專利名稱：Toll樣受體3拮抗劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及Toll樣受體3(TLR;3)抗體拮抗劑、編碼TLR3抗體拮抗劑或其片段的多核苷酸，以及制造和使用它們的方法。
背景技術：
Toll樣受體(TLR)調控天然免疫反應的活化并通過響應細菌、病毒、寄生和(在一些情況下)宿主衍生配體而引發(fā)信號轉導級聯(lián)反應來影響適應性免疫的發(fā)展(Lancaster 等人，J. Physiol. 563 :945-955,2005) 質膜定位的 TLR(TLR1、TLR2、TLR4 和 TLR6)能識別包括細菌和真菌的蛋白或類脂組分在內的配體。主要為胞內的TLR(TLR3、TLR7和TLR9)分別對dsRNA、ssRNA和未甲基化CpG DNA作出反應。TLR信號轉導的調節(jié)異常據(jù)認為會造成許多問題，正在為此開發(fā)治療策略(Hoffman等人，Nat. Rev. Drug Discov. 4 =879-880, 2005 ； Rezaei, Int.Immunopharmaco1. 6 :863-869,2006 ；ffickelgren, Science 312 184-187,
2006)。例如，正在臨床開發(fā)分別針對嚴重膿血癥和狼瘡的TLR4及TLR7和9的拮抗劑 (Kanzler 等人，Nat. Med. 13 :552-559, 2007)。TLR3信號轉導被在發(fā)炎或病毒感染期間由壞死細胞釋放的dsRNA、mRNA或RNA活化。TLR3活化誘導干擾素和促炎性細胞因子的分泌，并在某些微生物感染期間觸發(fā)具有保護作用的免疫細胞活化和細胞募集。例如，已將顯性負TLR3等位基因與兒童期HSV-I初次感染時對單純皰疹性腦炎的敏感性增加相關聯(lián)(Zheng等人，Science 317 :1522-1527
2007)。在小鼠中，TLR3缺乏與柯薩奇病毒攻擊時降低的存活率有關(Richer等人，PLoS One 4 :e4127，2009)。但是，已證明未受控制的或異常調節(jié)的TLR3信號轉導造成某些病毒感染模型中的發(fā)病和死亡，所述病毒包括西尼羅病毒、白蛉病毒、牛痘和甲型流感病毒 (Wang 等人，Nat. Med. 10 1366-1373，2004 ；Gowen 等人，J. Immunol. 177 :6301-6307,2006 ； Hutchens 等人，J. Immunol. 180 :483-491，2008 ；Le Goffic 等人，PloS Pathog. 2 :E53， 2006)。已確定了人和鼠TLR3胞外結構域的晶體結構(Bell等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)，102 10976-80，2005 ；Choe 等人，Science 309 :581-585, 2005 ；Liu 等人，Science, 320 :379-381,2008)。TLR3呈現(xiàn)由聚糖裝飾的螺形馬蹄(solenoid horseshoe)的總體形狀，具有23個由富亮氨酸重復(LRR)基序組成的串聯(lián)單元。dsRNA結合位點已被定位到兩個不同的區(qū)域(Liu等人，Science，320 :379-81, 2008)。已提出信號轉導組件是由IfdsRNA 和兩個 TLR3 胞外結構域組成(Leonard 等人，Proc. Natl. Acad. Natl. Acad. Sci. (USA) 105 258-263,2008)。已證實TLR3能驅動多種炎性疾病、免疫介導疾病和自身免疫疾病中的致病機制， 這些疾病例如敗血性休克(Cavassani等人，J. Exp. Med. 205 3609-2621，2008)、急性肺損傷(Murray 等人，Am. J. Respir. Crit. Care Med. 178 :1227_1237，2008)、類風濕性關節(jié)炎 (Kim 等人，Immunol. Lett. 124 :9-17,2009 ；Brentano 等人，Arth. Rheum. 52 :2656-2665, 2005)、哮喘(Sugiura 等人，Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 40 :654-662,2009 ；Morishima 等人，Int. Arch. Allergy Immunol. 145 :163—174，2008 ；Stowell 等人，Respir. Res. 10 :43， 2009)、炎性腸病例如克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎(Zhou等人，J. Immunol. 178 =4548-4556, 2007 ；Zhou 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 104 :7512-7515,2007)、自體免疫性肝臟疾病 (Lang 等人，J. Clin. Invest. 116 :2456-2463,2006)和 I 型糖尿病(Dogusan 等人，Diabetes 57 :1236-1245,2008 ；Lien 和 Zipris, Curr. Mol. Med. 9 :52-68,2009)。此外，已證實 TLR3 表達的器官特異性增加與多種由調節(jié)異常的局部炎性反應驅動的病理狀況相關，如原發(fā)性膽汁性肝硬化中的肝臟組織(Takii等人，Lab Invest. 85 =908-920,2005)、類風濕性關節(jié)炎的關節(jié)(Ospelt等人，Arthritis Rheum. 58 =3684-3692,2008)和過敏性鼻炎患者的鼻黏膜(Fransson 等人，Respir Res. 6 :100,2005)。在壞死狀態(tài)下，包括內源性mRNA在內的胞內內含物的釋放觸發(fā)細胞因子、趨化因子和其他因子的分泌，這些細胞因子、趨化因子和其他因子會誘導局部炎癥、有利于死亡細胞殘留部分的清除和修復損傷的。