專利名稱：新的α-新瓊脂二糖水解酶及使用其獲得單糖類的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的α -新瓊脂二糖水解酶(α -neoagarobiose hydrolase)及使用其獲得單糖類的方法。
背景技術(shù)：
近年來，由于排放至大氣中的二氧化碳量的增加所引起的地球變暖及在不久的將來可能發(fā)生的石油的枯竭和價格上升，因此迫切要求新的二氧化碳減少型替代能源的開發(fā)。多種替代能源中，使用可以再生且為豐富的地球資源之一的生物質(zhì)來生產(chǎn)的生物能源作為滿足前述要求的主要的再生能源，目前備受關(guān)注。特別地，已經(jīng)考慮將生物乙醇作為目前需求大大增加的運輸用燃料的代替方案，在以美國為代表的發(fā)達(dá)國家中已經(jīng)用法律對生物乙醇的使用賦予了義務(wù)。目前，用于生產(chǎn)生物乙醇的原料物質(zhì)局限于來自玉米或其他糧食資源的糖質(zhì)、淀粉等(第1代生物燃料)，與人類的糧食資源競爭，從而存在引發(fā)國際糧食價格上升這樣的問題。作為可以克服這種缺點的對策，不與糧食資源競爭的新的陸地木質(zhì)系生物質(zhì)(第2代生物燃料)、海洋海藻類生物質(zhì)(第3代生物燃料)作為下一代生物能源的原料也備受關(guān)注，有效利用生物質(zhì)來生產(chǎn)生物能源的技術(shù)目前正在活躍研究中。海藻類生物質(zhì)與木質(zhì)系生物質(zhì)相比，微生物可以利用的多糖類的含量多，且由于不含木質(zhì)素，因此具有前處理較簡單、每年可以收獲多次等多個優(yōu)點。特別是韓國三面被海包圍，海藻類的生物資源化容易，海藻類的年產(chǎn)量在2006年為137M噸，與中國、日本、北朝鮮一起屬于世界的海藻類生產(chǎn)國，但現(xiàn)狀是在其有效利用率方面，除了食用資源以外，是低迷的(漁業(yè)生產(chǎn)統(tǒng)計，2006，統(tǒng)計廳社會統(tǒng)計局農(nóng)漁業(yè)生產(chǎn)統(tǒng)計科)。最近，由海藻類生產(chǎn)生物能源的研究在日本和韓國等進(jìn)行了活躍的討論。日本的水產(chǎn)業(yè)振興財團(tuán)以“Ocean Sunrise ject (海洋日出項目)”為主題，制定了在日本的專屬經(jīng)濟水域和海洋帶的未使用海域4. 47百萬km2中大量養(yǎng)殖海藻類以生產(chǎn)50億升的燃料用乙醇的計劃(Aizawa M et al. , Seaweed bioethanol production in Japan-The Ocean Sunrise Proj ect (海藻生物乙醇生產(chǎn)在日本-海洋日出項目)，OCEANS Conference, Sep. 29-Oct. 04，2007, Vancouver, Canada)。另外，韓國在2009年1月最終發(fā)表的作為政府的17個新生推進(jìn)事業(yè)領(lǐng)域之一的新再生能源領(lǐng)域中包括海洋生物燃料，對海藻類的興趣進(jìn)一步提高。根據(jù)2009年的農(nóng)林水產(chǎn)食品部的涉及海洋生物質(zhì)的確保和有效利用技術(shù)的開發(fā)的研究規(guī)劃發(fā)表，在四邊71km 的正四邊形的海域中養(yǎng)殖海藻類來生產(chǎn)生物乙醇時，一年可以生產(chǎn)37. 74億升，這是相當(dāng)于2030年韓國的汽油預(yù)期消耗量的31. 4%的量。目前已知的海藻類中，特別是使用紅藻類生物質(zhì)(例如，Gelidiumamansii)作為原料物質(zhì)的研究目前正在活躍進(jìn)行。紅藻類的干重總體的70%以上為多糖類，能夠轉(zhuǎn)換為微生物可以利用的發(fā)酵性糖。特別地，來自紅藻類生物質(zhì)的多糖類的主要成分為瓊脂(agar)，含有干重總體的60%左右，被認(rèn)為作為用于生產(chǎn)生物能源的主要原料。瓊脂多糖體是以半乳糖(D-galactose)和3，6_脫水半乳糖(3，6-anhydro-L-galactose ；以下簡稱“AHG”)為單體單元，將它們分別通過α-1，3鍵(α-1, 3-linkage)或β_1，4鍵(β -1,4-linkage)連結(jié)而成的聚合物(Duckworth，Μ. and W. Yaphe (1971) Carbohydrate Research(《碳水化合物研究》)16，435-445)(參照圖1)。已知將瓊脂多糖體用作碳源的微生物的情況下，使用β瓊脂糖酶(β-agarase) 或α瓊脂糖酶(a-agarase)將瓊脂多糖體切成小尺寸的低聚糖后，最終在β瓊脂糖酶的情況下分解成α-新瓊脂二糖(α-neoagarobiose，α-1，3-D-半乳糖基_3，6_脫氫_L_半乳糖(a-l，3-D-galactosyl-3，6-anhydro-L-galactose))，在 α 瓊脂糖酶的情況下分解成 β-瓊脂二糖(β-agarobiose, β _1，4_ 脫氫-L-半乳糖基-D-半乳糖(β-1,4-anhydro -L-galactosyl-D-galactose))。已知作為β瓊脂糖酶的分解產(chǎn)物的新瓊脂二糖的情況下， 為了微生物進(jìn)行代謝，需要轉(zhuǎn)換為半乳糖，因此需要切斷α-1，3鍵的酶(α-新瓊脂二糖水解酶)(Ekborg, N. A. et al (2005) Int. J. Syst. Evo 1. Microbiol. 55，1545-1549 ；Ekborg, N.A.et al.，(2006) Appl. Environ. Microbiol.(《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》)72，3396-3405)。 但是，迄今為止，切斷S.degradas中的新瓊脂二糖的α-1，3鍵的酶尚未發(fā)現(xiàn)(Elcborg， N. A. et al. (2006) Appl. Environ. Microbiol.(《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》)72，3396-3405)。據(jù)報道，在微生物中由瓊脂糖生產(chǎn)低聚瓊脂糖的β瓊脂糖酶可以通過許多微生物進(jìn)行生產(chǎn)，例如假單胞菌(Pseudomonas)屬菌株(Ha, J. C. etal. (1997)Biotechnol. Appl. Biochem.