與能夠指導(dǎo)絲氨酸蛋白酶編碼基因在合適的宿主中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列有效連接的編碼本發(fā)明真菌絲氨酸蛋白酶的核酸分子。合適的宿主包括異源宿主，優(yōu)選以下的微生物宿主木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、脈孢菌屬 (Neurospora)、*艮霄屬(Rhizopus)、青霄屬(Penicillium)禾口被抱霄屬(Mortiriella)。優(yōu)選所述酶在木霉屬或曲霉屬中產(chǎn)生，最優(yōu)選在里氏木霉(T.reesei)中產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及選自以下的編碼真菌絲氨酸蛋白酶的分離核酸分子(a)編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且包含SEQ ID NO 18所述氨基酸序列的多肽的核酸分子；(b)編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且與SEQ ID NO 18的氨基酸序列有至少81%同一性的多肽的核酸分子；(c)包含SEQ ID NO 13所述核苷酸序列的編碼序列的核酸分子；(d)包含DSM 22208或DSM 22209中所包含的多核苷酸序列的編碼序列的核酸分子；(e)其編碼序列由于遺傳密碼簡并性而與(c)-(d)中任一項(xiàng)的核酸分子的編碼序列不同的核酸分子；和(f)在嚴(yán)格條件下與DSM 22208中所包含的核酸分子雜交，并編碼具有絲氨酸蛋白酶活性和與SEQ ID N0:18所述氨基酸序列顯示至少81%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述載體包含與能夠在合適的宿主中指導(dǎo)所述絲氨酸蛋白酶編碼基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列有效連接的本發(fā)明的核苷酸序列。合適的宿主包括異源宿主，優(yōu)選以下的微生物宿主木霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、金孢子菌屬、脈孢菌屬、 根霉屬、青霉屬和被孢霉屬。優(yōu)選所述酶在木霉屬或曲霉屬中產(chǎn)生，最優(yōu)選在里氏木霉中產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及包含上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選宿主細(xì)胞為微生物宿主， 例如絲狀真菌。優(yōu)選的宿主為以下宿主木霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、金孢子菌屬、脈孢菌屬、根霉屬、青霉屬和被孢霉屬。更優(yōu)選宿主是木霉屬或曲霉屬，最優(yōu)選為絲狀真菌里氏木霉。本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞和回收多肽的步驟。由本發(fā)明的核酸序列編碼的且可通過上述方法獲得的具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽亦落入本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明涉及用于獲得酶制備物的方法，所述方法包括以下步驟培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，從所述細(xì)胞中回收多肽或者由培養(yǎng)基分離細(xì)胞并得到上清液。由上述方法獲得的酶制備物亦落入本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明涉及酶制備物，其包含本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明的酶制備物還可包含含有或不含介質(zhì)(mediator)的其它酶以及合適的添加劑，所述其它酶選自蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角質(zhì)酶 (cutinase)、果膠酶或氧化酶，所述添加劑選自穩(wěn)定劑、緩沖劑、表面活性劑、漂白劑、介質(zhì)、 防腐蝕劑、助洗劑、抗再沉積劑、光學(xué)增亮劑、腐蝕劑、研磨劑、染料、顏料和防腐劑等。生產(chǎn)宿主的耗盡培養(yǎng)基可按原樣使用，或者可除去宿主細(xì)胞，和/或可將其濃縮、 過濾或分級。也可將其干燥。本發(fā)明的酶制備物可呈液體、粉末或顆粒的形式。屬于本發(fā)明范圍的還有本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶或酶制備物用于洗滌劑、用于處理纖維、用于處理羊毛、用于處理毛發(fā)、用于處理皮革、用于處理食品或飼料或者用于包括改變、降解或去除蛋白質(zhì)物質(zhì)的任何應(yīng)用的用途。具體地講，所述酶或酶制備物在液體洗滌劑和粉狀洗滌劑中用作洗滌劑添加劑。附圖簡述

圖1表示銳頂鐮孢菌RF7182 Fa prtSSA基因的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。通過SignalP V3.0程序分析的推定的信號肽用小寫字母和下劃線表示。前序列(pro sequence)和前序列的推定氨基酸用小寫字母表示。成熟核苷酸和肽序列用大寫字母表示 (N端序列由純化的野生型Fa_RF7182蛋白確定)。推定內(nèi)含子序列的位置用小寫、斜體字母表示并在核苷酸序列下用虛線標(biāo)明。終止密碼子用序列下的星號表示。得自野生型Fa_ RF7182蛋白的N端序列和肽序列用灰色背景突出顯示。圖IA表示1 prt8a基因的核苷酸序列(核苷酸1-900)、編碼Fa_RF7182蛋白的氨基酸Metl-Val278的序列區(qū)。圖IB表示1 prt8A基因的核苷酸序列(核苷酸901-1261)、編碼Fa_RF7182蛋白的氨基酸Leu279-Ala415的序列區(qū)。圖2圖示用于在里氏木霉中表達(dá)1 prt8A基因的表達(dá)盒。圖3表示用12 % SDS PAGE凝膠分析的部分純化的重組Fa_RF7182蛋白。泳道 1.部分純化的Fa_RF7182的樣品，泳道2.分子量標(biāo)記(Bench Mark Protein Ladder, Invitrogen)0
圖4A表示用15分鐘反應(yīng)時(shí)間和酪蛋白作為底物，在pH 9下測定重組蛋白Fa_ RF7182的溫度曲線圖。數(shù)據(jù)點(diǎn)是三次獨(dú)立測量的平均值。圖4B表示pH對重組Fa_RF7182蛋白活性的作用。所用緩沖液為pH 6-pH 12的 40mM Britton-Robinson緩沖液，反應(yīng)溫度為50°C。反應(yīng)時(shí)間為15分鐘，酪蛋白用作底物。 數(shù)據(jù)點(diǎn)是三次獨(dú)立測量的平均值。圖5表示在30°C、pH 9,60分鐘重組Fa_RF7182蛋白對血/牛奶/墨水污漬(Art 116，EMPA)的性能。市售制品 Savinase Ultra 16L (Novozymes A/S, DK)和 Purafect ⑧ 4000L(Genencor Inc.，USA)用于比較。AL*(deltaL*)=酶處理織物的光亮度值L*-僅緩沖液處理織物(酶空白對照)的光亮度值ΙΛ圖 6 表示在 50°C、pH 9、60分鐘？&_1^7182對血/牛奶/墨水污漬(Art. 116，EMPA) 的性能。市售制品 Savinase Ultra 16L 和 Purafect 4000L 用于比較。AL*(deltaL*) =酶處理織物的光亮度值L*-僅緩沖液處理織物(酶空白對照)的光亮度值ΙΛ圖7表示在40°C和pH 10下在粉狀洗滌劑(Art. 601,EMPA)存在時(shí)重組Fa_RF7182 對血/牛奶/墨水污漬(Art. 117，EMPA)的性能。市售制品Purafect4000L用作比較。 χ軸表示酶用量(活性/ml)，y軸表示ALldeltaL*)=酶處理織物的光亮度值L*-僅緩沖液處理織物(酶空白對照)的光亮度值ΙΛ圖8表示在40°C、約pH 7. 9、60分鐘和液體洗滌劑Ariel knsitive (不含酶)下重組蛋白Fa_RF7182對血/牛奶/墨水污漬(Art 117, EMPA)的性能。市售制品Purafect 4000L用作比較。ALldeltal；)=酶處理織物的光亮度值L*-僅緩沖液處理織物(酶空白對照)的光亮度值ΙΛ圖9表示在30°C和不同濃度的彩色織物液體基質(zhì)洗滌劑(1 iquid base detergent)下重組蛋白Fa_RF7182對血/牛奶/墨水污漬(Art 117,EMPA)的性能。市售制品 Purafect 4000L 和 Savinase Ultra 16L 用于比較。AL*(deltaL*)=酶處理織物的光亮度值L*-僅緩沖液處理織物(酶空白對照)的光亮度值ΙΛ圖9Α表示洗滌劑濃度為5g/l和pH 7. 5時(shí)的性能。圖9B表示洗滌劑濃度為5g/l時(shí)的性能(以蛋白質(zhì)的量計(jì)算酶用量)。圖9C表示洗滌劑濃度為3. 3g/l和pH 7. 4時(shí)的性能。圖9D表示洗滌劑濃度為lg/Ι和pH 7. 3時(shí)的性能。圖10表示在30°C和不同濃度的Ariel sensitive (不含酶)下重組蛋白Fa_ RF7182對血/牛奶/墨水污漬(Art 117，EMPA)的性能。市售制品Purafect 4000L和 Mvinase Ultra 16L用于比較。AL*(deltaL*)=酶處理織物的光亮度值L*-僅緩沖液處理織物(酶空白對照)的光亮度值ΙΛ圖IOA表示洗滌劑濃度為5g/l和pH 8時(shí)的性能。圖IOB表示洗滌劑濃度為5g/l時(shí)的性能(以蛋白質(zhì)的量計(jì)算酶用量)。圖IOC表示洗滌劑濃度為3. 3g/l和pH 7. 9時(shí)的性能。圖IOD表示洗滌劑濃度為lg/Ι和pH 7. 6時(shí)的性能。圖11表示在Launder Ometer試驗(yàn)中在30°C和彩色織物液體基質(zhì)洗滌劑下重組蛋白Fa_RF7182對不同污漬的性能。市售制品Savinase Ultra 16L和Purafect 4000L 用于比較。ALldeltaL*)=酶處理織物的光亮度值L*-僅緩沖液處理織物(酶空白對照)的光亮度值ΙΛ圖IlA表示對血/牛奶/墨水/PE-棉(Art. 117，EMPA)的性能。圖IlB表示對血/牛奶/墨水/棉(Art. 116，EMPA)的性能。圖IlC表示對草(Art. 164，EMPA)的性能。圖IlD表示對可可(Art. 112，EMPA)的性能。圖12表示在實(shí)物洗滌試驗(yàn)中Fa_RF7182酶制備物對8種不同蛋白酶敏感性污漬 (表 5)的總?cè)ノ坌?delta%SR)。市售制品 Savinase Ultra 16L 和 Purafect 4000L 用于比較。圖12A表示當(dāng)根據(jù)活性投放蛋白酶制備物時(shí)的總?cè)ノ坌省D12B表示當(dāng)根據(jù)蛋白質(zhì)的量投放蛋白酶制備物時(shí)的總?cè)ノ坌?。圖13表示在實(shí)物試驗(yàn)中在30°C下彩色織物液體洗滌劑基質(zhì)下的去污效果。圖13A表示對巧克力奶/顏料/棉W-03_030/CFT)的去污效果。圖1 表示對血/牛奶/墨水/棉(C-05_059b/CFT)的去污效果。圖13C表示對血/牛奶/墨水/PE-棉(C-05-014/CFT)的去污效果。圖13D表示對花生油/牛奶/棉(C-05-014/CFT)的去污效果。圖13E表示對蛋黃/顏料/棉(CS-38-010/CFT)的去污效果。圖14表示在10°C _60°C的溫度、pH 9、60分鐘重組Fa_RF7182蛋白對血/牛奶/ 墨水污漬(Art 117,EMPA)的性能。市售制品 Mvinase Ultra. 