壞死常常使炎性過程延長，引起慢性或嚴重炎癥 (Bergsbaken等人，Nature Reviews7 :99_109，2009)。TLR3在壞死部位的活化會促成這些異常的炎性過程并通過釋放的TLR3配體產生進一步的促炎正反饋環(huán)路。從而，TLR3拮抗在涉及慢性或嚴重炎癥和/或壞死的多種疾病中可能是有益的。對TLR3活化的下調也可代表腫瘤學適應征的新治療策略，所述腫瘤學適應征包括腎細胞癌和頭頸鱗狀細胞癌(Morikawa等人，Clin. Cancer Res. 13 :5703-5709,2007 ； Pries等人，Int. J. Mol. Med. 21 =209-215, 2008) 此外，已將編碼活性降低的蛋白質的 TLR3l423F等位基因與對晚期“干性”年齡相關性黃斑變性的防護相關聯(lián)(Yang等人，N. Engl. J. Med. 359 :1456-1463,2008)，這表明TLR3拮抗劑在這種疾病中可能是有益的。與炎性病癥及其他病癥有關的病變，例如與感染有關的那些病變，具有明顯的健康和經濟影響。然而，盡管在醫(yī)學的許多領域有進步，但相比之下可用于許多這些病癥的治療選擇和治療方法很少。從而，存在著抑制TLR3活性來治療TLR3相關病癥的需求。


圖1示出了抗人TLR3(huTLR3)單克隆抗體在NF-κ B報道基因測定中的影響。圖2Α和2Β示出了抗人TLR3單克隆抗體在BEAS-2B測定中的影響(抑制百分數(shù))。圖3Α和;3Β示出了抗人TLR3單克隆抗體在NHBE測定中的影響。圖4示出了抗人TLR3單克隆抗體在PBMC測定中的影響。圖5Α和5Β示出了抗人TLR3單克隆抗體在HASM測定中的影響。圖6Α、6Β和6C示出了抗人TLR3單克隆抗體與TLR3突變體的結合。圖7Α示出了疊合在人TLR3E⑶的結構上的針對單克隆抗體15EVQ的表位(黑色) 和針對C1068單克隆抗體的表位(灰色)(上圖)以及針對單克隆抗體12QVQ/QSV的表位 (黑色，下圖)。圖7Β示出了與單克隆抗體15EVQ復合的TLR3ECD蛋白的局部化H/D交換攝動圖。圖8Α和8Β示出了大鼠/小鼠抗小鼠TLR3單克隆抗體(替代抗體 (surrogate))在A)NF-κ B測定和B) ISRE報道基因測定中的影響。圖9示出了替代單克隆抗體(單克隆抗體、單克隆抗體C1811)在MEFCXCL10/IP-10測定中的影響。圖10示出了替代單克隆抗體與TLR3的結合的特異性。上分圖同種型對照物；下分圖單克隆抗體C1811。圖11示出了替代單克隆抗體對AHR模型中的penH水平的影響。圖12示出了替代單克隆抗體對AHR模型中的支氣管肺泡灌洗液(BAL fluid)中的總嗜中性粒細胞數(shù)目的影響。圖13示出了替代單克隆抗體對AHR模型中的支氣管肺泡灌洗液中的CXCLlO/ IP- ο水平的影響。圖14示出了替代單克隆抗體對DSS模型中的組織病理學評分的影響。圖15示出了替代單克隆抗體對T細胞轉移模型中的A)組織病理學評分和B)嗜中性粒細胞流入的影響。圖16示出了替代單克隆抗體對CIA模型中的臨床評分的影響。圖17示出了替代單克隆抗體對CIA模型中的臨床AUC評分的影響。圖18示出了替代單克隆抗體對C57BL/6小鼠在鼻內施予甲型流感/PR/8/34后的存活的影響。單克隆抗體在-ι天開始給予。圖19示出了替代單克隆抗體對施予甲型流感/PR/8/34后的臨床評分的影響。單克隆抗體在-1天開始給予。圖20示出了替代單克隆抗體對施予甲型流感/PR/8/34后14天的體重的影響。單克隆抗體在-1天開始給予。圖21示出了替代單克隆抗體對(A)WT DIO動物和(B)TLRIO DIO動物在葡萄糖攻擊(challenge)后的血液葡萄糖水平的影響。圖22示出了替代單克隆抗體對WT DIO動物中的胰島素水平的影響。圖23示出了單克隆抗體15EVQ對NHBE細胞中的(A)NTHi水平和⑶鼻病毒誘導的 CXCL10/IP-10 和 CCL5/RANTES 水平的影響。圖M示出了單克隆抗體15EVQ對HUVEC細胞中的(A) sICAM_l水平和⑶存活力的影響。圖25示出了動物在甲型流感感染3天后施用替代單克隆抗體之后的存活率。圖沈示出了在甲型流感感染3天后施用替代單克隆抗體之后的臨床評分。圖27示出了動物在甲型流感感染3天后施用替代單克隆抗體之后的體重變化。圖 28 在 A 中示出了 huTLR3ECD 與 Fab 12QVQ/QSV、Fab 15EVQ 和 Fab cl068 的四元復合物的分子結構，以條帶(ribbon)和表面(surface)顯示方法表示。TLR3ECD為淺灰色，N末端以N標示；所有的Fab分子顯示為暗灰色，以條帶表示。B.表位標為淺灰色，并如A中的Fab那樣標示在TLR3ECD上。在圖觀、四和30中，為了清楚起見，將Fab 12QVQ/ QSV, Fabcl068 和 Fab 15EVQ 在標注中分別縮寫為 Fabl2、Fab 1068 和 Fabl5。圖29示出了 Fab 15EVQ的中和機制。A.示出了 dsRNA:TLR3信號轉導單元(SU)， 其中Fab 15EVQ表位在兩個TLR3E⑶(淺灰色和暗灰色，且標為TLR!3)中的一個中突出顯示 (淺灰色)。dsRNA配體顯示為淺灰色的雙螺旋。B.示出了 Fab 15EVQ結合，該結合在空間上抑制dsRNA結合，從而抑制SU的形成。具有更高親和力的Fab 15EVQ的結合將防止SU 形成或者將解開預形成的SU。