(《生物技術(shù)與應(yīng)用生化學(xué)》)沈1-6)、交替單胞菌(Alteromonas)屬菌株 (Potin，P.，et al. (1993) Eur. J. Biochem.(《歐洲生物化學(xué)期刊》)214 :599-607)、噬瓊膠菌 (Agarivorans)屬菌株(Ohta, Y. et al. (2005) Biotechnol. Appl. Biochem.(《生物技術(shù)與應(yīng)用生化學(xué)》)41 :183-191)，交替假單胞菌(Pseudoalteromonas)屬菌株(Belas，R. (1989) J. Bacteriol.(《細(xì)菌學(xué)雜志》)171 :602-605)，微顫菌(Microsilla)屬菌株(Zhong, Ζ. et al. (2001)Appl. Environ. Microbiol.(《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》)67 :5771-5779)和弧菌 (Vibrio)屬菌株(Aoki, T. et al. (1990)Eur. J. Biochem.(《歐洲生物化學(xué)期刊》)187 461-465)等。將來自紅藻類的瓊脂多糖體用作生產(chǎn)生物能源的原料時，必須經(jīng)過多個階段的前處理過程而轉(zhuǎn)換為微生物可以實際利用的發(fā)酵性糖。瓊脂多糖體向發(fā)酵性單糖類的轉(zhuǎn)換可以大致通過化學(xué)前處理和生物學(xué)前處理2種工序來實現(xiàn)。首先是利用酸水解等的化學(xué)方法，是較簡單的工序，但存在如下缺點將由多糖類構(gòu)成的生物質(zhì)在高溫下進(jìn)行化學(xué)前處理，會大量生成糠醛(furfural)、HMF (羥甲基糠醛，hydroxymethylfurfural)等毒性副產(chǎn)物，得到隨機切斷而得到的單糖類和低聚物的混合物(Pickering et al. , 1993, Journal of Applied Phycology (《應(yīng)用藻類學(xué)雜志》)5 :85-91 ;Armis，en，1995)。與此相對，使用瓊脂糖酶這樣的酶的生物學(xué)前處理和糖化方法具有可以在常溫下通過環(huán)境友好的方法來得到作為發(fā)酵性糖的半乳糖的優(yōu)點，但存在如下缺點目前商業(yè)上可買到的酶局限于β瓊脂糖酶，瓊脂糖酶的產(chǎn)物也將通常的微生物難以使用的二糖類(新瓊脂二糖、瓊脂二糖)作為最終產(chǎn)物。作為β瓊脂糖酶反應(yīng)的結(jié)果而生成的新瓊脂二糖的情況下，為了用于生產(chǎn)生物能源，必須轉(zhuǎn)換為作為發(fā)酵性單糖類的半乳糖，此時需要α-新瓊脂二糖水解酶。因此， 在用來將紅藻類生物質(zhì)用作生物乙醇這樣的生物能源的生產(chǎn)原料的有效的生物質(zhì)生物學(xué)的(酶的)前處理和糖化工序的最終階段，α-新瓊脂二糖水解酶是不可缺少的。另外， 作為新瓊脂二糖的水解產(chǎn)物而與半乳糖一起獲得的AHG，即使在商業(yè)上也沒有銷售，是只能購入D型的AHG的狀況，而且價格賣得很高(2009年，200磅(英國)/100mg，Dextra Laboratories)。因此，可以使用本酶，由瓊脂糖大量生產(chǎn)作為高價的寶貴性單糖類的AHG。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題為解決上述問題，根據(jù)上述必要性而想出本發(fā)明，其目的在于提供一種在向用于生物能源的生產(chǎn)等的作為發(fā)酵性單糖類的半乳糖的轉(zhuǎn)換中所必須的酶。本發(fā)明的其他目的在于提供一種使用新瓊脂二糖作為基質(zhì)，轉(zhuǎn)換成作為單糖類糖的半乳糖和AHG的方法。技術(shù)的解決方法為了達(dá)成前述目的，本發(fā)明提供選自由序列號1 序列號11構(gòu)成的組中的α -新瓊脂二糖水解酶(α -neoagarobiose hydrolase ；以下稱為 “ α -ΝΑΒΗ” )。本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，就前述具有α-新瓊脂二糖水解活性的酶而言，不僅包含序列號1 序列號11所公開的氨基酸序列，而且作為前述酶的1個以上進(jìn)行了取代、缺失、易位、添加等的突變蛋白質(zhì)而具有α-新瓊脂二糖水解活性的蛋白質(zhì)也包含在本發(fā)明的酶的權(quán)利要求范圍中，優(yōu)選包含與序列號1 序列號11所公開的氨基酸序列的序列一致性為80%以上、85%以上、90%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、 98%以上和99%以上的氨基酸序列。本發(fā)明中，多肽相對于其他序列具有特定比率(例如，80%、85%、90%、95%或 99% )的序列一致性是指，使前述2個序列比對時，比較前述序列時前述比率的氨基酸殘基相同。前述比對以及百分率相同性或一致性可以使用本技術(shù)領(lǐng)域公知的任意的適當(dāng)軟件程序，例如文獻(xiàn)⑶RRENT PROTOCOLS INMOLE⑶LAR BIOLOGY (《最新分子生物學(xué)實驗方法匯編》)(F.M.Ausubel 等(eds) 1987Supplement 30section 7.7.18)中所記載的軟件程序來決定。作為優(yōu)選的程序，有 GCG Pileup 程序、FASTA(Pearson 等，1988Proc. Natl. Acad. Sci. USA(《美國科學(xué)院院刊》)85 J444-2448)、和 BLAST (BLAST Manual (BLAST 手冊)， Altschul 等，Natl. Cent. Biotechnol. Inf.，Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH)，Bethesda, MD 和 Altschul 等，1997NAR25 :3389-3402)。其他優(yōu)選的比對程序是 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software，PA)，優(yōu)選使用基本媒介變量的程序?？梢允褂玫钠渌男蛄熊浖坛市蚴强梢栽?Sequence Software Package Version 6. 0 (Genetics Computer Group (遺傳學(xué)計算機小組)，University of Wisconsin (威斯康辛大學(xué))，Madison，WI)中利用的 TFASTA Data Searching Program。本發(fā)明的一個實施例中，前述酶優(yōu)選從交替單胞菌saccharophagus degradans等獲得，但并不限定于此。^^ BJlii saccharophagus degradans ffl^nT L^i,Jl^A (saccharophagus degradans ATCC 43961)，但可以通過不受此限定的多種方法獲得。另外，本發(fā)明提供一種編碼前述本發(fā)明的酶的基因。在本發(fā)明的一個實施例中，前述基因優(yōu)選是在序列號12中記載的基因，但并不限定于此。另外，在本發(fā)明的一個實施例中，前述基因優(yōu)選從交替單胞菌saccharophagus