16L(Novozymes A/S，DK)、 Purafect 4000L (Genencor Inc，USA)禾口 Properase 4000E (Genencor Inc. , USA)用于比較。ALldeltaL*)=酶處理織物的光亮度值L*-僅緩沖液處理織物(酶空白對照)的光亮度值ΙΛ圖14Α表示重組蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在10°C下的性能。圖14B表示重組蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在20°C下的性能。圖14C表示重組蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在30°C下的性能。圖14D表示重組蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在40°C下的性能。圖14E表示重組蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在50°C下的性能。圖14F表示重組蛋白Fa_RF7182和市售蛋白酶制品在60°C下的性能。圖15表示在10°C和20°C以及3. 3g/l的液體基質(zhì)濃度下重組Fa_RF7182蛋白對血/ 牛奶 / 墨水污漬(Art 117, EMPA)的性能。市售制品 Savinase Ultra 16L、Purafect 4000L 和Properase 4000E用于比較。Δ L*(deltaL*)=酶處理織物的光亮度值L*-僅緩沖液處理織物(酶空白對照)的光亮度值L*。圖15A表示在10°C下的性能。圖15B表示在20°C下的性能。序列表SEQ ID NO=I得自銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的氨基端肽#3811的序列。SEQ ID NO 2得自銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段1609，880的序列。SEQ ID NO 3得自銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段1793，957的序列。
SEQ ID NO :4得自銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段743，494的序列。SEQ ID NO 5得自銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段2103，832的序列(起始 2045，06)。SEQ ID NO 6得自銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段2103，832的序列(起始 1406，57)。SEQ ID NO 7得自銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的胰蛋白酶消化肽段3662，692的序列。SEQ ID NO 8來源于肽SEQ ID NO 3的寡核苷酸引物PR0123的序列。SEQ ID NO 9來源于肽SEQ ID NO 6的寡核苷酸引物PR0122的序列。SEQ ID NO 10絲氨酸蛋白酶共有寡核苷酸引物PR060的序列。SEQ ID NO 11絲氨酸蛋白酶共有寡核苷酸引物PR061的序列。SEQ ID NO :12 使用引物 PR0123 (SEQ ID NO 8)和 PR061(SEQ ID NO :11)及銳頂鐮孢菌RF7182基因組DNA作為模板獲得的PCR片段的序列。SEQ ID NO 13全長銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶基因(Fa prtS8A)的核苷酸序列。SEQ ID NO 14包括氨基酸Metl_Ala415在內(nèi)的全長銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶 (Fa_RF7182)的推斷氨基酸序列。SEQ ID NO 15編碼銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的酶原形式的氨基酸序列的核苷酸序列。SEQ ID NO 16銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的酶原形式的氨基酸序列，包括SEQ ID NO 14限定的全長Fa_RF7182的氨基酸Ala21_Ala415。SEQ ID NO :17編碼銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列的核苷酸序列。SEQ ID NO 18銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的成熟形式的氨基酸序列，包括SEQ ID NO 14 限定的全長 Fa_RF7182 的氨基酸 Alal27_Ala415。保藏銳頂鐮孢菌RF7182 于 2009 年 1 月 28 日保藏于 Centraalbureau Voor Schimmelcultures at Uppsalalaan 8,3508 AD, Utrecht, the Netherlands,指定保藏號 CBS 124084。包含質(zhì)粒pALK2530的大腸桿菌菌株RF7803于2009年1月21日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ), Inhoffenstrasse 7b, D-38124 Braunschweig，Germany，指定保藏號 DSM 22208。包含質(zhì)粒pALK2531的大腸桿菌菌株RF7879于2009年1月21日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ), Inhoffenstrasse 7b, D-38124 Braunschweig，Germany，指定保藏號 DSM 22209。發(fā)明詳述本發(fā)明提供真菌來源的絲氨酸蛋白酶，所述蛋白酶顯示廣泛的底物特異性，在高的PH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，并具有寬廣的最適溫度，即在低溫和中等溫度兩者下的性能優(yōu)良。 對于洗滌劑應(yīng)用，該酶是理想的，耐氧化劑和螯合劑，并且在洗滌劑溶液中低酶水平有效。
11具體地講，絲氨酸蛋白酶在低至10°C的溫度下都有活性，優(yōu)選的范圍為10°C -70°C。因此， 本發(fā)明提供用于洗滌劑和其它應(yīng)用的備選絲氨酸蛋白酶。真菌絲氨酸蛋白酶可在高產(chǎn)真菌宿主中產(chǎn)生，并且易于進(jìn)行其下游加工，例如發(fā)酵液和菌絲體的分離。本發(fā)明的“絲氨酸蛋白酶”或“絲氨酸內(nèi)肽酶”或“絲氨酸內(nèi)蛋白酶”是指由國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)命名法(Nomenclature of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)歸類為EC 3.4.21的酶。絲氨酸蛋白酶存在于單細(xì)胞生物和復(fù)雜生物兩者中。根據(jù)其結(jié)構(gòu)相似性，將絲氨酸蛋白酶分成至少6大類(clan) (SA、SB、SC、SE、SF和SG ;S表示絲氨酸蛋白酶)，其被細(xì)分為具有類似氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)的家族(參見例如絲氨酸蛋白酶主頁http //www, biochem. wustl. edu/ protease/， Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University of Medicine, St. Louis, MO, USA)。這些蛋白質(zhì)水解酶或降解酶的特征在于其活性部位中存在親核絲氨酸基團(tuán)，SA大類和SB大類的蛋白酶還因具有必不可少的與絲氨酸一起形成催化三聯(lián)體的天冬氨酸和組氨酸殘基而著稱。主要的大類包括“胰凝乳蛋白酶樣”，包括胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和彈性蛋白酶 (SA大類)和“枯草桿菌蛋白酶樣”(SB大類)絲氨酸蛋白酶。所述酶根據(jù)切割部位周圍的氨基酸殘基的側(cè)鏈而靶向多肽鏈的不同區(qū)域。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶屬于SB大類。所表征的“枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶”或“亞麻酶(subtilases) ”一般是細(xì)菌來源的。由各種芽孢桿菌(像解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquifaciens)、地衣芽孢桿菌 (B. Iicheniformis)和枯草芽孢桿菌(B. subtilis) (Rao等，1998))代表的這類蛋白酶，對芳族殘基或疏水殘基(例如酪氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸)有特異性。本發(fā)明使用的術(shù)語“絲氨酸蛋白酶活性”是指對于含有蛋白質(zhì)的底物(例如酪蛋白、血紅蛋白、角蛋白和BSA)的水解活性。用于分析蛋白水解活性的方法在文獻(xiàn)中是眾所周知的，可參照例如Gupta等Q002)?？刹捎媒M別特異性抑制劑對蛋白酶進(jìn)行分類?！敖z氨酸蛋白酶抑制劑”的不同組別包括合成的化學(xué)抑制劑和天然蛋白質(zhì)抑制劑。天然抑制劑的一個(gè)組別為絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin，由serine protease inhibitor縮寫而成)，例如抗凝血酶和α -抗胰蛋白酶。人工合成的抑制劑包括3，4-二氯異香豆素(3，4-DCI)、二異丙基氟磷酸(DFP)、苯甲磺酰氟(PMSF)和甲苯磺酰基-L-賴氨酸氯甲基酮(TLCK)。一些絲氨酸蛋白酶由于活性部位附近存在的半胱氨酸殘基而被硫醇試劑(例如對氯汞苯甲酸(PCMB))抑制。因此，可在基于特異性底物切割的測定中，或者在合適條件下使用含有或不含絲氨酸蛋白酶的特異性抑制劑的任何含有蛋白質(zhì)的底物的測定中，測定絲氨酸蛋白酶活性。絲氨酸蛋白酶一般在中性或堿性pH下有活性，最適PH介于pH 7和11之間，并具有廣泛的底物特異性?！皦A性絲氨酸蛋白酶”是指在PH 9-pH 11下，甚至在pH 10-12. 5下有活性且穩(wěn)定(Shimogaki等，1991)并且等電點(diǎn)約pH 9的酶。這些代表了市售絲氨酸蛋白酶的最大亞組。堿性絲氨酸蛋白酶的分子量的范圍介于15kDa和35kDa之間。天然絲氨酸蛋白酶的最適溫度約為60°C (Rao等，1998)。可篩選能夠產(chǎn)生蛋白酶活性的微生物菌株，并且可測定對不同底物的活性?？蓪⑦x定的菌株在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在產(chǎn)生足量的引人關(guān)注的絲氨酸蛋白酶后，可分離或純化酶，并且可更充分地表征其性質(zhì)。備選地，可分離出在各種生物中編碼絲氨酸蛋白酶的基因，并可將這些基因編碼的氨基酸序列與本文實(shí)施例中分離和表征的絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列進(jìn)行比較。所產(chǎn)生的蛋白酶，特別是絲氨酸蛋白酶可用酶化學(xué)的常規(guī)方法純化，例如鹽制備 (salt pr印aration)、超濾、離子交換層析、親和層析、凝膠過濾和疏水作用層析?？赏ㄟ^蛋白質(zhì)測定、酶活性測定和通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳來監(jiān)測純化。