圖30示出了 Fab 12QVQ/QSV和Fab cl068的機制以及TLR3信號轉導單元(SU)的簇集。A. Fab 12QVQ/QSV和Fab cl068可結合(或者共結合)單一 SU。B.兩個SU在約76 個堿基對的dsRNA上的最接近簇集的模型。為清楚起見，三個表位在不同的分子中突出顯示。C. Fab 12QVQ/QSV和Fabcl068的結合能防止SU簇集，這是因為抗體和鄰近的SU之間的空間沖突所致。兩個指向左邊的箭頭定量表示由于抗體所致的SU分隔的不同程度(底部箭頭指Fab 12QVQ/QSV，上部箭頭指Fab cl068)。圖31示出了示例性抗體的連續(xù)編號、Kabat編號和Chothia編號之間的對應關系。 ⑶R和HV以灰色突出顯示。圖32示出了單克隆抗體15EVQ的VL與人Vkl構架區(qū)的比對。Chothia超可變環(huán)區(qū)以下劃線表示，互補位殘基(paratope residue)以雙下劃線表示，構架區(qū)差異以灰色突出顯示。VkI基因是等位基因，除非另外指明。殘基編號是連續(xù)的。圖33示出了單克隆抗體15EVQ的VH與人Vh5構架區(qū)的比對。序列特征如在圖32 中所標示。圖34示出了單克隆抗體12QVQ/QSV的VL與人Vk3構架區(qū)的比對。序列特征如在圖32中所標示。圖35示出了單克隆抗體15EVQ或單克隆抗體12QVQ/QSV的VL和VH與人J κ構架區(qū)、JX構架區(qū)或Jh構架區(qū)的比對。序列特征如在圖32中所標示。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個方面是分離的抗體或其片段，其中該抗體結合SEQ ID Ν0:2的toll 樣受體 3 (TLR3)氨基酸殘基 K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、 R489、A491、K493、N515、N516、N517、H539、N541、S571、L595 和 K619。本發(fā)明的另一個方面是分離的抗體或其片段，其中該抗體結合SEQ ID NO :2的 toll 樣受體 3(TLR3)氨基酸殘基 S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、 T166、Q167、V168、S188、E189、D192、A195 和 A219。本發(fā)明的另一個方面是具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的分離的抗體或其片段，其中該抗體以重鏈可變區(qū) Chothia 殘基 W33、F50、D52、D54、Y56、N58、P61、E95、Y97、YlOO 和 DlOOb 和輕鏈可變區(qū) Chothia 殘基 Q27、Y32、N92、T93、L94 和 S95 結合具有 SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列的TLR3。本發(fā)明的另一個方面是具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的分離的抗體或其片段，其中該抗體以重鏈可變區(qū) Chothia 殘基 N31a、Q52、R52b、S53、K54、Y56、Y97、P98、F99 和 YlOO 和輕鏈可變區(qū) Chothia 殘基 G29、S30、Y31、Y32、E50、D51、Y91、D92 和 D93 結合具有 SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的TLR3。本發(fā)明的另一方面是一種與TLR3反應的分離的抗體，其中該抗體具有以下特性的至少一種a.以< IOnM 的 Kd 結合人 TLR3 ；b.在1 μ g/ml下，在體外聚(I:C)NF-kB報道基因測定中降低人TLR3生物活性> 50% ；c.在 10 μ g/ml 下，抑制用 < 100ng/ml 聚(I: C)刺激的 BEAS-2B 細胞的 IL-6 或CXCL10/IP-10 產量的> 60% ；d.在 0. 4 μ g/ml 下，抑制用 < 100ng/ml 聚(I: C)刺激的 BEAS-2B 細胞的 IL-6 或 CXCL10/IP-10 產量的> 50% ；e.在5μ g/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE細胞的IL-6產量的> 50% ；f.在1 μ g/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE細胞的IL-6產量的> 50% ；g.在1μ g/ml下，抑制PBMC細胞的由聚(I:C)誘導的IFN-Y、IL-6或IL-12產量的> 20% ；h.在體外NF-kB報道基因測定中以IC50 < 10 μ g/ml抑制食蟹猴TLR3生物活性； 或者i.在體外ISRE報道基因測定中以IC50 < 5 μ g/ml抑制食蟹猴TLR3生物活性。本發(fā)明的另一方面是一種與TLR3反應的分離的抗體，其與這樣的單克隆抗體競爭TLR3結合，其中該單克隆抗體包含某些重鏈互補決定區(qū)(OTR) 1、2和3的氨基酸序列、某些輕鏈CDR 1、2和3的氨基酸序列、某些重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列或某些輕鏈可變區(qū) (VL)的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個方面是一種同時包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的與TLR3反應的分離的抗體，其中該抗體包含某些重鏈互補決定區(qū)(CDR) 1、2和3的氨基酸序列和某些輕鏈 ⑶R 1、2和3的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個方面是一種同時包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的與TLR3反應的分離的抗體，其中該抗體包含某些重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列和某些輕鏈可變區(qū)(VL) 的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個方面是一種同時包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的與TLR3反應的分離的抗體，其中該抗體包含某些重鏈的氨基酸序列和某些輕鏈的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是一種分離的抗體重鏈，其包含SEQ ID NO :6、8、10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、128、129、159、198、200、