5degradans獲得，但并不限定于此。另夕卜，本發(fā)明提供一種制造本發(fā)明的酶的方法，包括培養(yǎng)交替單胞菌 saccharophagus degradans > iAJ^Ifif Φ￠1 ^^ _ 。另外，本發(fā)明提供一種制造半乳糖和脫水半乳糖的方法，包括用本發(fā)明的酶分解 α -新瓊脂二糖，從前述分解物中提取半乳糖和脫水半乳糖。另外，本發(fā)明提供一種α -新瓊脂二糖水解酶，其包含含有在選自由圖8所示的模序(motif) 1 50 (共50個模序)所構(gòu)成的組中的模序中的1、2、3、4、5、6、7、14、16、17、 20,34,40的13個模序，更加優(yōu)選提供必須包含圖8所示的50個模序中的模序7和34的
α-新瓊脂二糖水解酶。蛋白質(zhì)模序如果可以用規(guī)則表示的模式表示，則通常模式的表達(dá)方式用正則表達(dá)式表不；http //www, expasy. ch/prosite/prosuser. html ；例如PA [AC] -x-V-x (4) - {ED}。本模式角軍析如下[Ala or Cys] -any-Val-any-any-any-any- {any but Glu orAsp}PA < A-x-[ST] (2)-χ (0,1)-V.該模式必須在序列的N-末端(“<”)，解析如下Ala-any- [Ser or Thr] - [Ser or Thr] - (any or none) -Val ； Si grist C. J. A. , Cerutti L. , Hulo N. , Gattiker A. , Falquet L. , Pagni Μ. , Bairoch A., Bucher P. PR0SITE :adocumented database using patterns and profiles as motif descriptors. BriefBioinform.(《生物信息簡報》)3 :265-274 Q002) ；Sigrist C. J.A.，De Castro Ε. ,Langendijk-Genevaux P. S. ,Le Saux V. ,Bairoch Α. ,Hulo N. ProRule :a new database containing functional and structural information on PR0SITE profiles. Bioinformatics (《生物信息學(xué)》)· 2005Nov 1 ；21 (21) :4060-6. Epub 2005Aug 9 ；Timothy L. Bailey, Nadya Williams, Chris Misleh, and Wilfred W. Li, MEME-discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs,Nucleic Acids Research (《核酸石if究》)， Vol. 34，pp.W369-W373,2006)。本發(fā)明中，與細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體關(guān)聯(lián)而使用時，用語“重組”是指前述細(xì)胞、 核酸、蛋白質(zhì)或載體由于異種核酸或蛋白質(zhì)的導(dǎo)入或者原來的核酸或蛋白質(zhì)的變更而變形、或者前述細(xì)胞來自這樣變形后的細(xì)胞。即，例如，重組細(xì)胞表達(dá)在前述細(xì)胞原來的(非重組)形態(tài)內(nèi)未表達(dá)的基因、或者表達(dá)由于不同而在表達(dá)時異常地表達(dá)、或者完全未表達(dá)的原來的基因。用語“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本發(fā)明中可以互換使用。本發(fā)明中對于氨基酸殘基， 使用通常的1個字或3個字的編碼。本發(fā)明中，“基因”不僅指本發(fā)明的酶的編碼區(qū)域之前或之后的區(qū)域，也指包含各自的編碼片段間的插入序列的、與生產(chǎn)多肽有關(guān)的DNA片段。本發(fā)明中，用語“核酸”包括單鏈或雙鏈的DNA、RNA及它們的化學(xué)變異體。用語 “核酸”和“多核苷酸”在本發(fā)明中可以能夠互換地使用。由于遺傳密碼簡并，因此為了編碼特定氨基酸，可以使用1個以上的密碼子，本發(fā)明包括編碼特定的氨基酸序列的多核苷酸。本發(fā)明中，“載體”是指為了在1個以上細(xì)胞類型內(nèi)導(dǎo)入核酸而設(shè)計的多核苷酸序列。就載體而言，有克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體粒子、盒子(cassette)等。本發(fā)明中使用的“表達(dá)載體”是指具有可工作地與可以使目標(biāo)DNA在適當(dāng)?shù)乃拗鲀?nèi)表達(dá)的適當(dāng)?shù)目刂菩蛄羞B結(jié)的DNA序列的DNA結(jié)構(gòu)物。這種控制序列可以包含引起轉(zhuǎn)錄的啟動子、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的任意的操縱子(operator)序列、編碼mRNA上的適當(dāng)?shù)暮颂求w結(jié)合部位的序列、增強子以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。本發(fā)明中，“啟動子”是涉及為了開始基因的轉(zhuǎn)錄而使RNA聚合酶結(jié)合的調(diào)節(jié)序列。 前述啟動子可以是誘導(dǎo)性啟動子或構(gòu)成型(constitutive)啟動子。