可測定經(jīng)純化的酶在不同的溫度和PH值下的酶活性和穩(wěn)定性以及分子量和等電點(diǎn)。在實(shí)施例Ib中說明了本發(fā)明優(yōu)選的絲氨酸蛋白酶的純化。將過濾的培養(yǎng)物上清液加入Q Sepharose FF柱中。將流出流分加入苯基kpharose HP柱中，將蛋白質(zhì)用線性遞減的鹽梯度洗脫。合并顯示蛋白酶活性的流分、濃縮并加到Superdex 7510/300GL柱中。 在純化之后是如實(shí)施例Ib中所述的對試鹵靈標(biāo)記的酪蛋白的活性測定。無疑，代替或除本文所述方法以外，可采用其它已知的純化方法，來分離本發(fā)明的酶。重組絲氨酸蛋白酶按照實(shí)施例5中所述進(jìn)行純化，并用于pH和溫度曲線圖的表征?？赏ㄟ^質(zhì)譜法或者按照Laemmli (1970)在SDS-PAGE上測定純化的絲氨酸蛋白酶的分子量。還可由酶的氨基酸序列預(yù)測分子量。成熟絲氨酸蛋白酶的分子量通常介于 20-35kDa 之間，通常為約 25_30kDa(Rao 等，1998)。將絲氨酸蛋白酶合成為前酶原形式的無活性“酶原前體”或“酶原”，所述前酶原通過除去信號序列(分泌信號肽或前導(dǎo)肽(pr印印tide))和前序列(前肽(prop印tide))而被激活，得到酶的活性成熟形式(Chen和hoUye，2008)。這種活化方法包括蛋白酶的作用， 可起因于絲氨酸蛋白酶有限的自消化或自催化加工。例如，可在生產(chǎn)的翻譯后期間或在耗盡培養(yǎng)基中或者在培養(yǎng)基或酶制備物的貯存期間切割前序列。還可通過將蛋白水解酶加到宿主生物在其中培養(yǎng)的培養(yǎng)基中來實(shí)現(xiàn)酶原的活化，或者在培養(yǎng)過程之后將蛋白水解酶加入培養(yǎng)物上清液中，所述蛋白質(zhì)水解酶能夠?qū)o活性的酶原轉(zhuǎn)化成有活性的成熟酶。還可以通過例如在將編碼多肽的基因轉(zhuǎn)化至生產(chǎn)宿主中之前將其截短，來實(shí)現(xiàn)酶的縮短。術(shù)語“成熟”是指除去信號序列或前肽后包含酶活性或催化活性所必需的氨基酸的酶形式。在絲狀真菌中，它是分泌到培養(yǎng)基中的天然形式?？砂磳?shí)施例lc、5或14中所述通過使用酪蛋白作為底物在不同溫度下在合適的緩沖液中，或者通過使用文獻(xiàn)(Gupta等，200 中描述的其它底物和緩沖液系統(tǒng)，測定絲氨酸蛋白酶的最適溫度?？筛鶕?jù)對蛋白質(zhì)底物的活性，在不同PH值下在合適的緩沖液中進(jìn)行最適PH的測定。蛋白酶活性一般以可溶性底物的降解為基礎(chǔ)。在洗滌劑應(yīng)用中，蛋白酶必須對至少部分地不溶的物質(zhì)產(chǎn)生作用。因此洗滌劑蛋白酶的一個(gè)重要參數(shù)是其吸附和水解這些不溶性片段的能力。選擇洗滌劑蛋白酶的另一個(gè)重要參數(shù)是其等電點(diǎn)或pi值。當(dāng)洗滌劑蛋白酶在其中起作用的洗滌劑溶液的PH值與該酶的pi值大致相同時(shí)，洗滌劑蛋白酶發(fā)揮最佳作用。洗滌劑應(yīng)用中的PH —般是堿性的，液體洗滌劑為pH 7-9，當(dāng)使用粉狀洗滌劑時(shí)，為pH 9-10.5。通過對由聚丙烯酰胺、淀粉或瓊脂糖組成的固定化pH梯度凝膠進(jìn)行等電聚焦， 或者通過由氨基酸序列估算pl，例如通過應(yīng)用ExPASy服務(wù)器上的pI/MW工具(http:// expasy.org/tools/pi tool, html ；Gasteiger 等，2003)，來測定 pi?？砂凑諏?shí)施例2中描述的Edman降解化學(xué)法(Edman和Begg，1967)，或者通過文獻(xiàn)中描述的其它方法，對純化的蛋白酶的N端以及內(nèi)部肽進(jìn)行測序。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可來源于任何生物，包括細(xì)菌、古生菌、真菌、酵母和甚至高等真核生物，例如植物。所述酶優(yōu)選來源于真菌，包括絲狀真菌和酵母，例如來源于選自鐮孢屬的屬。由于容易進(jìn)行下游加工以產(chǎn)生不含微生物的酶或酶組合物，因此真菌堿性蛋白酶相對于細(xì)菌蛋白酶是有利的。在酶純化前，通過過濾技術(shù)可容易地除去菌絲體。本發(fā)明涉及真菌絲氨酸蛋白酶，其在具有極為不同性質(zhì)的洗滌劑存在下，在大范圍溫度即從低溫到中等溫度范圍(例如10°c -600C )內(nèi)具有良好性能。在本發(fā)明中，在本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶的這個(gè)情況下，在洗滌劑存在下的良好性能，是指所述酶在比目前出售的許多市售枯草桿菌蛋白酶低的溫度范圍內(nèi)起作用。換句話說，良好性能是指所述酶能夠在低溫到中等溫度范圍內(nèi)，但尤其在比目前市售產(chǎn)品 (例如市售酶產(chǎn)品Purafect 4000L(Genencor Inc.，USA))低的溫度范圍內(nèi)降解或去除蛋白質(zhì)污漬或物質(zhì)。本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶在低溫范圍內(nèi)起作用。例如，可通過改變pH、選擇具有合適性質(zhì)的洗滌劑(包括酶保護(hù)劑)和通過控制洗滌條件，將本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的活性保持在低至10°C的溫度下。因此，依賴于洗滌條件及洗滌劑中的輔助配合劑和添加劑的本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶特別可用于50°C以下溫度。所述酶還在45°C以下溫度、40°C以下溫度、35°C以下溫度或者30°C以下溫度下起作用。在洗滌劑存在下，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶在如上規(guī)定的10°C和60°C之間起作用。在實(shí)施例6-13中描述了比較實(shí)驗(yàn)，并且從圖7-15顯而易見的是，在不同條件下并暴露于不同的處理時(shí)，以ΔΙ/或八％51 總和測定的真菌絲氨酸蛋白酶？3_1^7182對不同紡織材料上的眾多不同污漬的性能，比市售產(chǎn)品&ivinase Ultra 16L (Novozymes A/S，DK)、 Purafect 4000L (Genencor Inc, USA)禾口 Properase 4000E (Genencor Inc.，USA)的性能好得多。具體來講，與 Savinase Ultra 16L,Properase (R) 4000E 和 Purafect 4000L 的去污效果相比，所述真菌絲氨酸蛋白酶Fa_RF7182在低溫范圍(例如10°C -40°C )下的去污效果顯著較高。從所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，可得出這樣的結(jié)論，即本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶能夠滿足洗滌劑消費(fèi)者及洗滌劑行業(yè)和洗滌機(jī)器供應(yīng)產(chǎn)業(yè)極其不同的需求，并且極好地適合未來法規(guī)和消費(fèi)者習(xí)慣的要求。按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，真菌絲氨酸蛋白酶是具有絲氨酸蛋白酶活性并包含具有SEQ ID NO 18的氨基酸序列或與氨基酸序列SEQ ID NO 18有至少81%同一性或與氨基酸序列SEQ ID N0:14有至少80%同一性的氨基酸序列的Fa_RF7182的成熟酶的多肽。 優(yōu)選的酶顯示至少81%、優(yōu)選至少83 %、更優(yōu)選至少85 %、甚至更優(yōu)選至少87 %同一性。還更優(yōu)選氨基酸序列與SEQ ID N0:18的氨基酸序列顯示至少89%或至少91%、92%、93%、 95%或97%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選99%同一性。在相應(yīng)的序列區(qū)內(nèi)(例如絲氨酸蛋白酶的全長或成熟區(qū)內(nèi))對兩種酶的同一性進(jìn)行比較。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶標(biāo)明為Fa_RF7182，一種來源于銳頂鐮孢菌的分離的絲氨酸蛋白酶，并且是SB大類絲氨酸內(nèi)蛋白酶第8家族的成員。本文的術(shù)語“同一性”是指兩個(gè)氨基酸序列在具有大致相同的氨基酸數(shù)量的相應(yīng)序列區(qū)內(nèi)相互比較的同一性。例如，可以對兩個(gè)氨基酸序列的全長序列或成熟序列的同一性進(jìn)行比較。待比較的兩個(gè)分子的氨基酸序列可在一個(gè)或多個(gè)位置上不同，然而這不會(huì)改變分子的生物功能或結(jié)構(gòu)。由于不同的宿主生物或氨基酸序列的突變，可天然發(fā)生這種變異，或者變異可通過特異性誘變獲得?？梢虬被嵝蛄兄幸粋€(gè)或多個(gè)位置的缺失、取代、插入、添加或組合而產(chǎn)生變異。通過采用ClustalW比對(例如m ebi. ac. uk/Tools/ Clustalw)來測定序列的同一性。所采用的矩陣如下:BL0SUM，空位開放:10，空位延伸 0. 5。優(yōu)選真菌絲氨酸蛋白酶可獲自鐮孢屬，更優(yōu)選可獲自銳頂鐮孢菌。按照最優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可獲自保藏在Centraalbureau voor Schimmelcultures 的保藏號CBS 124084的菌株。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是具有絲氨酸蛋白酶活性和SEQ ID NO 18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列的真菌絲氨酸蛋白酶。成熟酶沒有信號序列或前導(dǎo)肽和前序列或前肽。本發(fā)明的成熟絲氨酸蛋白酶包括SEQ ID NO :13表征的的全長蛋白酶的氨基酸Alal27-Ala415。因此，屬于本發(fā)明范圍的還有具有SEQ ID NO 13的全長Fa_RF7182酶 (包括信號序列(前導(dǎo)肽)和前肽)和成熟酶以及沒有信號序列(前導(dǎo)肽)因此具有SEQ ID NO 15的酶原形式。本發(fā)明涉及真菌絲氨酸蛋白酶，其成熟形式的分子質(zhì)量或分子量介于20kDa和 35kDa之間，優(yōu)選介于25kDa和33kDa之間，更優(yōu)選介于^kDa和30kDa之間。最優(yōu)選的MW 是通過應(yīng)用ExPASy服務(wù)器上的Compute pI/MW工具(Gasteiger等，200 得到的成熟多肽呈^kDa的Fa_RF7182的預(yù)測分子量。本發(fā)明的酶在大的溫度范圍內(nèi)有效降解蛋白質(zhì)物質(zhì)。當(dāng)按照實(shí)施例5所述，當(dāng)用 15分鐘反應(yīng)時(shí)間和酪蛋白作為底物在pH 9下測定時(shí)，酶的最適溫度為30°C-70°C (約最大活性的10% )、優(yōu)選30°C -60°C (約最大活性的30% )、更優(yōu)選介于40°C和50°C之間(至少最大活性的60% )、最優(yōu)選在50°C下(最大活性，F(xiàn)a_RF7182)。按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，按照實(shí)施例5中所述，用15分鐘反應(yīng)時(shí)間，在 50°C下，真菌絲氨酸蛋白酶在至少pH 6-pH 12的pH范圍內(nèi)具有最適pH，在pH 7下具有最大活性的至少10%。優(yōu)選酶在pH 6-pH 11的pH范圍內(nèi)具有最適pH(最大活性的至少 40%)。具體來講，當(dāng)使用酪蛋白作為底物時(shí)，按照實(shí)施例5中所述，用15分鐘反應(yīng)時(shí)間，在 50°C下，最適pH介于pH 6和pH 10之間(約最大活性的55% )，更優(yōu)選介于pH 6和pH 9 之間(最大活性的至少80% )，最優(yōu)選pH 7。本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶具有“在洗滌劑存在下的良好性能”，即在洗滌劑存在下，在低溫范圍內(nèi)，特別是在比目前市售產(chǎn)品(例如市售酶產(chǎn)品Purafect 4000L (Genencor Inc.，USA))低的溫度范圍內(nèi)，能夠降解或去除彩色織物(coloured material)上的蛋白質(zhì)污漬。在洗滌劑存在下，本發(fā)明的酶在10°C和60V之間、優(yōu)選在20V 和50°C之間、更優(yōu)選在50°C以下起作用。Fa_RF7182酶同樣在45°C以下溫度、40°C以下溫度、35°C以下溫度或者30°C以下溫度起作用。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的pi是從推斷氨基酸序列中預(yù)測出來的，介于Pl 8. 8和 Pl 9. 5，優(yōu)選介于pi 8. 9和pi 9. 3之間。本發(fā)明的Fa_RF7182酶的預(yù)測pi為pi 9.1。在分離編碼本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的cDNA或基因組基因時(shí)，用N端的氨基酸序列或經(jīng)純化的酶的胰蛋白酶消化肽段合成的寡核苷酸或通過使用上述寡核苷酸獲得的PCR