202、164、212、213、214、215或216所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是一種分離的抗體輕鏈，其包含SEQ ID NO :5、7、9、11、13、15、 17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210、211 或
225所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是一種分離的抗體重鏈，其包含SEQ ID NO :102、130、131、132、 133、134、135、160、204、206、208、220、166 或 168 所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是一種分離的抗體輕鏈，其包含SEQ ID NO :155、156、157、158、
203、205、207、165、167或227所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是一種編碼抗體重鏈的分離多核苷酸，該抗體重鏈包含SEQ ID NO :6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、124、125、126、127、 128、129、159、198、200、202、164、212、213、214、215 或 216 所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是一種編碼抗體輕鏈的分離多核苷酸，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO :5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、122、123、197、199、201、163、209、210、211或225所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是一種編碼抗體重鏈的分離多核苷酸，該抗體重鏈包含SEQ ID NO :102、130、131、132、133、134、135、160、204、206、208、220、166 或 168 所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是一種編碼抗體輕鏈的分離多核苷酸，該抗體輕鏈包含SEQ ID NO :155、156、157、158、203、205、207、165、167 或 227 所示的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面是一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的分離的抗體和藥用載體。本發(fā)明的另一方面是一種載體，其包含至少一種本發(fā)明的多核苷酸。本發(fā)明的另一方面是一種宿主細胞，其包含本發(fā)明的載體。本發(fā)明的另一方面是一種制造與TLR3反應的抗體的方法，其包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞并回收由宿主細胞產生的抗體。本發(fā)明的另一方面是一種治療或預防炎性病癥的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的分離的抗體施用給需要其的患者一段足以治療或預防該炎性病癥的時間。本發(fā)明的另一個方面是一種治療或預防全身炎性病癥的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的分離的抗體施用給需要其的患者一段足以治療或預防該全身炎性病癥的時間。本發(fā)明的另一方面是一種治療II型糖尿病的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的分離的抗體施用給需要其的患者一段足以治療II型糖尿病的時間。本發(fā)明的另一方面是一種治療高血糖癥的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的分離的抗體施用給需要其的患者一段足以治療高血糖癥的時間。本發(fā)明的另一方面是一種治療高胰島素血癥的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的分離的抗體施用給需要其的患者一段足以治療胰島素抗性的時間。本發(fā)明的另一方面是一種治療或預防病毒感染的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的分離的抗體施用給需要其的患者一段足以治療或預防病毒感染的時間。
具體實施例方式本說明書中所引用的所有出版物(包括但不限于專利和專利申請)均以引用方式并入本文，如同在本文中完整給出。本文所用的術語“拮抗劑”意指一種分子，其通過任何機制部分或完全抑制另一分子(例如受體或胞內介體)的作用。如本文所用，“TRL3抗體拮抗劑”或“與TLR3反應的”抗體描述了一種抗體，其能夠直接或間接顯著抵消、減少或抑制TLR3生物活性或TLR3受體活化。例如，與TLR3反應的抗體能直接結合TLR3并中和TLR3活性，即阻斷TLR3信號轉導以減少細胞因子和趨化因子釋放或者NF-κ B活化。本文所用的術語“抗體”在廣義上表示并包括免疫球蛋白或抗體分子(包括多克隆抗體)、單克隆抗體(包括鼠、人、人適應、人源化和嵌合單克隆抗體和抗體片段)。通常，抗體是顯示出對特定抗原的結合特異性的蛋白或肽鏈。完整抗體是由兩條相同輕鏈和兩條相同重鏈構成的異四聚化糖蛋白。通常，各條輕鏈通過一個共價二硫鍵連接到重鏈，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈之間二硫鍵的數(shù)量不同。各條重鏈和輕鏈還具有規(guī)則間隔的鏈內二硫橋鍵。各條重鏈在一個末端具有可變結構域(可變區(qū))(VH)，后面跟著多個恒定結構域(恒定區(qū))。