本發(fā)明中的用語“來自”包括用語“源自”、“可得到”或“可以從...得到”、以及 “可從...離析出”，在本發(fā)明中使用時，它是指被前述核苷酸序列編碼的多肽由原本存在前述核苷酸、或者插入有前述核苷酸序列的細(xì)胞產(chǎn)生。用語“培養(yǎng)”是指在適當(dāng)?shù)臈l件下，使微生物細(xì)胞群體在液體或固體培養(yǎng)基中生長。在優(yōu)選的實施例中，培養(yǎng)是指(典型地在容器或反應(yīng)器內(nèi))將含有瓊脂糖的基質(zhì)生物轉(zhuǎn)換為最終生成物。發(fā)酵是指通過使用微生物將有機物質(zhì)以酶方式和厭氧方式進(jìn)行分解而產(chǎn)生更單純的有機化合物。發(fā)酵在厭氧條件下發(fā)生，但由于發(fā)酵還可以在氧的存在下發(fā)生， 因此不用將前述用語僅限定于嚴(yán)格的厭氧條件。本發(fā)明中使用的用語“回收”、“離析”和“分離”是指從自發(fā)結(jié)合的1個以上的成分中除去的化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸。與本發(fā)明中使用的細(xì)胞關(guān)聯(lián)使用的用語“轉(zhuǎn)化”、“穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化”和“基因?qū)?(transgenic)”是指具有作為細(xì)胞通過數(shù)代維持的附加體質(zhì)粒的、或整合到其基因組內(nèi)的非原來(例如，異種)的核酸序列。本發(fā)明中使用的用語“表達(dá)”是指基于基因的核酸序列而生產(chǎn)多肽的方法。前述方法包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。將核酸序列插入細(xì)胞內(nèi)的用語“導(dǎo)入”是指“轉(zhuǎn)染(transfection) ”、或者“轉(zhuǎn)化” 或“轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction) ”，包括言及涉及核酸序列整合到真核或原核細(xì)胞內(nèi)，此時，前述核酸序列被整合到細(xì)胞的基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、色素體或線粒體DNA)內(nèi)，轉(zhuǎn)換成自主復(fù)制子、或者暫時表達(dá)。以下，關(guān)于本發(fā)明進(jìn)行說明。1.含有紅藻類的海^羊勿質(zhì)的前處理工序過稈中，由 為了從瓊脂多糖體生成發(fā)酵性糖，作為分解為單糖類的前處理過程，可以利用大致化學(xué)方法和酶方法2種方法。首先，化學(xué)方法由于隨機地分解復(fù)合多糖類，因此不僅非常難以選擇性地生產(chǎn)所希望的發(fā)酵性單糖類，而且還有時生成阻礙所生成的糖的發(fā)酵的副產(chǎn)物。另外，在堿處理或酸處理的情況下，排放相當(dāng)數(shù)量的污染物質(zhì)，為了凈化這些污染物質(zhì)要花費高額費用，作為微生物可以利用的發(fā)酵性糖的生產(chǎn)方法是不適合的。作為酶方法，可以使用微生物生成的瓊脂糖酶來使瓊脂多糖體分解。作為可以用于這種方法的酶，可舉出 α瓊脂糖酶或β瓊脂糖酶。作為分解瓊脂多糖體的酶，α瓊脂糖酶將瓊脂多糖體中存在的α-1，3和β_1，4鍵中的α鍵水解，從而最終生成β -瓊脂二糖二糖體，β瓊脂糖酶切斷β鍵而生成α-新瓊脂二糖二糖體。在這種酶的前處理的過程中使用β瓊脂糖酶的情況下，最終產(chǎn)物是α-新瓊脂二糖，這是通常的微生物無法使用的非發(fā)酵性糖。為了將其最終轉(zhuǎn)換為作為發(fā)酵性糖的半乳糖的前處理工序，α -新瓊脂二糖水解酶是不可缺少的。2.圳飾剖旨錯側(cè)■■一_目前，由新瓊脂二糖的水解得到的3，6_脫水-L-半乳糖(3， 6-Anhydro-L-galactose)即使在商業(yè)上也沒有銷售，是只能購入D型的AHG的狀況，而且價格賣得很高(2009年，200磅(英國)/100mg, DextraLaboratories)。因此，可以使用本酶、由瓊脂糖大量生產(chǎn)高價的AHG。本發(fā)明的發(fā)明人等確認(rèn)了海洋細(xì)菌saccharophagus degradans中的α -新瓊脂二糖水解酶的活性，并首次確認(rèn)了該基因。另外，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌來大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)，從而確認(rèn)了 α-新瓊脂二糖水解酶的活性。使用新的α-新瓊脂二糖水解酶基因的酶活性來適用于含有瓊脂多糖體的海洋生物質(zhì)的前處理工序中，并用于由前處理工序所得的α-新瓊脂二糖獲得包含半乳糖的發(fā)酵性糖。近年來，發(fā)現(xiàn)可以使用瓊脂多糖體作為碳源來進(jìn)行生長的作為海洋細(xì)菌的 saccharophagus degradans, ^^^ΙΦWii^1J 1^ °為了發(fā)掘α -新瓊脂二糖水解酶的基因，首先確認(rèn)交替單胞菌saccharophagus degradans中的α -新瓊脂二糖水解酶的活性。其次，通過染色體序列信息的分析，預(yù)測將交替單胞菌saccharophagus degradans的基因中屬于糖基水解酶家族32的基因(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot database ID :Q21HB2)作為α -新瓊脂二糖水解酶。實際上，為了確認(rèn)蛋白質(zhì)是否具有α-新瓊脂二糖水解酶的活性，在表達(dá)用載體中進(jìn)行復(fù)制，在大腸桿菌中進(jìn)行過表達(dá)，并分離精制蛋白質(zhì)后，最終確認(rèn)酶的活性。發(fā)明效果本發(fā)明中，報道了新的α -新瓊脂二糖水解酶的堿基序列和蛋白質(zhì)序列。特別地， 如上所述，近年來，在使用海藻類生物質(zhì)的生物能源的生產(chǎn)中生物質(zhì)向發(fā)酵性糖的酶轉(zhuǎn)化工序中，為了由瓊脂多糖體生產(chǎn)脫水半乳糖和半乳糖，必須使用α-新瓊脂二糖水解酶，因此會起到可以期待生物質(zhì)前處理的成本削減和產(chǎn)量提高效果這樣的效果。另外，在生產(chǎn)生物燃料的酵母或細(xì)菌等中導(dǎo)入α-NABH基因，從而還可以期待由瓊脂(agar)或新瓊脂二糖直接生產(chǎn)生物燃料。進(jìn)一步地，在由海洋生物質(zhì)生產(chǎn)作為高附加價值的單糖類的半乳糖和 AHG的工序中也使用α -新瓊脂二糖水解酶，也可以進(jìn)行有用物質(zhì)的生產(chǎn)。