15產(chǎn)物可用作探針。還可根據(jù)已知的同源絲氨酸蛋白酶的核苷酸或氨基酸序列設(shè)計(jì)探針。也可根據(jù)含有所述酶的特異性底物的板上的活性，或者通過使用對絲氨酸蛋白酶有特異性的抗體，來篩選絲氨酸蛋白酶克隆。按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，真菌絲氨酸蛋白酶由在嚴(yán)格條件下與在質(zhì)粒 PALK2530中所包含的多核苷酸或探針序列雜交的分離的多核苷酸序列編碼，pALK2530質(zhì)粒包含核苷酸序列SEQ ID NO 12，在以保藏號DSM 22208保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)白勺 木干胃 RF7803 巾。在本發(fā)明中，按照實(shí)施例3d中所述，用采用嚴(yán)格性雜交通過PCR制備的探針分離 Fa prtSA基因。標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法可用于分離宿主生物的cDNA或基因組DNA，例如分子生物學(xué)手冊(例如Sambrook和Russell，2001)中描述的方法。與DNA探針(例如由超過100-200個(gè)核苷酸組成的SEQ ID NO 12)的雜交，常常在“高嚴(yán)格性”條件下進(jìn)行，即在低于完全雜交體的解鏈溫度(Tm)計(jì)算值20-25°C的溫度下雜交，Tm按照Bolton和McCarthy (196 計(jì)算。預(yù)雜交和雜交一般至少在65 °C下在 6xSSC(或 6xSSPE)、5xDenhardt 試劑、0. 5% (w/v) SDSUOOy g/ml 變性、斷成碎片的鮭魚精 DNA中進(jìn)行。加入50%甲酰胺降低預(yù)雜交和雜交溫度至42°C。在低鹽濃度中進(jìn)行洗滌，例如在 2xSSC-0. 5% SDS(w/v)中于室溫(RT)進(jìn)行 15 分針，接著在 2xSSC_0. 1% SDS(w/v)中于室溫下進(jìn)行，最后在0. lxSSC-0. SDS (w/v)中至少在65°C下進(jìn)行。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶由分離核酸分子編碼，所述分離核酸分子編碼包含SEQ ID NO :18中表征的氨基酸序列的多肽，或者與氨基酸序列 SEQ ID NO :18具有至少81%或與氨基酸序列SEQ ID NO :13具有至少80%同一性的多肽。 優(yōu)選的酶顯示至少81%、優(yōu)選至少83 %、更優(yōu)選至少85 %、甚至更優(yōu)選至少87 %同一性。還更優(yōu)選氨基酸序列與SEQ ID N0:18的氨基酸序列顯示至少89%、91%、93%或至少97%、 更優(yōu)選至少98 %、最優(yōu)選99 %同一性。在相應(yīng)的序列區(qū)內(nèi)對兩種酶的同一性進(jìn)行比較，例如在絲氨酸蛋白酶的成熟區(qū)或全長區(qū)內(nèi)。因此，本發(fā)明范圍內(nèi)有這樣的多肽序列，其由編碼本發(fā)明的全長絲氨酸蛋白酶 (除成熟形式的酶以外還包括前導(dǎo)肽(信號序列)和前肽)的氨基酸序列的核酸分子編碼， 且所述氨基酸序列表征于SEQ ID N0:14。同樣，本發(fā)明范圍內(nèi)有這樣的多肽序列，其由編碼本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的酶原形式(除成熟形式的酶以外還包括前肽)的核酸分子編碼，且所述氨基酸序列表征于SEQ ID NO :16。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是由分離核酸分子編碼的真菌絲氨酸蛋白酶，所述核酸分子包含編碼具有SEQ ID NO 18的Fa_RF7182絲氨酸蛋白酶的成熟形式的核苷酸序列。按照一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶由分離核酸分子編碼，所述核酸分子包含編碼Fa_RF7182酶的成熟形式(SEQ ID NO 18)的核苷酸序列SEQ ID NO: 17。因此，本發(fā)明范圍內(nèi)有這樣的多肽，其由具有包含所述酶的“編碼序列”的核苷酸序列SEQ ID NO :13的核酸分子編碼。表述“編碼序列”是指起始于翻譯起始密碼子(ATG) 和終止于翻譯終止密碼子(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。翻譯的全長多肽通常以甲硫氨酸開始，并包含內(nèi)含子區(qū)。同樣，本發(fā)明范圍內(nèi)有這樣的真菌絲氨酸蛋白酶，其由包含編碼Fa_RF7182酶原形式的核苷酸序列SEQ ID NO 15的核酸分子編碼。按照本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，真菌絲氨酸蛋白酶由保藏于保藏號DSM 22209的大腸桿菌RF7879中的pALK2531所包含的多核苷酸序列編碼。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是由包含核酸分子的重組表達(dá)載體產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶， 所述核酸分子編碼如上表征的與調(diào)節(jié)序列有效連接的真菌絲氨酸蛋白酶，所述調(diào)節(jié)序列能夠指導(dǎo)所述絲氨酸蛋白酶編碼基因的合適的宿主中表達(dá)。所述重組表達(dá)載體的構(gòu)建和所述載體的使用詳見實(shí)施例4。適于產(chǎn)生真菌絲氨酸蛋白酶的合適宿主為同源宿主或異源宿主，例如微生物宿主，包括細(xì)菌、酵母和真菌。絲狀真菌，例如木霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、金孢子菌屬、脈孢菌屬、根霉屬、青霉屬和被孢霉屬由于容易進(jìn)行下游加工和酶產(chǎn)品回收，因此是優(yōu)選的生產(chǎn)宿主。合適的宿主包括例如以下菌種里氏木霉、黑曲霉(A.niger)、米曲霉 (A. oryzae)、醬油曲霉(A. sojae)、泡盛曲霉(A. awamori)或日本曲霉(A. japonicus)類型的菌株、F. venenatum 或尖鐮孢、H. insolens 或 H. lanuginosa、粗糙脈孢菌(N. crassa) 和C. lucknowense，其中一些在例如市售酶的AMFEP 2007目錄中被列為酶生產(chǎn)宿主生物 (http://www. amfep. org/list. html)。更優(yōu)選所述酶在木霉屬或曲霉屬的絲狀真菌宿主 (例如里氏木霉，或黑曲霉、米曲霉或泡盛曲霉菌株)中產(chǎn)生。按照本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案，真菌絲氨酸蛋白酶在里氏木霉中產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及選自以下的編碼真菌絲氨酸蛋白酶的分離核酸分子(a)編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且包含SEQ ID NO 18所述氨基酸序列的多肽的核酸分子；(b)編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且與SEQ ID NO 18具有至少81%同一性的多肽的核酸分子；(c)包含SEQ ID NO 13所述核苷酸序列的編碼序列的核酸分子；(d)包含DSM 22208或DSM 22209中所包含的多核苷酸序列的編碼序列的核酸分子；(e)其編碼序列由于遺傳密碼簡并性而與(c)-(d)中任一項(xiàng)的核酸分子的編碼序列不同的核酸分子；和(f)在嚴(yán)格條件下與DSM 22208中所包含的核酸分子雜交且編碼具有絲氨酸蛋白酶活性和與SEQ ID NO :18所述氨基酸序列顯示至少81%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。本發(fā)明的核酸分子可以是RNA或DNA，其中DNA可由基因組DNA或cDNA構(gòu)成。標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法可用于編碼本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶的多核苷酸序列的分離和酶處理，包括分離基因組和質(zhì)粒DNA、消化DNA以產(chǎn)生DNA片段、測序、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等?；痉椒枋鲇跇?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)手冊，例如Sambrook和Russell，2001。編碼Fa_RF7182多肽的1 prtS8A基因的分離見實(shí)施例3。簡單地說，將通過使用簡并寡核苷酸引物PR0123(SEQ ID NO 8)和PR061(SEQ ID NO :11)的序列獲得的75!3bp PCR片段用來分離pBluescript II KS+載體中的銳頂鐮孢菌RF7182的1 prt8A基因。全長銳頂鐮孢菌1 prtS8A基因包含在質(zhì)粒pALK2531中，該質(zhì)粒保藏在DSMZ培養(yǎng)物保藏中心的保藏號DSM 22209的大腸桿菌中。對從DNA序列推斷的絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列進(jìn)行了分析。銳頂鐮孢菌絲氨酸蛋白酶1 prtSSA核苷酸序列(SEQ ID NO 13)的核苷酸序列和推斷序列(SEQ ID NO 14)見圖IA和圖1B。基因的長度為135!3bp (包括終止密碼子)。 發(fā)現(xiàn)2個(gè)推定的內(nèi)含子的長度為51bp和Mbp。推斷的蛋白質(zhì)序列由415個(gè)氨基酸組成，包括預(yù)測的20個(gè)氨基酸的信號序列(SignalP V3. 0 ；Nielsen等，1997及Nielsen和Krogh, 1998)和Ala21-ArgU6的前肽。對于成熟多肽，預(yù)測的分子量為^kDa,預(yù)測的pi為9. 1。這些預(yù)測利用ExPASy服務(wù)器上的Compute pI/MW工具(Gasteiger等，2003)作出。