各條輕鏈在一端具有可變域(VL)和在其另一端具有恒定域；輕鏈的恒定域與重鏈的第一恒定域對齊，并且輕鏈可變域與重鏈的可變域對齊。任何脊椎動物物種的抗體輕鏈可以基于其恒定域的氨基酸序列被指定為兩種明顯不同類型之一， 艮P κ和λ。免疫球蛋白可以根據(jù)重鏈恒定域氨基酸序列被指定為五種主要種類，即IgA、IgD、 IgE、IgG 和 IgM。IgA 和 IgG 進一步再被分為同種型 IgA1. IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 和 Ig(i4。術語“抗體片段”意指完整抗體的一部分，通常是完整抗體的抗原結合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab，、F(ab，)2和Fv片段、雙抗體、單鏈抗體分子和由至少兩個完整抗體形成的多特異性抗體。免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)由一個“構架”區(qū)和間夾的三個“抗原結合位點”組成?？乖Y合位點用如下不同的術語定義(i)術語互補決定區(qū)(CDR)基于序列變異性(Wu和Kabat, J. Exp. Med. 132 =211-250,1970)。通常，抗原結合位點具有六個CDR ； 三個在 VH(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，三個在 VL (LCDR1、LCDR2、LCDR； ) (Kabat 等人，kquences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,Md. , 1991) (ii)術語“超可變區(qū)”、“HVR”、“HV”指抗體可變結構域的在結構上超可變的區(qū)域，如Chothia和Lesk所定義(Chothia和Lesk，Mol. Biol. 196 :901-917,1987)。通常，抗原結合位點具有六個高變區(qū)，三個在VH中(H1、H2、H3)， 三個在VL中(L1、L2、L3。)Chothia和Lesk將結構保守的HV稱為“正則結構”。(iii)由 Lefranc 提出的“IMGT-CDR，，(Lefranc 等人，Dev. Comparat. Immunol. 27 :55-77,2003)是基于T細胞受體與免疫球蛋白的V域的比較。國際免疫遺傳學(IMGT)數(shù)據(jù)庫(http://WWW_ imgt_org)提供了這些區(qū)域的標準化編號和定義。CDR、HV和IMGT描繪(delineation)之間的對應性在 Lefranc 等人的 Dev. Comparat. Immunol. 27 :55-77, 2003 中描述。(iv)抗原結合位點還可基于特異性決定殘基用法(Specificity Determining Residue Usage, SDRU) (Almagro，Mol.Recognit. 17 :132-143，2004)來描繪，其中特異性決定殘基(SDR)是指免疫球蛋白的直接參與抗原接觸的氨基酸殘基。SDRU是不同類型的抗原的SDR的數(shù)目和分布的精確度量，由對抗原-抗體復合物的晶體結構的分析來限定。(ν)抗原結合位點還可定義為從抗原-抗體復合物的晶體結構鑒定的抗體互補位殘基。本文所用的術語“復合序列”指這樣的抗原結合位點，其被定義為包括所有分別由 Kabat、Chothia或IMGT描繪的氨基酸殘基，或者任何其他合適的抗原結合位點描繪。本文所用的“Chothia 殘基”是根據(jù) Al-Lazikani (Al-Lazikani 等人，J. Mol. Biol. 273 =927-48,1997)編號的抗體VL和VH殘基。兩種最常用的編號系統(tǒng)Kabat (Kabat 等人，Sequences of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, NIH, Bethesda, MD, 1991)和 Chothia (Chothia 和 Lesk，Mol. Biol. 196 :901-17,1987)之間相對于連續(xù)多肽編號的對應性在圖31中針對本發(fā)明的示例性抗體進行了顯示。“構架”或“構架序列”是可變區(qū)的除了被定義為抗原結合位點的那些序列之外的其余序列。構架通常分成四個區(qū)域FR1、FR2、FR3和FR3，它們形成每個可變區(qū)中的三個抗原結合位點的骨架。因為抗原結合位可以由上面所述的各種術語定義，所以構架的精確氨基酸序列取決于如何定義抗原結合位點。本文所用的“輕鏈可變區(qū)κ 1(Vk 1)構架”或“VK 1”指具有由人Vk 1功能基因或它們的等位基因中的任何一個所編碼的氨基酸序列的構架。示例性的功能性人Vkl 基因是 IGKV1-5*01、IGKV1-6*01、IGKV1_8*01、IGKV1_9*01、IGKV1_12*01、IGKV1_13*02、 IGKV1-16*0U IGKV1-17*0U IGKV1-27*0U IGKV1-33*0U IGKV1-37*0U IGKV1-39*01, IGKV1D-8*0UIGKV1D-12*0UIGKV1D-13*0UIGKV1D-16*0UIGKV1D-17*0UIGKV1D-33*0U IGKV1D-37*01、IGKV1D_39*01、IGKV1D_42*01 或 IGKV1D_43*01。免疫球蛋白基因的命名是公知的。本文所用的“輕鏈可變區(qū)λ3(νλ3)構架”或“νλ3”指具有由人νλ3功能基因或它們的等位基因中的任何一個所編碼的氨基酸序列的構架。示例性的功能性人νλ 3基因是 IGLV3-1*01、IGLV3-9*01、IGLV3_10*01、IGLV3_12*01、IGLV3_16*01、IGLV3_19*01、 IGLV3-21*01、IGLV3-22*01、IGLV3_25*01、IGLV3_27*01和 IGLV3_32*01。本文所用的“重鏈可變區(qū)Vh5構架”或“Vh5”指具有由人Vh5功能基因或它們的等位基因中的任何一個所編碼的氨基酸序列的構架。示例性的功能性人Vh5基因是 IGHV5-51*01 和 IGHV5-1*01。