圖1為表示瓊脂多糖體的結(jié)構(gòu)的圖。圖2為表示由S. degradans 2-40得到的細(xì)胞內(nèi)助酶得到的反應(yīng)生成物的薄膜色譜(Thin layer chromatography)的照片。條帶A 半乳糖的標(biāo)樣；條帶B 與細(xì)胞內(nèi)酶一起培養(yǎng)0. 25% (w/v)瓊脂糖而得的培養(yǎng)液；條帶C 與細(xì)胞內(nèi)酶一起培養(yǎng)0. 3% (w/v)石花菜(紅藻類)而得的培養(yǎng)液。酶反應(yīng)在30°C、20mM Tris-HCl (pH6. 8)中進(jìn)行12小時。圖3表示本發(fā)明所發(fā)掘的基因的堿基序列和蛋白質(zhì)序列。圖4表示在大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)行了精制的瓊脂糖酶；12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；A 分子尺寸標(biāo)識物、B α -新瓊脂二糖水解酶(α -neoagarobiose hydrolase)。圖5表示α -新瓊脂二糖水解酶(α -neoagarobiose hydrolase)和β瓊脂糖酶引起的瓊脂糖水解的產(chǎn)物的薄膜色譜照片。在30°C、20mM Tris-HCl (pH6. 8)中進(jìn)行酶反應(yīng)， 其基質(zhì)濃度為0. 25 (w/v)。(a)半乳糖(b-c)反應(yīng)混合物。A 半乳糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；B α -新瓊脂二糖水解酶反應(yīng)產(chǎn)物(反應(yīng)2小時)；C 新瓊脂二糖。圖6表示α -新瓊脂二糖水解酶和β瓊脂糖酶引起的瓊脂糖水解的產(chǎn)物通過液相色譜-質(zhì)譜分析(Mass Spectrometry)來確認(rèn)反應(yīng)產(chǎn)物。使用質(zhì)量分析儀的反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量分析結(jié)果(陰離子化而形成甲酸鹽(HC00-，分子量45))，如圖6所示，確認(rèn)到半乳糖的質(zhì)量為225. 1 (180+45)，脫水半乳糖為207. 1 (162+45)。因此，確認(rèn)到水解酶的產(chǎn)物是半乳糖和脫水半乳糖。即，依靠來自基礎(chǔ)科學(xué)支援中心首爾分所的質(zhì)量分析所得的結(jié)果是圖 6所示的質(zhì)量分析圖譜，解析其結(jié)果，結(jié)果確認(rèn)了酶的水解產(chǎn)物。圖7表示含有α-新瓊脂二糖水解酶的同源(homolog)蛋白質(zhì)的模序(motif)分析結(jié)果。圖8表示α -新瓊脂二糖水解酶的特異的模序。圖9和圖10表示包含所有由圖8確認(rèn)的α-新瓊脂二糖水解酶的特異的模序的蛋白質(zhì)的序列。圖11表示使用由圖9和圖10所得的10個序列和α -新瓊脂二糖水解酶的氨基酸序列的多重序列比對。圖12表示在大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)行了精制的來自大西洋假交替單胞菌的瓊脂糖酶；12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；條帶A 分子尺寸標(biāo)識物；條帶B : α -新瓊脂二糖水解酶。圖13表示在大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)行了精制的天藍(lán)色鏈霉菌；12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；條帶A α -新瓊脂二糖水解酶；條帶B 分子尺寸標(biāo)識物。圖14是α-新瓊脂二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase)和β瓊脂糖酶引起的瓊脂糖水解的產(chǎn)物的薄膜色譜照片。使酶反應(yīng)在30°C、20mMTris-HCl (pH6. 8) 中進(jìn)行2小時，其基質(zhì)濃度為0.25(w/v)。㈧半乳糖(B-D)反應(yīng)混合物。條帶A:半 ？LHfe^iItlM ；B glii saccharophagus degradans (saccharophagus degradans 2-40)的α -新瓊脂二糖水解酶反應(yīng)產(chǎn)物；條帶C 來自大西洋假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas atlantica T6c)的α -新瓊脂二糖水解酶反應(yīng)產(chǎn)物；條帶D 來自天藍(lán)色鏈霉菌(Sti^ptomyces coelicolorA3)的α -新瓊脂二糖水解酶反應(yīng)產(chǎn)物。
具體實施例方式以下，通過非限定的實施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。但下述實施例以說明本發(fā)明的目的而記載，本發(fā)明的范圍不受下述實施例限制。實施例1 來自saccharophagus degradan粗提取液的α -新瓊脂二糖水解酶的酶活性的確認(rèn)為了確認(rèn)saccharophagus degradan是否具有通過α -新瓊脂二糖水解生成作為單糖類的半乳糖和AHG的酶活性，按以下方法得到粗提取液并確認(rèn)活性。使 saccharophagus degradan在含有海水鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至對數(shù)增殖期的中期后，對 40ml的培養(yǎng)液進(jìn)行離心分離，然后利用超聲波將細(xì)胞粉碎，得到粗提取液后，將利用β瓊脂糖酶分解瓊脂多糖體而得到的瓊脂糖作為基質(zhì)，通過TLC觀察反應(yīng)分解產(chǎn)物。A條帶是半