推斷的氨基酸序列含有2個(gè)可能的N-糖基化位點(diǎn)(Asn79和Asn258)，但是按照CBS Server NetNGlyc V 1.0，或許只有一個(gè)Asn79位的位點(diǎn)(位于前肽中)。應(yīng)用NCBI (National Center for Biotechnology Information)上的BLASTX程序2. 2. 9版檢索與已發(fā)表的蛋白酶序列的同源性(Altschul等，1990)。通過使用Clustalff比對(矩陣=BLOSUM,空位開放:10，空位延伸0. 5 (例如www. ebi. ac. uk/tools/Clustalw)，得到成熟Fa_RF7182序列與同源序列相應(yīng)成熟區(qū)的同一性值，見表3。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶Fa_RF7182與玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)(禾本科鐮孢(Fusarium graminearum))假定蛋白質(zhì)PH-I，基因座標(biāo)簽TO03315. 1 (EMBL檢索號 XP_383491，未發(fā)表)，與 Hypocrealixii (哈茨木霉(Trichoderma harzianum)) CECT 2413 絲氨酸內(nèi)肽酶(EMBL檢索號CAL25508，Suarez等，2007)以及與深綠木霉(T. atroviride) 堿性蛋白酶前體S08. 066, ALP (EMBL檢索號M87516，Geremia等，1993)顯示最高的同源性， 后者在 US 60/818, 910 (Catalyst Bioscience Inc.)中被公開為氨基酸序列 SEQ ID N0: 313。全長酶內(nèi)與玉蜀黍赤霉假定蛋白質(zhì)的同一性為79%。當(dāng)對沒有信號序列和前肽的成熟多肽進(jìn)行比對時(shí)，同一性為80%。與H. Iixii CECT M13絲氨酸內(nèi)肽酶的同一性為73% (全長酶)和79% (成熟酶)。與深綠木霉ALP的同一性為71% (全長酶)和76% (成熟酶)。因此，屬于本發(fā)明范圍的有分離多核苷酸序列或分離核酸分子，其編碼真菌絲氨酸蛋白酶或包含SEQ ID NO :18表征的Fa_RF7182酶成熟形式的氨基酸序列的多肽，SEQ ID NO 18即SEQ ID NO 14的全長絲氨酸蛋白酶的氨基酸Alal27_Ala415。此外，屬于本發(fā)明范圍的有編碼真菌絲氨酸蛋白酶多肽的片段的核酸分子，其中所述片段具有絲氨酸蛋白酶活性并與氨基酸序列SEQ ID NO :18有至少81%同一性或與氨基酸序列SEQ ID NO :14具有至少80%同一性。優(yōu)選的酶顯示至少81 %、優(yōu)選至少83%、 更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少87%同一性。還更優(yōu)選氨基酸序列與SEQ ID N0:18的氨基酸序列顯示至少89%或至少91 %、92%、93%、95%或97%、更優(yōu)選至少98%、最優(yōu)選 99%同一性。在相應(yīng)的序列區(qū)內(nèi)(例如在絲氨酸蛋白酶的成熟區(qū)或全長區(qū)內(nèi))對兩種酶的同一性進(jìn)行比較。核酸分子優(yōu)選為包含SEQ ID NO :13所述編碼序列的分子，其編碼本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶的全長形式。本發(fā)明的分離核酸分子可以是包含在DSM 22208或DSM 22209中所包含的多核苷酸序列的編碼序列的分子。DSM 22208攜帶用于克隆全長1 prtSSA基因的PCR片段的核苷酸序列(SEQ ID N0:12)。DSM 22209攜帶全長1 prtS8A基因的核苷酸序列(SEQ ID NO 13)。本發(fā)明的核酸分子還可以是上文中表征的核苷酸序列的類似物?！昂啿⑿浴笔侵负塑账嵝蛄械念愃莆?，其在一個(gè)或多個(gè)核苷酸或密碼子上不同，但仍編碼本發(fā)明的重組蛋白酶。核酸分子還可以是在嚴(yán)格條件下與在質(zhì)粒PALK2530中所包含的PCR探針雜交的核酸分子，其并且編碼具有絲氨酸蛋白酶活性和在相應(yīng)序列區(qū)中與SEQ ID N0:18所述氨基酸序列顯示至少81%同一性的氨基酸序列的多肽，所述質(zhì)粒保藏于保藏號DSM 22208的大腸桿菌中。雜交DNA可來源于屬于菌種鐮孢屬的真菌，或者可來源于其它真菌菌種。因此，屬于本發(fā)明范圍的有包含SEQ ID N0:12、SEQ ID NO 13、SEQ ID N0:15或 SEQ ID NO :17中所述核苷酸序列及其類似物的分離核酸分子。本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體或重組表達(dá)構(gòu)建體，其可用來在合適的原核或真核宿主中增殖或表達(dá)編碼選定的絲氨酸蛋白酶的核酸序列基因。重組表達(dá)載體包含有利于或指導(dǎo)絲氨酸蛋白酶編碼序列在合適的宿主中表達(dá)和分泌的DNA或核酸序列，例如與編碼所述絲氨酸蛋白酶的多核苷酸序列有效連接的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子(包括轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號)及信號序列。表達(dá)載體還可包含用于選擇轉(zhuǎn)化體菌株的標(biāo)記基因，或者可將另一個(gè)載體構(gòu)建體中的選擇標(biāo)記通過共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主中。所述調(diào)節(jié)序列可與生產(chǎn)生物同源或異源，或者可來源于從中分離出編碼絲氨酸蛋白酶的基因的生物。用于在絲狀真菌宿主中表達(dá)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的啟動(dòng)子的實(shí)例是米曲霉 TAKA淀粉酶、堿性蛋白酶ALP和丙糖磷酸異構(gòu)酶、Rhizopus miehei脂肪酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、Chrysosporium lucknowense纖維二糖水解酶1啟動(dòng)子、里氏木霉纖維二糖水解酶I (Cel7A)的啟動(dòng)子等。酵母中，可以使用例如釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、半乳糖激酶(GALl)、醇脫氫酶 (ADH2)和3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子以提供表達(dá)。指導(dǎo)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶在細(xì)菌宿主中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列的實(shí)例是大腸桿菌Iac操縱子的啟動(dòng)子、天藍(lán)色鏈霉菌(Sti^ptomyces coelicolor)瓊脂糖酶dagA啟動(dòng)子、地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis) α-淀粉酶基因(amyL)啟動(dòng)子、嗜熱脂肪芽孢桿菌 (B. stearothermophiIus)麥芽淀粉酶基因(maltogenic amylase gene) (amyM)啟動(dòng)子、枯草芽孢桿菌(B. sublitis)xylA和xylB基因啟動(dòng)子等。合適的終止子包括上述基因的終止子或任何其它已表征的終止子序列。合適的轉(zhuǎn)化或選擇標(biāo)記包括彌補(bǔ)宿主缺陷的標(biāo)記，例如來自枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)或地衣芽孢桿菌的dal基因或曲霉amdS和niaD。還可根據(jù)賦予以下抗生素抗性的標(biāo)記進(jìn)行選擇例如青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、腐草霉素或潮霉素抗性。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的胞外分泌是優(yōu)選的。因此，重組載體包含促進(jìn)在選定的宿主中分泌的序列。本發(fā)明絲氨酸蛋白酶的信號序列或前序列或前導(dǎo)肽可包含在重組表達(dá)載體中，或者可用另一個(gè)能夠促進(jìn)在選擇的宿主中分泌的信號序列代替天然信號序列。因此，所選擇的信號序列可與表達(dá)宿主同源或異源。合適信號序列的實(shí)例是真菌或酵母生物的信號序列，例如本領(lǐng)域眾所周知的表達(dá)良好的基因的信號序列。
重組載體還可包含有利于載體整合到宿主染色體DNA中以獲得穩(wěn)定表達(dá)的序列。如實(shí)施例4中所述，本發(fā)明的Fa_RF7182蛋白酶用得自里氏木霉cbhl(cel7A)啟動(dòng)子的其自有信號序列表達(dá)。用于轉(zhuǎn)化里氏木霉宿主的表達(dá)構(gòu)建體還包括cbhl終止子和用于從未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)化體的amdS標(biāo)記。本發(fā)明還涉及包含上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。用于產(chǎn)生真菌絲氨酸蛋白酶的合適宿主是同源宿主或異源宿主，例如微生物宿主，包括細(xì)菌、酵母和真菌。植物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的生產(chǎn)系統(tǒng)也是可能的。絲狀真菌，如木霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、金孢子菌屬、脈孢菌屬、根霉屬、 青霉屬和被孢霉屬，由于容易進(jìn)行下游加工和酶產(chǎn)品回收，因此是優(yōu)選的生產(chǎn)宿主。合適的表達(dá)和生產(chǎn)宿主系統(tǒng)為例如開發(fā)用于絲狀真菌宿主里氏木霉(EP 244234)的生產(chǎn)系統(tǒng)； 或曲霉屬生產(chǎn)系統(tǒng)，例如米曲霉或黑曲霉(W0 9708325、US 5，843，745、US 5，770，418)、泡盛曲霉、醬油曲霉和日本曲霉型菌株；或者開發(fā)用于鐮孢屬，例如尖鐮孢(Malardier等， 1989)或F. venenatum以及用于粗糙脈孢菌、米黑根霉(lihizopus miehei)、高山被孢霉屬 (Mortiriella alpinis)、綿毛腐質(zhì)霉(H. lanuginosa)或特異腐質(zhì)霉(H. insolens)或用于 Chrysosporium lucknowensee (US 6，573，086)的生產(chǎn)系統(tǒng)。開發(fā)用于酵母的合適的生產(chǎn)系統(tǒng)是開發(fā)用于酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的系統(tǒng)。開發(fā)用于細(xì)菌的合適的生產(chǎn)系統(tǒng)是開發(fā)用于芽孢桿菌屬(例如用于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens))、用于大腸桿菌或用于放線菌鏈霉菌屬(actinomycete Streptomyces)的生產(chǎn)系統(tǒng)。優(yōu)選本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶在木霉屬或曲霉屬的絲狀真菌宿主中產(chǎn)生，例如里氏木霉或者黑曲霉、 米曲霉、醬油曲霉、泡盛曲霉或日本曲霉型菌株。