本文所用的“重鏈可變區(qū)Vh6構架”或“Vh6”指具有由人Vh6功能基因或它們的等位基因中的任何一個所編碼的氨基酸序列的構架。示例性的功能性人Vh6基因是 IGHV6-1*01。本文所用的“輕鏈k J區(qū)(JK)構架”或“JK ”指具有由人JK功能基因或它們的等位基因中的任何一個所編碼的氨基酸序列的構架。示例性的功能性人Vk基因是IGKJ1、 IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4 和 IGKJ5。本文所用的“輕鏈λ J區(qū)(JX )構架”或“JX ”指具有由人JX功能基因或它們的等位基因中的任何一個所編碼的氨基酸序列的構架。示例性的功能性人JX基因是IGLJ1、 IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6 和 IGLJ7。本文所用的“重鏈J區(qū)(Jh)構架”或“Jh”指具有由人Jh功能基因或它們的等位基因中的任何一個所編碼的氨基酸序列的構架。示例性的功能性人Jh基因是IGHJ1、IGHJ2、 IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5 禾口 IGHJ6。本文所用的“種系基因”或“抗體種系基因”是由未經歷過成熟過程的非淋巴樣細胞所編碼的免疫球蛋白序列，該成熟過程會導致遺傳重排和突變以表達特定免疫球蛋白。本文所用的“骨架”指由人種系基因所編碼的輕鏈或重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。因此，骨架同時涵蓋構架和抗原結合位點。本文所用的術語“抗原”意指任何具有直接或間接產生抗體的能力的分子。蛋白編碼核酸包括在“抗原”的定義內。術語“同源物”意指與參考序列具有40%至100%序列同一性的蛋白質序列。人 TLR3的同源物包括來自與已知的人TLR3序列具有40%至100%序列同一性的其他物種的多肽。兩條肽鏈之間的同一性百分數(shù)可通過使用Vector NTI v. 9. 0. 0 (Invitrogen, Carlsbad, CA)的AlignX模塊的默認設置值進行成雙比對來確定。所謂“TLR3”是指人 TLR3 (huTLR3)及其同源物。全長huTLR3的核苷酸序列和氨基酸序列分別以SEQ ID NO=I 和2示出。huTLR3胞外結構域(EOT)的核苷酸和氨基酸序列分別以SEQ ID No :3和4示出ο本文所用的術語“基本相同”意指相比較的兩個抗體或抗體片段氨基酸序列是相
12同的或具有“非實質差異”。非實質差異是抗體或抗體片段氨基酸序列中有1、2、3、4、5或 6個氨基酸的置換。與本文所公開的序列基本相同的氨基酸序列也是本申請的一部分。在一些實施例中，序列同一性可以是約90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%, 99%或更高。同一性百分比可以如上所述來確定。相比較的示例性肽鏈是重鏈或輕鏈可變區(qū)。本文所用的術語“與...結合”意指所描述的各試劑可以在混合物中一起、作為各單一試劑同時地或作為各單一試劑以任何順序連續(xù)地施予到動物。本文所用的術語“炎性病癥”意指部分地由細胞因子、趨化因子或炎性細胞(例如嗜中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞)的活性所介導的對細胞損傷的局部化反應，在大多數(shù)情況下其特征在于疼痛、發(fā)紅、腫脹和組織功能喪失。本文所用的術語“炎性肺部病癥”意指影響肺或與肺有關的炎性病癥。本文所用的術語“單克隆抗體”(mAb)是指從基本上同種的抗體的群體所獲得的抗體(或抗體片段)。單克隆抗體具有高度特異性，其通常針對單一抗原決定簇。修飾語“單克隆”表示抗體的基本上同種的性質，并不要求用任何特定方法產生抗體。例如，鼠單克隆抗體可以由Kohler等人的雜交瘤方法(Nature 256 :495-497,1975)來制造?？梢杂妹绹鴮＠鸑o. 4，816，567中所公開的方法制備這樣的嵌合單克隆抗體，其包含衍生自供體抗體(通常為鼠動物)的輕鏈和重鏈可變區(qū)和與之相結合的衍生自受體抗體(通常為另一種哺乳類物種，如人類)的輕鏈和重鏈恒定區(qū)?？梢酝ㄟ^本領域技術人員已知的技術(例如美國專利No. 5，225，539所公開的技術)來制備這樣的人適應單克隆抗體，其具有衍生自非人供體免疫球蛋白(通常是鼠)的CDR和其分子的衍生自一種或多種人免疫球蛋白的剩余免疫球蛋白衍生部分?？捎糜谌诉m應的人構架序列可以由本領域技術人員從相關數(shù)據(jù)庫選擇。任選地，可以通過諸如 Queen 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) ,86 :10029-10032,1989)禾口 Hodgson等人(Bi0/Techn0l0gy，9 =421,1991)所公開的技術，通過摻入改變了的構架支持殘基來進一步修飾人適應單克隆抗體以保持親合力。缺乏任何非人序列的完全人單克隆抗體，可通過例如Lonberg等人，Nature 368 856-859，1994 ；Fishwild 等人，Nature Biotechnology 14 :845-851,1996 ；和 Mendez 等人，Nature Genetics 15 146-156，1997中提到的技術從人免疫球蛋白轉基因小鼠制備。 人單克隆抗體也可通過例如Knappik等人，J. Mol. Biol. 296 =57-86, 2000和Krebs等人， J. Immunol. Meth. 254 :67-84 2001中提到的技術從噬菌體展示文庫制備和優(yōu)化。抗體的片段例如Fab、F(ab' ) 2、Fd和dAb片段可通過抗體的切割或者通過重組工程來產生。例如， Fab和F(ab’)2片段可通過用酶如胃蛋白酶處理抗體來產生。本文所用的術語“表位”意指抗體特異性結合的抗原部分。表位通常由諸如氨基酸或多糖側鏈的部分(moiety)的化學活性(例如，極性、非極性或疏水性)表面定群 (grouping)構成，并可以具有特異性三維結構特征以及特異性電荷特征。表位可以是本質上線性的，或者可以是不連續(xù)的表位，例如構象表位，其是通過抗原的非鄰近氨基酸之間的空間關系形成，而非通過線性系列的氨基酸的空間關系形成。