9乳糖標(biāo)準(zhǔn)物、B條帶是使0.25% (w/v)的瓊脂糖與saccharophagus degradan的細(xì)胞內(nèi)助酶液反應(yīng)而成的產(chǎn)物、C條帶是使0. 3% (w/v)作為紅藻類的干燥的瓊脂粉與saccharophagus degradan的細(xì)胞內(nèi)助酶液反應(yīng)后，通過TLC分析產(chǎn)物的結(jié)果。通過與saccharophagus degradan的細(xì)胞內(nèi)助酶液的反應(yīng)，從瓊脂糖和瓊脂獲得的均是作為單糖類的AHG和半乳糖，而且確認(rèn)到生成兩種糖類。因此得知，saccharophagus degradan具有在細(xì)胞內(nèi)通過 α -新瓊脂二糖水解而生成作為單糖類的半乳糖和AHG的酶。本發(fā)明中發(fā)掘的基因的堿基序列和蛋白質(zhì)的氨基酸序列如圖3所示。_仿丨丨2:α-旨二 ■崖賄經(jīng)精制的α-新瓊脂二糖水解酶的活性如下所述進(jìn)行確認(rèn)。首先，用β瓊脂糖酶處理瓊脂多糖體而生成作為酶處理的最終產(chǎn)物的新瓊脂二糖后，將其作為基質(zhì)，通過TLC 確認(rèn)α -新瓊脂二糖水解酶的反應(yīng)產(chǎn)物(圖5的TLC結(jié)果)。確認(rèn)到用α -新瓊脂二糖水解酶在TLC溶劑條件(正丁醇乙醇水=3 2 2)下處理過的基質(zhì)被分解為推斷是半乳糖和脫水半乳糖的物質(zhì)。在TLC上確認(rèn)到半乳糖Rf值約為0. 46、α -新瓊脂二糖的Rf 值約為0. 58。為了測定通過α -新瓊脂二糖水解酶生成的產(chǎn)物的分子量，通過液相色譜-質(zhì)譜分析儀(liquid chromatography-mass spectrometry)石角認(rèn)了分子量。由 LC—MS 分析結(jié)果顯示脫水半乳糖(AHG)的分子量為162、半乳糖分子量為180。207. lm/z是甲酸(formic acid)與脫水半乳糖結(jié)合的狀態(tài)的分子量，可知脫水半乳糖被檢測出，179. lm/z和225. Im/ ζ是半乳糖以及與半乳糖結(jié)合的甲酸的分子量，可以確認(rèn)半乳糖被檢測出。因此，如LC-MS 所示，可以確認(rèn)作為新瓊脂二糖水解酶的反應(yīng)產(chǎn)物的2種單糖類、即半乳糖和脫水半乳糖為反應(yīng)產(chǎn)物(參照圖6)。^MM 3:α-新 SH 旨二解寺異的 jfelt序序歹 U通常，蛋白質(zhì)模序是指在具有相同的分子功能的蛋白質(zhì)中以一種模式表達(dá)的短的肽序列。這種蛋白質(zhì)模序被大致進(jìn)化地、正常地保存在蛋白質(zhì)的全體序列中，并以模式化的氨基酸序列表示，所述模式化的氨基酸序列以包含活性部位的、代表分子功能的區(qū)域表不(Sigrist C. J. A. , Cerutti L. , Hulo N. , Gattiker A. , Falquet L. , Pagni Μ. , Bairoch A.,Bucher P. PROSITE :a documented database using patterns and profiles as motif descriptors. Brief Bioinform(《生物信息簡報》).3 :265-274 Q002) ；Sigrist C. J.A.，De Castro Ε. , Langendijk-Genevaux P. S. , LeSaux V. , Bairoch Α. , Hulo N. ProRule :a new database containing functional and structural information on PR0SITE profiles. Bioinformatics (《生物信息學(xué)》)· 2005Nov 1 ；21 (21) :4060-6. Epub 2005Aug 9 ；Timothy L. Bailey, Nadya Williams, Chris Misleh, and Wilfred W. Li, MEME-discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs,Nucleic Acids Research (《核酸石if究》)， Vol. 34，pp.W369-W373,2006)。為了確認(rèn)可以規(guī)定α -新瓊脂二糖水解酶的蛋白質(zhì)模序的序列，首先，使用α -新瓊脂二糖水解酶的氨基酸序列作為模板，使用NCBI堿基局部對準(zhǔn)檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)來檢索公共數(shù)據(jù)庫，收集具有統(tǒng)計顯著性(Ε-value <0. 001)的60個(包含α-新瓊脂二糖水解酶的)蛋白質(zhì)的氨基酸序列。使用這些序列，使用作為蛋白質(zhì)模序檢索程序的 MEME(http//meme. sdsc. edu/meme4_l/intro. html ；使用參數(shù)mode = zero or one occurrence&nsites = 50, mwin = 8,除此以夕卜的條件使用default parameters ；Timothy L. Bailey,Nadya Williams,Chris Misleh,and Wilfred W. Li, MEME :discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs, Nucleic Acids Research, Vol. 34，pp. W369-W373, 2006)來檢索針對α -新瓊脂二糖水解酶的特異的模序。其結(jié)果如圖7所示，確認(rèn)到saccharophagus degradan的α -新瓊脂二糖水解酶具有在從具有相同性的蛋白質(zhì)的分析所得的共50個模序中的13個特異的模序(1、2、 3、4、5、6、7、14、16、17、20、34、40)。因此，可以確認(rèn)該13個特異的模序是代表α -新瓊脂二糖水解酶的活性的模序。其中模序7和34是一定出現(xiàn)在代表α-新瓊脂二糖水解酶的活性的蛋白質(zhì)中的必須的2個模序，分別示于圖8和圖9 (通常，蛋白質(zhì)模序使用正則表達(dá)式(regular expression)來表示，因此附圖上也以相同的方式來表現(xiàn)；Sigrist C. J. A.