按照本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案，真菌絲氨酸蛋白酶在里氏木霉中產(chǎn)生。生產(chǎn)宿主細(xì)胞可與本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶同源或異源。宿主可由于通過滅活或除去一種或多種宿主蛋白酶(例如通過缺失編碼這類同種(homogenous)或同源 (homologous)蛋白酶的基因而除去蛋白酶，因此不含同種蛋白酶。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括使攜帶用于本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的重組表達(dá)載體的天然宿主細(xì)胞或重組宿主細(xì)胞在合適條件下培養(yǎng)以及任選分離所述酶的步驟。生產(chǎn)培養(yǎng)基可以是適于宿主生物生長并含有用于有效表達(dá)的誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基。從文獻(xiàn)中來看，合適的培養(yǎng)基是眾所周知的。本發(fā)明涉及具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽，所述多肽由本發(fā)明的核酸分子編碼， 其可通過上述方法獲得。優(yōu)選多肽是通過培養(yǎng)攜帶用于本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞而獲得的重組蛋白酶。本發(fā)明還涉及用于獲得包含具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的酶制備物的方法，所述方法包括培養(yǎng)攜帶本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，并從所述細(xì)胞中回收多肽或者從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞并得到具有絲氨酸蛋白酶活性的上清液的步驟。本發(fā)明還涉及包含上文表征的絲氨酸蛋白酶的酶制備物。所述酶制備物或組合物具有絲氨酸蛋白酶活性，并可通過本發(fā)明的方法獲得。屬于本發(fā)明的有下述酶制備物，其包含本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶，優(yōu)選通過培養(yǎng)攜帶本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞而獲得的重組絲氨酸蛋白酶。
除本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶以外，所述酶制備物還可包含含有或不含介質(zhì)的不同類型的酶，例如另一種蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、角質(zhì)酶、果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和/或氧化酶，例如漆酶或過氧化物酶。預(yù)期這些酶通過除去存在于待處理材料上的碳水化合物和油或脂肪而增強(qiáng)本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶的性能。所述酶可以是由宿主菌株產(chǎn)生的天然酶或重組酶，或者在生產(chǎn)過程后將所述酶加入培養(yǎng)物上清液中。所述酶制備物還可包含選自以下的合適添加劑表面活性劑、緩沖劑、防腐蝕劑、 穩(wěn)定劑、漂白劑、介質(zhì)、助洗劑、腐蝕劑、研磨劑、光學(xué)增亮劑、抗再沉積劑、染料、顏料和防腐劑等。表面活性劑可用于乳化油脂和濕潤表面。表面活性劑可以是非離子表面活性劑 (包括半極性)和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子表面活性劑?？蓪⒕彌_劑加入酶制備物中以調(diào)節(jié)pH，或者影響其它成分的性能或穩(wěn)定性。合適的穩(wěn)定劑包括多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物、肽等。漂白劑用來氧化和降解有機(jī)化合物。合適化學(xué)漂白系統(tǒng)的實(shí)例是H2O2源，例如含有或不含過酸形成漂白活化劑(peracid-forming bleach activator)(例如四乙酰基乙二胺)的過硼酸鹽或過碳酸鹽，或者備選的過氧酸，例如酰胺、酰亞胺或砜類型。化學(xué)氧化劑可通過使用氧化酶(例如漆酶或過氧化物酶)而被部分或完全代替。許多漆酶在不存在介質(zhì)時(shí)無法有效地起作用。助洗劑或絡(luò)合劑包括沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽等物質(zhì)。酶制備物還可包含一種或多種聚合物，例如羧甲基纖維素、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等。同樣，可加入軟化劑、腐蝕劑、防止其它成分腐敗的防腐劑、研磨劑和改進(jìn)發(fā)泡和粘性性質(zhì)的物質(zhì)。按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述酶制備物呈液體、粉末或顆粒的形式。像其它蛋白酶、特別是堿性蛋白酶一樣，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶可用于洗滌劑、蛋白質(zhì)、釀造、肉、攝影、皮革、乳品和制藥業(yè)(Kalisz, 1988, Rao等，1998)。例如，它可用作將纖維狀蛋白質(zhì)廢料(例如角、羽毛、指甲和毛發(fā))轉(zhuǎn)化為成有用的生物質(zhì)、蛋白質(zhì)濃縮物或氨基酸的化學(xué)試劑的備選物(Anwar和Mleemuddin，1998)。像其它酶一樣，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶的使用可證實(shí)在改進(jìn)皮革品質(zhì)和減少環(huán)境污染及節(jié)約能源方面是成功的，像堿性蛋白酶一樣，它可用于D，L-氨基酸的混合物的拆分。與廣譜抗生素組合治療燒傷和創(chuàng)傷的枯草桿菌蛋白酶是在制藥業(yè)中使用絲氨酸蛋白酶的一個(gè)實(shí)例，因此，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶還可用于這類應(yīng)用，并且像堿性蛋白酶一樣，還可用于除去手術(shù)設(shè)備上的血液，和清洗隱形眼鏡或假牙。像來源于冠狀耳霉(Conidiobolus coronatus)的堿性蛋白酶一樣，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶可用來替換動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中的胰蛋白酶。本發(fā)明的蛋白酶還可用于清洗膜和破壞生物膜。在烘焙中，例如使用蛋白酶破壞面筋網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生水分保持極低的無彈性面團(tuán)。在其它食品應(yīng)用中，使用蛋白酶水解食品蛋白質(zhì)，其目的在于例如使蛋白質(zhì)溶解、提煉(從動(dòng)物骨中提取更多蛋白質(zhì))、產(chǎn)生新的氣味、減少苦味、改變?nèi)榛再|(zhì)、產(chǎn)生生物活性肽和降低蛋白質(zhì)的變應(yīng)原性、處理酵母或牛奶。底物包括動(dòng)物蛋白、植物蛋白和微生物蛋白。洗滌劑行業(yè)，特別是洗衣洗滌劑行業(yè)，已作為在高的pH范圍內(nèi)有活性的蛋白酶的單一主要消費(fèi)者出現(xiàn)(Anwar和Saleemuddin，1998)。理想的洗滌劑蛋白酶應(yīng)具有廣泛的底物特異性以有利于除去由食品、草、血和其它機(jī)體分泌物所造成的各種污漬。它必須在洗滌劑溶液的PH和離子強(qiáng)度、洗滌溫度和PH下具有活性，并經(jīng)得住機(jī)械處理以及耐受添加至洗滌劑中的螯合劑和氧化劑。蛋白酶的Pl必須接近洗滌劑溶液的PH。由于現(xiàn)今的能源危機(jī)和節(jié)能的意識，因此目前需要在較低溫度下使用蛋白酶。本發(fā)明還涉及絲氨酸蛋白酶或酶制備物用于洗滌劑、處理織物纖維、用于處理羊毛、用于處理毛發(fā)、用于處理皮革、用于處理飼料或食品或用于包括改變、降解或除去蛋白質(zhì)物質(zhì)的任何應(yīng)用的用途。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案使用上文表征的絲氨酸蛋白酶作為用于洗衣洗滌劑和餐具洗滌組合物(包括自動(dòng)餐具洗滌組合物)的洗滌劑添加劑。表述“洗滌劑”用來指預(yù)期幫助清潔或具有清潔性質(zhì)的物質(zhì)或材料。術(shù)語“去垢力” 表示清潔性質(zhì)的存在情況或程度?？蓽y試對與固體水不溶性載體(例如織物纖維或玻璃) 結(jié)合的不同的蛋白質(zhì)材料或含蛋白質(zhì)底物材料或污漬或污漬混合物的清潔性質(zhì)的程度。典型的蛋白質(zhì)物質(zhì)包括血、牛奶、墨水、蛋、草和調(diào)味汁。對于測試目的，蛋白質(zhì)污漬的混合物是市售可獲得的。洗滌劑酶的功能是降解和除去含有蛋白質(zhì)的污漬。測試結(jié)果取決于污漬的類型、洗滌劑的組成和用于洗滌試驗(yàn)中的織物的性質(zhì)和狀況(MaUrer，2004)。蛋白酶性能或洗滌性能通常測量為“去污效率”或“去污效果”或“清洗性能的程度”，是指受污染材料(例如在人為污染的污樣或試驗(yàn)布料中)的可見的和可測量的光亮度的增加或顏色的改變。例如，可利用實(shí)施例6-10中描述的LW色空間坐標(biāo)系，用分光光度計(jì)測定顏色作為反射值，來測定光亮度或色值的改變。表示蛋白酶性能(去污效率)的蛋白質(zhì)污漬的褪色或去除例如計(jì)算為ΔΙΛ其是指酶處理織物的光亮度值L*減去用不含酶的緩沖液或洗滌液(酶空白對照或?qū)φ?處理的織物的光亮度值ΙΛ洗滌劑的存在可改進(jìn)酶去除污漬的性能。本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶在中性和堿性ρΗ條件下，甚至在具有不同組成的洗滌劑的存在下降解各種蛋白質(zhì)污漬(如實(shí)施例6-13所示)。如實(shí)施例6所示，與市售蛋白酶制品&ivinase Ultra 16L和Purafect 4000L 相比，在50°C下，尤其在30°C下，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶在ρΗ 9緩沖液和防腐劑中更好地去除血/牛奶/墨水標(biāo)準(zhǔn)污漬(圖5和圖6)。酶制備物按活性單位投放。按照實(shí)施例12 中所述，還在10°C -60°C的整個(gè)溫度范圍內(nèi)測試了對血/牛奶/墨水污漬的去污效果。與市售蛋白酶制品 Savinase Ultra 16L、Properase 4000E 和 Purafect4000L 相比， Fa_RF7182蛋白酶制備物尤其在低的洗滌溫度下、在10°C _40°C的范圍內(nèi)顯示更高的去污能力(圖14)。如實(shí)施例7中所述，還在40°C、pH 10下測試了粉狀洗滌劑中Fa_RF7182蛋白酶的性能。還測定了在含有磷酸鹽的參比洗滌劑存在時(shí)酶在去除聚酯-棉材料上的血/牛奶/ 墨水標(biāo)準(zhǔn)污漬(Art. 117，EMPA)方面的能力。各種酶制備物按活性單位(ymol酪氨酸/分鐘)投放。如圖7所示，本發(fā)明的蛋白酶還適用于極堿性條件下的粉狀洗滌劑。在40°C下， Fa_RF7182酶的性能類似于商用蛋白酶Purafect: 4000L的性能。