構象表位包括由抗原的折疊產生的表位，其中抗原線性序列的不同部分的氨基酸在三維空間中緊鄰。本文所用的術語“互補位”指抗體的為抗原所特異性結合的部分?；パa位可以是本質上線性的，或者可以是不連續(xù)的，通過抗體的非鄰近氨基酸之間的空間關系形成，而非通過線性系列的氨基酸的空間關系形成?！拜p鏈互補位”和“重鏈互補位”或“輕鏈互補位氨基酸殘基”和“重鏈互補位氨基酸殘基”分別指與抗原接觸的抗體輕鏈和重鏈殘基。本文所用的術語“特異性結合”是指抗體以比對其他抗原或蛋白質更大的親和力與預定抗原結合。通常，抗體以1(ΤΜ或更小的解離常數(shù)(Kd)結合，并且與預定抗原結合的 Kd為其與除預定抗原以外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他指定多肽)結合的Kd的至少不到1/2。詞語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異的抗體”在本文中可與術語 “與抗原特異性結合的抗體”或“抗原特異性抗體”例如TLR3特異性抗體互換使用?？梢允褂孟旅嫠龅臉藴食绦騺頊y量解離常數(shù)。本文所用的術語“TLR3生物活性”或“TLR3活化”是指任何由于配體結合到TLR3而出現(xiàn)的活性。TLR3配體包括dsRNA、聚(I C)和內源mRNA，如從壞死細胞釋放的內源mRNA。 示例性的TLR3活化導致響應TLR3配體而活化NF- κ B。NF- κ B活化可在用聚(I C)誘導受體時使用報道基因測定法(Alexopoulou等人，Nature 413 :732-738,2001 ； Hacker等人， EMBO J. 18 =6973-6982,1999)進行測定。另一種示例性的TLR3活化導致響應TLR3配體而活化干擾素響應因子(IRF-3、IRF-7)。TLR3介導IRF活化可以使用由干擾素刺激的反應元件(ISRE)驅動的報告基因來分析。另一種示例性的TLR3活化導致促炎細胞因子和趨化因子 G^i^nTNF-a、IL-6、IL-8、IL-12、CXCL5/IP-10*RANTES)的分泌。從細胞、組織釋放或流通中的細胞因子和趨化因子可以使用公知的免疫測定法例如ELISA免疫測定法來測量。本文使用如下的常規(guī)單字母和三字母氨基酸代碼
權利要求
1.一種分離的抗體或其片段，其中所述抗體結合SEQ ID N0:2的toll樣受體3(TLR3) 氨基酸殘基 K416、K418、L440、N441、E442、Y465、N466、K467、Y468、R488、R489、A491、K493、 N515、N516、N517、H539、N541、S57UL595 和 K619。
2.一種分離的抗體或其片段，其中所述抗體結合SEQ ID N0:2的toll樣受體3(TLR3) 氨基酸殘基 S115、D116、K117、A120、K139、N140、N141、V144、K145、T166、Q167、V168、S188、 E189、D192、A195 和 A219。
3.一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的分離的抗體或其片段，其中所述抗體以重鏈可變區(qū) Chothia 殘基 W33、F50、D52、D54、Y56、N58、P61、E95、Y97、YlOO 和 DlOOb 和輕鏈可變區(qū)Chothia殘基Q27、Y32、N92、T93、L94和S95結合具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的 TLR3。
4.根據(jù)權利要求3所述的分離的抗體，其中所述抗體具有以下性質中的至少一種a.以<IOnM的Kd結合人TLR3 ；b.在lyg/ml下，在體外聚(I:C)NF-KB報道基因測定中降低人TLR3生物活性> 50% ；c.在10μ g/ml 下，抑制用 < 100ng/ml 聚(I: C)刺激的 BEAS-2B 細胞的 IL-6 或 CXCLlO/ IP-10 產量的> 60% ；d.在0.4 μ g/ml下，抑制用< 100ng/ml聚(I C)刺激的BEAS-2B細胞的IL-6或 CXCL10/IP-10 產量的> 50% ；e.在5μg/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I: C)刺激的NHBE細胞的IL-6產量的> 50% ；f.在1μg/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE細胞的IL-6產量的> 50%；g.在1μg/ml下，抑制PBMC的由聚(I:C)誘導的IFN-γ、IL_6或IL-12產量的> 20% ；h.在體外NF-kB報道基因測定中以IC50< 10μ g/ml抑制食蟹猴TLR3生物活性；或者i.在體外ISRE報道基因測定中以IC50< 5 μ g/ml抑制食蟹猴TLR3生物活性。
5.根據(jù)權利要求3所述的分離的抗體，其中所述抗體包含長度為12個氨基酸的重鏈互補決定區(qū)(CDR) 3 (HCDR3)。
6.根據(jù)權利要求3所述的分離的抗體，其中所述抗體包含具有分別與SEQID N0:82、 86和84所示的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列的重鏈互補決定區(qū)(OTR) 1、2 和3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和具有分別與SEQ ID NO :79、80和87所示的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列的輕鏈互補決定區(qū)1、2和3 (IXDR1、IXDR2、IXDR3)。
7.根據(jù)權利要求3所述的分離的抗體，其包含輕鏈構架和重鏈構架，所述輕鏈構架與輕鏈可變區(qū)κ 1)構架(VK 1)的氨基酸序列具有至少90%同一性，所述重鏈構架與重鏈可變區(qū)Vh5構架(VM)的氨基酸序列具有至少90%同一性。