， Cerutti L. , Hulo N. , Gattiker A. , Falquet L. , Pagni M. , Bairoch A. , Bucher P. PR0SITE :a documented database using patterns and profiles as motif descriptors. Brief Bioinform (《生物信息簡報》).3 =265-274 (2002)) 0因此可以說，包含13個特異模序中的一部分、其中一定含有模序7和34的蛋白質(zhì)具有α-新瓊脂二糖水解活性(參照圖 8)。確認(rèn)了 在與α-新瓊脂二糖水解酶顯示出序列相同性的蛋白質(zhì)中，含有這13個特異模序的一部分且一定含有模序7和34的蛋白質(zhì)是10個(參照圖9和10)。前述含有在α -新瓊脂二糖水解酶中發(fā)現(xiàn)的13個特異模序的一部分且一定含有模序7和34的蛋白質(zhì)在現(xiàn)有公共數(shù)據(jù)庫上發(fā)現(xiàn)了 10個。這些起源分別是大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica T6c)，微顫菌(Microscilla sp.PREl)，擬桿菌 (Bacteroides plebeius DSM17130，革蘭菌(Gramella forsetii)(菌株 KT080;3)，黃桿菌 (Flavobacteriales bacterium HTCC2170),類芽抱桿菌(Paenibacillus sp. oral taxon 786str. D14)，瘤胃球菌(Rum inococcus sp. 5139BFAA)，天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor A3)。各自的氨基酸序列示于圖10。圖11所示的序列是如上所述地在與α -新瓊脂二糖水解酶具有序列相同性的蛋白質(zhì)中，選擇含有13個特異模序的一部分且一定含有模序7和34的10個蛋白質(zhì)進(jìn)行多重比對而成的序列，這些10個蛋白質(zhì)的序列示于圖9和圖10。^MM 4;α-新SH旨二因的蛋白J1!序歹I丨的相同+牛的石角i人通過檢索來自saccharophagus degradan的水解酶的蛋白質(zhì)序列的相同性來確認(rèn)預(yù)計具有類似功能的候選基因。雖然候選基因的具體功能未知，但根據(jù)作為碳水化合物關(guān)聯(lián)的酶/蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的CAZy (http //www. cazy. org)，可以確認(rèn)它們均屬于糖苷水解酶(glycoside hydrolase family 32，GH32)。屬于GH32家族的蛋白質(zhì)所具有的已知功能是轉(zhuǎn)化酶(irwertase) (EC 3.2.1.26)；內(nèi)切菊粉酶 (endo-inulinase) (EC 3.2.1.7) ； β _2，6-果聚糖 6-左聚糖生物水解酶(β-2,6-fructan 6-levanbiohydrolase) (EC 3. 2. 1. 64)；內(nèi)切左聚糖酶(endo-levanase) (EC 3. 2. 1. 65)； 外切菊粉酶(exo-inulinase) (EC 3.2.1.80)；果聚糖β _(2，1)-果糖苷酶/1-外水解酶(fructan β -(2，1)-fructosidase/l-exohydrolase) (EC 3. 2. 1. 153)；果聚糖 β -(2, 6)-果糖苷酶 /6-夕卜水解酶(frctan β -(2,6) -fructosidase/6-exohydrolase) (EC 3. 2. 1. 154)；蔗糖蔗糖 1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(sucrose sucrose 1-fructosyltransferase) (EC 2. 4. 1. 99)；果聚糖果聚糖I-果糖基轉(zhuǎn)移酶(fructan fructan1-fructosyltransferase) (EC2. 4. 1. 100)；蔗糖果聚糖 6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(sucrose fructan 6-fructosyltransferase) (EC 2. 4. 1. 10)；果聚糖果聚糖 6G-果糖基轉(zhuǎn)移酶 (fructan fructan 6G_fructosyltransferase) (EC2. 4. 1. 243)；左聚糖果糖基轉(zhuǎn)移酶 (levan ffrctosyltransferase) (EC 2.4.1.-)。因此，屬于 GH32 家族的一部分蛋白質(zhì)具有與α -新瓊脂二糖水解酶相同的分子功能，這在本發(fā)明開始已報道。JA^: § saccharophagus degradan (saccharophagus degradan 2-40)白勺 α ~ 0 脂二糖水解酶(以下稱為α-ΝΑΒΗ)的氨基酸序列的相同性的檢索(BLAST檢索-參照附件)獲得的序列中，如果通過BLAST的E-value羅列具有50%以上的相同性的蛋白質(zhì)序列， 則如下所示(以下使用Uniprot數(shù)據(jù)庫序號，括弧內(nèi)是來源微生物和％相同性)。1. Q15UF2(大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)(菌株 T6c/ BAA-1087) ,70% )，2.Q93PB3(微顫菌(Microscilla sp. PRE 1. ) ,59% ),3. B4CY74(擬桿菌(Bacteroidesplebeius DSM17135. ) ,60% )，4·Α0Μ245(革蘭菌(Gramella forsetii)(菌株 KT0803) · ,56% ),5. A4AR39(黃桿菌(Flavobacteriales bacterium HTCC2170.) ,57% ),6. C6J3P3(類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. oral taxon 786str. D14. ) ,58% ),7. C6JDD4(瘤胃球菌(Ruminococcus sp. 5_1_39BFAA.) ,58% ),8. C6J313(類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. oral taxon 786str. D14. ) ,57% ),9. Q15XP8(大西洋假交替單胞菌(Pseudoalteromonas atlantica)(菌株 T6c/ BAA-1087) ,55% )，10. Q9RKF6 (天藍(lán)色鏈霉菌(Str印tomyces coelicolor), 56% )實施例5 大腸桿菌中的表達(dá)和大小的確認(rèn)分別復(fù)制前述獲得的具有50%相同性以上的序列相同性的蛋白質(zhì)中具有最高序列相同性的來自大西洋假交替單胞菌O^seudoalteromonas atlantica T6c)的蛋白質(zhì) (Q15UF2)和最低的來自天藍(lán)色鏈霉菌Gtr印tomyces coelicolorA3)的蛋白質(zhì)019RKF6)， 確認(rèn)是否具有α-NABH活性。