如實(shí)施例8所示，F(xiàn)a_RF7182蛋白酶還在不含酶的液體洗滌劑Ariel Sensitive (Procter & Gamble，UK)存在下除去聚酯-棉材料上的血/牛奶/墨水標(biāo)準(zhǔn)污漬(Art. 117，EMPA)。酶按活性單位(μ mol酪氨酸/分鐘/體積)投放。4_8個(gè)單位的市售酶制備物/ml液體的用量等于約0. 2-0. 5%酶制備物/洗滌劑重量的用量，這是洗滌劑酶的通常使用水平。Fa_RF7182在液體洗滌劑條件下顯示優(yōu)良性能(圖8)，而且與市售制品 &ivinase Ultra 14L和Rirafect 4000L相比，受污染材料光亮度的增加顯著較高。當(dāng)在30°C下使用不同液體洗滌劑濃度(實(shí)施例9，圖9A-D和10A-D)測試Fa_ RF7182酶的性能時(shí)，觀察到類似結(jié)果。與市售制品Purafect 4000L和&ivinase Ultra 14L相比，當(dāng)投放等量的活性時(shí)，對于兩種洗滌劑和在所有洗滌劑濃度下，F(xiàn)a_RF7182對血/ 牛奶/墨水污漬的效率顯著較高。同樣，如果用量以所加入的蛋白質(zhì)的量計(jì)算(圖9B和圖 10B)，則用Fa_RF7182的去污效率最高。按實(shí)施例13中所述，還在更低的溫度下用3. 3g/ 1的液體洗滌劑濃度進(jìn)行了洗滌。在10°c和20°C下，F(xiàn)a_RF7182制備物顯示優(yōu)于市售制品 Savinase Ultra 14L、Purafect 4000L 和 Properase 4000E 的優(yōu)良性能(圖 15)。除對棉或聚酯棉織物上的血/牛奶/墨水污漬以外，當(dāng)在30°C下液體洗滌劑中測試時(shí)，F(xiàn)a_RF7182絲氨酸蛋白酶有效去除例如草(Art. 164，EMPA)和可可(Art. 112，EMPA) 等其它污漬。在ATLAS LP-2 Launder-Ometer中進(jìn)行處理。結(jié)果(圖11)顯示，F(xiàn)a_RF7182 在低溫(如30°C )下有效地去除不同的污漬。在液體基質(zhì)洗滌劑存在下，在30°C下，在洗衣機(jī)中對在里氏木霉中產(chǎn)生的重組 Fa_RF7182酶制備物的性能進(jìn)行了實(shí)物測試(實(shí)施例11)，并與市售制品Mvinase Ultra 16L和Purafect 4000L進(jìn)行了比較。用于測試副作用的8種不同蛋白酶敏感性示蹤劑 (tracer)見表5，處理?xiàng)l件見表6。用于測試試驗(yàn)的酶用量既以酶活性又以酶蛋白的量計(jì)算。圖12和圖13提供的對于不同污漬的結(jié)果表明，F(xiàn)a_RF7182蛋白酶比市售酶制品更有效。Fa_RF7182對血/牛奶/墨水、巧克力/牛奶、花生油/牛奶和蛋黃最有效(圖13)。正如從圖5-11所觀察的一樣，測試材料的光亮度L*在本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶的存在下顯著增加。與競爭產(chǎn)品相比，使用Fa_RF7182酶制備物，用相似的酶活性用量獲得更好的光亮度，或者換句話說，與競爭產(chǎn)品相比，用較低的酶活性用量獲得相似光亮度。同樣在實(shí)物試驗(yàn)中，在30°C下，使用液體洗滌劑和選擇的蛋白酶敏感性示蹤劑，對 Fa_RF7182蛋白酶進(jìn)行了測試(實(shí)施例11)。在這些測試中，當(dāng)?shù)鞍酌敢曰钚粤客斗艜r(shí)，根據(jù)用8種不同的蛋白酶敏感性污漬(污漬1-8，表幻得到的結(jié)果總和，與市售蛋白酶制品 Purafect 4000L和Savinase Ultra 16L相比，用Fa_RF7182的總體去污效果顯著較高(圖12A)。Fa_RF7182尤其對血/牛奶/墨水、巧克力/牛奶、花生油/牛奶和蛋黃有效 (圖 13A-E)。按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的真菌絲氨酸蛋白酶可用于實(shí)施例6-11所示的液體洗滌劑和粉狀洗滌劑?？蓪⒈景l(fā)明的酶或酶制備物配制成用于手工或機(jī)器洗衣店，或者可配制用于家居硬表面清潔，或優(yōu)選用于手工或機(jī)器餐具洗滌操作。實(shí)施例1.銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的產(chǎn)生和純化(a)銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的培養(yǎng)從土壤樣品分離出最初稱為TUB F-2008的真菌菌株作為在堿性(pH 8. 5)瓊脂糖平板上生長的絲狀真菌。按照包含在瓊脂平板中的酪蛋白和血紅蛋白的水解，該菌株產(chǎn)生蛋白酶活性。因?yàn)槠桨迮囵B(yǎng)在8-10°C下進(jìn)行，因此該結(jié)果表明，TUB F-2008產(chǎn)生在寒冷溫度下起作用的蛋白酶。TUB F-2008被鑒定為銳頂鐮孢菌Ellis & Everh(由IdentificationServices, Centralbureau Voor Schimmelcultures, P. 0. Box 85167,3508AD Utrecht,The Netherlands的Arthur de Cock鑒定)，并被重新命名為RF7182。使銳頂鐮孢菌RF7182在馬鈴薯葡萄糖(PD)瓊脂(Difco)上于+4°C生長、維持和形成孢子。對于酶產(chǎn)生，把RF7182 斜面的孢子接種到含有以下的培養(yǎng)基中30g/l玉米粉(細(xì)磨)、5g/l玉米漿粉、4g/l大豆粉(脫脂)、2g/l KH2P04、lg/l NaCl和lg/1石蠟油。滅菌前用NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至 8. 5，將培養(yǎng)基于121°C高壓滅菌30分鐘。將50ml體積的微生物在振蕩器QOOrpm)上于培養(yǎng)7天。當(dāng)在不同pH值(pH 7-10)下進(jìn)行活性測量時(shí)(按照實(shí)施例lc、5或14)，耗盡培養(yǎng)物上清液顯示含有堿性蛋白酶活性。因?yàn)檫@種堿性活性，所以選擇RF7182菌株為推定的蛋白酶基因供體菌株。(b)銳頂鐮孢菌RF7182培養(yǎng)基的蛋白酶的純化通過在+4°C下以50000g離心30分鐘，從耗盡培養(yǎng)基中除去細(xì)胞和固體(Sorvall RC6 plus)。將50ml上清液用于蛋白酶的純化。離心后，加入HCl調(diào)節(jié)上清液的pH至8. O。 然后使上清液過濾通過0. 44 μ m過濾器(MILLEX HV Millipore)，并加入在20mM Tris-HCl， pH 8中平衡的5mL Q Sepharose FF柱(GE Healthcare)中。收集流出流分，通過加入HCl 將其PH降至7. 5。將固體硫酸銨加入流出流分中，得到IM的最終鹽濃度。然后將流出流分過濾通過0. 44μ m過濾器后，加入在20mM Tris-HCl-IM硫酸銨(pH 7. 5)中平衡的苯基 Sepharose HP(5mL)柱(GE Healthcare) 0蛋白質(zhì)用線性遞減的硫酸銨梯度(I-OM)洗脫。 收集5ml流分，按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)，分析在pH 8. O下對試鹵靈標(biāo)記的酪蛋白(Boehringer Mannheim Biochemica)的蛋白酶活性。合并具有蛋白酶活性的流分，用IOk膜(Amicon)超濾。將濃縮濾液加入用 20mM Tris-HCl-200mM NaCl (pH 7. 5)平衡的 Superdex 7510/300GL 柱(GEHealthcare)中。蛋白質(zhì)用相同的緩沖液洗脫，并收集0. 5ml流分。分析這些流分的蛋白酶活性。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對具有蛋白酶活性的流分進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，流分含有分子量約為^kDa的一個(gè)主要蛋白質(zhì)條帶。合并所選擇的流分。將合并的流分用于肽的制備(實(shí)施例幻。這種經(jīng)純化的銳頂鐮孢菌RF7182 蛋白酶稱為Fa_RF7182。(c)蛋白酶活性測定使用酪蛋白作為底物，通過酪蛋白i^olin-Ciocalteau方法，測定了蛋白酶活性。 通過分光光度監(jiān)測的酸溶性片段隨時(shí)間而變的釋放，測定了由蛋白酶引起的酪蛋白降解率。用于該測定的酪蛋白底物如下制備將6g酪蛋白Hammerstein Grade MP Biomedicals, LLC(101289)溶于 500ml IOOmM Tris、20yM CaCl2、7yM MgCl2、25yM NaHCO3 中。用 HCl 調(diào)節(jié)底物溶液的pH至9. O。用TCA溶液終止酶反應(yīng)，TCA溶液在蒸餾水中含有0. IlM TCA、 0. 22M乙酸鈉、0. 33M乙酸、0. 5Na2C03。通過用蒸餾水將25ml 2N Folin-Ciocalteu苯酚試劑(SIGMA,F 9252)稀釋成100ml，來制備用于測定的Folin試劑。通過首先將2. 5ml底物溶液在指定溫度下保溫5分鐘開始反應(yīng)，之后加入0. 5ml酶溶液，進(jìn)行反應(yīng)15分鐘或30分鐘。在15分鐘或30分鐘反應(yīng)后，加入2. 5ml反應(yīng)終止溶液，將內(nèi)容物混合后，在室溫下靜置30分鐘。將管以4000rpm離心10分鐘(Hettich Rotanta 460)。吸取Iml清澈的上清液，與2. 5ml 0. 5M Na2CO3和0. 5ml稀釋的Folin試劑混合。等待5分鐘后(顯色)，以酶空白對照為背景于660nm測定混合物的吸光度(顏色)。酶空白對照如下制備將0. 5ml酶溶液與2. 5ml終止溶液和2. 5ml底物混合，將混合物在指定溫度下溫育15分鐘或30分鐘。1單位的酶活性定義為釋放出相當(dāng)于1 μ g酪氨酸/ml (或g)反應(yīng)混合物/分鐘的酸溶性蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的酶量。實(shí)施例2.純化的銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶的N端和內(nèi)部氨基酸測序?yàn)榱藴y定內(nèi)部序列，從聚丙烯酰胺凝膠上切下考馬斯亮藍(lán)染色條帶，并基本上按 Sievchenko等(1996)的描述進(jìn)行“凝膠內(nèi)(in-gel)”消化。蛋白質(zhì)用二硫蘇糖醇還原，并用碘乙酰胺烷基化后，用胰蛋白酶(Sequencing Grade Modified Trypsin(測序級改性胰蛋白酶)，V5111，Promega)消化。除對于肽預(yù)濃縮使用150 μ m χ 1.0mm 捕獲柱(3μπι，12 A, #222403，SGE Ltd UK)之外，基本上如先前所述(Poutanen等，2001)，使用與Ultimate nano液相色譜儀 (LC-Packings, The Netherlands) 3Q-TOF Χ^ (Micromass, Manchester, UK) ,/fe^ 電噴霧電離四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜用于從頭測序。對于N端序列分析，通過電印跡將SDS-P AGE/分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯 (ProBlott ；Perkin Elmer Applied Biosystems Division,Foster City,Calif.)上。用