8.根據(jù)權利要求7所述的分離的抗體，其中所述Vkl構架由IGKV1-39*01編碼，具有 SEQ ID NO :221所示的氨基酸序列，所述Vh5構架由IGHV5-51*01編碼，具有SEQ ID N0: 222所示的氨基酸序列。
9.一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的分離的抗體或其片段，其中所述抗體以重鏈可變區(qū) Chothia 殘基 N31a、Q52、R52b、S53、K54、Y56、Y97、P98、F99 和 Y100 和輕鏈可變區(qū) Chothia 殘基 G29、S30、Y31、Y32、E50、D51、Y91、D92 和 D93 結合具有 SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列的TLR3。
10.根據(jù)權利要求9所述的分離的抗體，其中所述抗體具有以下性質中的至少一種a.以<IOnM的Kd結合人TLR3 ；b.在lyg/ml下，在體外聚(I:C)NF-KB報道基因測定中降低人TLR3生物活性> 50% ；c.在10μ g/ml 下，抑制用 < 100ng/ml 聚(I: C)刺激的 BEAS-2B 細胞的 IL-6 或 CXCLlO/ IP-10 產量的> 60% ；d.在0.4 μ g/ml下，抑制用< 100ng/ml聚(I C)刺激的BEAS-2B細胞的IL-6或 CXCL10/IP-10 產量的> 50% ；e.在5μg/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I: C)刺激的NHBE細胞的IL-6產量的> 50% ；f.在1μg/ml下，抑制用62. 5ng/ml聚(I:C)刺激的NHBE細胞的IL-6產量的> 50%；g.在1μ g/ml下，抑制PBMC的由聚(I:C)誘導的IFN-γ、IL_6或IL-12產量的> 20%。
11.根據(jù)權利要求9所述的分離的抗體，其中所述抗體包含長度為10個氨基酸的 HCDR3和長度為10個氨基酸的IXDR3。
12.根據(jù)權利要求9所述的分離的抗體，其中所述抗體包含具有與SEQID NO 70,77 和72所示的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列的重鏈互補決定區(qū)(OTR) 1、2和 3(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和具有與SEQ ID NO :67、68和78所示的氨基酸序列有至少90% 同一性的氨基酸序列的輕鏈互補決定區(qū)1、2和3 (IXDR1、IXDR2、IXDR3)。
13.根據(jù)權利要求9所述的分離的抗體，其包含輕鏈構架和重鏈構架，所述輕鏈構架與輕鏈可變區(qū)κ 3 (V λ 3)構架(V λ 3)的氨基酸序列具有至少90%同一性，所述重鏈構架與重鏈可變區(qū)Vh6構架(Vh6)的氨基酸序列具有至少90%同一性。
14.根據(jù)權利要求13所述的分離的抗體，其中所述νλ3構架由IGLV3-1*01編碼，具有SEQ ID NO :223所示的氨基酸序列，所述Vh6構架由IGHV6-1*01編碼，具有SEQ ID N0: 2 所示的氨基酸序列。
15.根據(jù)權利要求1或9所述的分離的抗體或片段，其中所述抗體a.是完全人抗體；b.是人適應抗體；c.綴合到聚乙二醇；d.為IgG4同種型或者e.Fc結構域包含S2^P、P235A或L236A突變。
16.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)權利要求1或9所述的分離的抗體或片段以及藥用載體。
17.一種治療炎性病癥的方法，所述方法包括將治療有效量的根據(jù)權利要求1或9所述的分離的抗體施用給需要其的患者一段足以治療或預防所述炎性病癥的時間。
18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述炎性病癥是炎性肺部病癥、炎性腸病、自身免疫疾病、全身性炎性病癥或類風濕性關節(jié)炎。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其中所述炎性肺部病癥是哮喘、慢性阻塞性肺病 (COPD)、氣道高反應性，或者是由非分型流感嗜血桿菌引起。
20.根據(jù)權利要求18所述的方法，其中所述全身性炎性病癥是細胞因子風暴或高細胞因子血癥、全身炎性反應綜合征(SIRS)、移植物抗宿主病(GVHD)、急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS)、嚴重急性呼吸窘迫綜合征(SARS)、災難性抗磷脂綜合征、嚴重病毒感染、流行性感冒、肺炎、休克或敗血癥。
21.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述炎性病癥與胃腸潰瘍有關。
22.根據(jù)權利要求21所述的方法，其中所述胃腸潰瘍與傳染性結腸炎、缺血性結腸炎、 膠原性或淋巴細胞性結腸炎或壞死性小腸結腸炎有關。
23.一種治療II型糖尿病、高血糖或高胰島素血癥的方法，所述方法包括將治療有效量的根據(jù)權利要求1或9所述的分離的抗體施用給需要其的患者一段足以治療II型糖尿病、高血糖或高胰島素血癥的時間。
24.一種治療或預防病毒感染的方法，其包括將治療有效量的根據(jù)權利要求1或9所述的分離的抗體施用給需要其的患者一段足以治療或預防病毒感染的時間。
25.根據(jù)權利要求M所述的方法，其中所述病毒感染是甲型流感病毒感染。
全文摘要
本發(fā)明公開了Toll樣受體3(TLR3)抗體拮抗劑、編碼TLR3抗體拮抗劑或其片段的多核苷酸以及制造和使用它們的方法。
文檔編號C12P21/06GK102482699SQ201080030275
公開日2012年5月30日 申請日期2010年4月29日 優(yōu)先權日2009年4月29日
發(fā)明者A·特普利亞科夫, F·滕, J·羅, K·赫林加, L·桑馬特奧, M·坎尼安, M·魯茨, R·T·薩里斯基, R·勞亨伯格, R·斯維特, S·吳, Y·馮 申請人:詹森生物科技公司