首先，將使它們密碼化的基因的堿基序列分別插入作為大腸桿菌表達(dá)載體的pET21a(N0Vagen，美國)中(以下，將含有來自大西洋假交替單胞菌的 α -ΝΑΒΗ基因的表達(dá)載體稱為“pI^sAGAJ”、將含有來自天藍(lán)色鏈霉菌的α -ΝΑΒΗ基因的表達(dá)載體稱為pScAGAJ)。為了確認(rèn)重組α -ΝΑΒΗ在大腸桿菌中成功表達(dá)，使pPsAGAJ和pScAGAJ 轉(zhuǎn)化為作為表達(dá)用大腸桿菌的Ε. coli BL21(DE3)后，涂抹在含有50mg/L濃度的安匹西林抗生素的固體培養(yǎng)基上。將通過前述轉(zhuǎn)化所得的菌落接種在添加有50mg/L濃度的安匹西林抗生素的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基上后，在37°C振蕩培養(yǎng)一天，確保菌體。之后，為了確認(rèn)表達(dá)，將轉(zhuǎn)化體接種在添加有50mg/L濃度的安匹西林抗生素的Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基上后，在37°C振蕩培養(yǎng)直至0D600 = 0. 5 1. 0，以0. 5mM/L的濃度添加IPTG，在 180rpm下誘導(dǎo)表達(dá)4小時。培養(yǎng)液經(jīng)離心分離(12000rpm、4°C、10分鐘)回收菌體，回收的菌體在20mM的Tris緩沖液(Tris_HCl，pH 7. 4)中進(jìn)行懸浮，利用超聲波粉碎機進(jìn)行粉碎后，通過12%的SDS-PAGE來確認(rèn)大小。將確認(rèn)了大小的已粉碎的懸浮液進(jìn)行15分鐘離心分離，使用上清液作為助酶液。
_3] ^MM 6;α-新SH旨二解舌件的石角i人
經(jīng)精制的α-NABH的活性如下所述進(jìn)行確認(rèn)。首先，用β瓊脂糖酶處理瓊脂多糖體，生成作為酶處理的最終產(chǎn)物的新瓊脂二糖后，將其作為基質(zhì)，通過TLC確認(rèn)α -ΝΑΒΗ的反應(yīng)產(chǎn)物。通過TLC的確認(rèn)是在硅膠60TLC平板上滴下1 μ 1反應(yīng)液，并在TLC溶劑條件 (正丁醇乙醇水=3 2 2)下展開。展開的TLC平板用作為處理溶液的硫酸(乙醇中有10% (ν/ν)硫酸)處理1次后，進(jìn)行干燥，經(jīng)1次處理的平板再用作為2次處理溶液的間萘二酚(乙醇中有0.2% (w/v)間萘二酚)處理。這樣處理的TLC平板干燥后，進(jìn)行加熱。前述實施例4 6的結(jié)果如下所述。來自使用作為表達(dá)用菌株的E.coli BL21(DE3)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的大西洋假交替單胞菌和天藍(lán)色鏈霉菌的α -ΝΑΒΗ的表達(dá)和大小的確認(rèn)是通過12%的SDS-PAGE進(jìn)行確認(rèn)的。來自大西洋假交替單胞菌和天藍(lán)色鏈霉菌的α-NABH的預(yù)期分子量分別為40. 7kDa和 41. IkDa左右，確認(rèn)與預(yù)期分子量相同(圖12、圖13)。另外，為了確認(rèn)分解產(chǎn)物，使用作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的D-半乳糖來確認(rèn)預(yù)期分解產(chǎn)物。 確認(rèn)到作為用α-NABH處理過的二糖類的新瓊脂二糖被分解為推斷是已確認(rèn)具有與D-半乳糖相同的Rf值的半乳糖和脫水半乳糖的物質(zhì)(圖14)。
權(quán)利要求
1.一種α -新瓊脂二糖水解酶，其選自由序列號1 序列號11構(gòu)成的組。
2.如權(quán)利要求1所述的α-新瓊脂二糖水解酶，其特征在于，所述α-新瓊脂二糖水解酶包含序列號4的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的酶，其特征在于，所述酶從saccharophagusdegradans獲得。
4.一種編碼權(quán)利要求2所述的α-新瓊脂二糖水解酶的基因。
5.如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因記載在序列號12中。
6.如權(quán)利要求4或5所述的基因，其特征在于，所述基因從saccharophagusdegradans 獲得。
7.—種制造權(quán)利要求2所述的α-新瓊脂二糖水解酶的方法，包括培養(yǎng)微生物 saccharophagus degradans，從培養(yǎng)液中提取權(quán)利要求2的α -新瓊脂二糖水解酶。
8.—種制造半乳糖或脫水半乳糖的方法，包括用權(quán)利要求1或2所述的α-新瓊脂二糖水解酶分解α -新瓊脂二糖，并從所述分解物中提取半乳糖或脫水半乳糖。
9.如權(quán)利要求8所述的制造半乳糖或脫水半乳糖的方法，所述α-新瓊脂二糖水解酶 hX sacharophagus degradans
10.一種α-新瓊脂二糖水解酶，其必須包含圖8所示的模序7和34。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的α-新瓊脂二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase)及使用其獲得單糖類的方法。
文檔編號C12P19/12GK102405282SQ201080014617
公開日2012年4月4日 申請日期2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者崔仁杰, 李世榮, 金京憲 申請人:高麗大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)