考馬斯亮藍(lán)染色后，取出目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶，并在ftx)Cise 494A蛋白質(zhì)序列分析儀(Perkin Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, Calif.)上通過 Edman 降角軍進(jìn)行 N 端序列分析。從純化的Fa_RF7182蛋白酶測定的N端和內(nèi)部肽序列見表1。肽序列顯示與已發(fā)表的來自EMBL保藏號XP_383491的玉蜀黍赤霉(禾本科鐮孢)的假定蛋白酶序列同源。根據(jù)序列比較，所有所得到的肽序列都位于成熟Fa_RF7182蛋白的N端附近。表1.由銳頂鐮孢菌RF7182蛋白酶Fa_RF7182測定的N端和內(nèi)部肽序列。
權(quán)利要求
1.一種真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶具有絲氨酸蛋白酶活性，并且包含SEQ ID NO :18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列或與SEQ ID NO :18限定的成熟Fa_RF7182 酶的氨基酸序列有至少81%同一性的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶可獲自銳頂鐮孢菌。
3.權(quán)利要求1或2的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶具有絲氨酸蛋白酶活性，并且包含氨基酸序列SEQ ID NO :18ο
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶的成熟形式的分子量介于20kDa和35kDa之間。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在pH9下用15分鐘反應(yīng)時(shí)間和酪蛋白作為底物的最適溫度為30°C -70°C。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在50°C下用15分鐘反應(yīng)時(shí)間和酪蛋白作為底物的最適PH為至少pH 6-pH 12的pH范圍。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在洗滌劑存在下在 10°C和60°C之間能夠降解和去除蛋白質(zhì)污漬。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由分離的多核苷酸序列編碼，所述多核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與質(zhì)粒PALK2530中所包含的多核苷酸序列雜交，所述質(zhì)粒包含核苷酸序列SEQ ID NO: 12、保藏于保藏號DSM 22208的大腸桿菌RF7803 中。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由分離的多核苷酸序列編碼，所述多核苷酸序列編碼包含SEQ ID N0:18限定的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列或與SEQ ID NO 18限定的成熟Fa_RF7182的氨基酸序列有至少81%同一性的氨基酸序列的多肽。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由分離的核酸分子編碼，所述核酸分子編碼包含SEQ ID NO :18中表征的氨基酸序列的多肽。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由包含核苷酸序列SEQ ID NO 17的分離核酸分子編碼。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由PALK2531中所包含的多核苷酸序列編碼，所述PALK2531保藏于保藏號DSM 22209的大腸桿菌RF7879中。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶由重組表達(dá)載體產(chǎn)生，所述載體包含與能夠指導(dǎo)絲氨酸蛋白酶編碼基因在合適的宿主中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列有效連接的編碼權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶的核酸分子。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在異源宿主中產(chǎn)生。
15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在微生物宿主中產(chǎn)生。
16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在以下宿主中產(chǎn)生木霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、金孢子菌屬、脈孢菌屬、根霉屬、青霉屬和被孢霉屬。
17.權(quán)利要求16的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在木霉屬或曲霉屬中產(chǎn)生。
18.權(quán)利要求17的真菌絲氨酸蛋白酶，其特征在于所述酶在里氏木霉中產(chǎn)生。
19.一種選自以下的編碼真菌絲氨酸蛋白酶的分離核酸分子(a)編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且包含SEQID NO :18所述氨基酸序列的多肽的核酸分子；(b)編碼具有絲氨酸蛋白酶活性且與SEQID NO: 18的氨基酸序列有至少81%同一性的多肽的核酸分子；(c)包含SEQID NO 13所述核苷酸序列的編碼序列的核酸分子；(d)包含DSM22208或DSM 22209中所包含的多核苷酸序列的編碼序列的核酸分子；(e)其編碼序列由于遺傳密碼簡并性而與(c)-(d)中任一項(xiàng)的核酸分子的編碼序列不同的核酸分子；和(f)在嚴(yán)格條件下與DSM22208中所包含的核酸分子雜交，并編碼具有絲氨酸蛋白酶活性和與SEQ ID N0:18所述氨基酸序列顯示至少81%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子。
20.一種重組表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求19的核苷酸序列，所述核苷酸序列與能夠在合適的宿主中指導(dǎo)所述絲氨酸蛋白酶編碼基因的調(diào)節(jié)序列有效連接。
21.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求20的重組表達(dá)載體。
22.權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主是微生物宿主。
23.權(quán)利要求21或22的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主是絲狀真菌。
24.權(quán)利要求21-23中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主是木霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、金孢子菌屬、脈孢菌屬、根霉屬、青霉屬和被孢霉屬的宿主。
25.權(quán)利要求M的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主是木霉屬或曲霉屬。
26.權(quán)利要求25的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主是里氏木霉。
27.—種產(chǎn)生具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求 21-26中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞并回收所述多肽的步驟。
28.一種具有絲氨酸蛋白酶活性的多肽，其由權(quán)利要求19的核酸序列編碼，并可通過權(quán)利要求27的方法獲得。
29.一種用于獲得酶制備物的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求21-26中任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞以及從所述細(xì)胞中回收多肽或由培養(yǎng)基分離細(xì)胞并得到上清液的步驟。
30.一種可通過權(quán)利要求四的方法獲得的酶制備物。
31.一種酶制備物，其包含權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的絲氨酸蛋白酶。
32.權(quán)利要求30或31的酶制備物，其特征在于所述制備物包含選自以下含有或不含介質(zhì)的其它酶蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂肪酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、角質(zhì)酶、果膠酶或氧化酶。
33.權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)的酶制備物，其特征在于所述制備物包含選自以下的合適添加劑穩(wěn)定劑、緩沖劑、表面活性劑、助洗劑、漂白劑、介質(zhì)、防腐蝕劑、抗再沉積劑、腐蝕齊U、研磨劑、光學(xué)增亮劑、染料、顏料和防腐劑。
34.權(quán)利要求30-33中任一項(xiàng)的酶制備物，其特征在于所述酶制備物呈液體、粉末或顆粒的形式。
35.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的絲氨酸蛋白酶或權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的酶制備物用于洗滌劑、用于處理纖維、用于處理羊毛、用于處理毛發(fā)、用于處理皮革、用于處理食品或飼料或者用于包括改變、降解或去除蛋白質(zhì)物質(zhì)的任何應(yīng)用的用途。
36.權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的絲氨酸蛋白酶或權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的酶制備物作為洗滌劑添加劑的用途。
37.權(quán)利要求36的用途，所述用途用于液體洗滌劑。
38.權(quán)利要求36的用途，所述用途用于粉狀洗滌劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及真菌絲氨酸蛋白酶，其包含具有SEQ ID NO18的氨基酸序列的成熟Fa_RF7182酶的氨基酸序列。絲氨酸蛋白酶可獲自銳頂鐮孢菌，更優(yōu)選獲自保藏菌株CBS 124084。本發(fā)明還公開了編碼所述蛋白酶的核酸序列，例如包含核苷酸序列SEQ ID NO12、保藏于保藏號DSM 22208的大腸桿菌RF7803中的質(zhì)粒pALK2530和包含全長基因SEQ ID NO13、保藏于保藏號DSM 22209的大腸桿菌RF7879中的質(zhì)粒pALK2531；以及真菌宿主，例如木霉屬。所述蛋白酶可用作應(yīng)用于洗滌劑組合物和用于處理纖維、用于處理羊毛、用于處理毛發(fā)、用于處理皮革、用于處理食品或飼料，或者用于包括改變、降解或去除蛋白質(zhì)物質(zhì)的任何應(yīng)用的酶制備物。
文檔編號C12N15/80GK102597240SQ201080030242
公開日2012年7月18日 申請日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者G·斯扎卡斯, J·卡利奧, J·維馬安佩拉, K·瓊圖南, L·瓦爾塔卡里, M·帕洛海莫, P·奧賈帕洛, S·馬吉南 申請人:生化酶股份有限公司