專利名稱：一種制備β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的方法及其專用菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備13 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的方法及其專用菌株。
背景技術(shù)：
|3 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶能將乳糖分解為單糖，在改良的冰淇淋混合物中，如 有12%以上的脫脂乳固形物時，貯藏及銷售中會產(chǎn)生乳糖結(jié)晶，此結(jié)晶在口中呈砂樣感，降 低了商品價值，乳脫脂固形物為16%，用酶分解其50%的乳糖后，在冰箱中放置四個月仍 穩(wěn)定，而且增加了甜味，冰淇淋混和物中的砂糖可減少1 2%用量。此外，水解乳清和乳糖在 三明治、軟飲料和紡織品上漿中都有很大的用途，在紡織上漿中使用水解乳清省去使用白 蛋白，降低生產(chǎn)成本。 近年來，利用|3 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶生產(chǎn)低聚半乳糖也受到重視。因此， P-D-半乳糖苷半乳糖水解酶在食品工業(yè)中作用日益顯著。但目前P-D-半乳糖苷半乳 糖水解酶并未在食品工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用，主要原因是目前P -D-半乳糖苷半乳糖水 解酶的產(chǎn)量較低，銷售價格過高，添加成本昂貴。市場上銷售的P-D-半乳糖苷半乳糖水 解酶主要來源于酵母，此種酶耐熱性差，適用范圍窄，不能滿足食品工業(yè)多方面的需要。隨 著基因工程技術(shù)的發(fā)展，尋找研制出成本低，產(chǎn)量高，熱穩(wěn)定性強，更合適食品工業(yè)生產(chǎn)的 P -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，已成為研究熱點。綜上所述，采用低成本生產(chǎn)適合乳品工業(yè) 使用的P -D-半乳糖苷半乳糖水解酶是當(dāng)前食品工業(yè)很迫切的事。 中國專利(申請?zhí)?2108141. 7)公開了一種重組酵母菌制備P _D_半乳糖苷半乳 糖水解酶的方法，該方法利用3升發(fā)酵罐發(fā)酵，最高效價為3600U/ml發(fā)酵液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種制備13 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的方法及其專 用菌株。 本發(fā)明的專用菌株為巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)LACO Y12，該菌株已于 2010年2月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地 址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為 CGMCC No. 3630。 本發(fā)明所提供的制備13 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的方法，包括如下步驟誘導(dǎo) 發(fā)酵巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)LACO Y12 CGMCC NO. 3630，得到P-D-半乳糖苷半 乳糖水解酶。
上述過程中，所述誘導(dǎo)發(fā)酵的方法包括如下步驟 1)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加復(fù)合微量元素，再接種巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)LACO Y12 CGMCC NO. 3630，培養(yǎng)16-18小時； 2)向步驟l)的發(fā)酵體系中流加葡萄糖和復(fù)合微量元素的混合溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3-5小時； 3)向步驟2)的發(fā)酵體系中流加甲醇，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到P-D-半乳糖苷半乳糖 水解酶； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、 葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l-100g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng) 基中的濃度為10g/l-30g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l-20g/l，磷酸二氫鉀在 發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3g/l-7g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 2g/l-1.5g/l，氫 氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 5g/l-2. 5g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/
l-100g/1 ; 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生 物素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為20g/l-80g/l，氯化鋅在所 述復(fù)合微量元素中的濃度為5g/l-30g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為lg/ l-10g/l，一水硫酸錳在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 5g/l-5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微 量元素中的濃度為0. lg/1-l. 5g/l，生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. lg/1-O. 5g/ 1。 上述過程中，所述步驟2)中，所流加的葡萄糖的總量占所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積的 15%-25% (體積百分含量)，優(yōu)選為20%。 上述過程中，所述步驟3)中，所流加的甲醇總量占所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積的 70-80% (體積百分含量)，優(yōu)選為75%。 上述過程中，所述步驟2)中，所述葡萄糖在所述葡萄糖和復(fù)合微量元素的混合溶 液中的濃度為350g/L-550g/L，優(yōu)選為450g/L ;所述復(fù)合微量元素在所述葡萄糖與復(fù)合微 量元素的混合溶液中的濃度為(6ml-10ml) /1L，優(yōu)選為7. 5ml/L ;所述葡萄糖和復(fù)合微量 元素的混合溶液的流加速度為12ml/hr/L-24ml/hr/L，優(yōu)選為14ml/hr/L-20ml/hr/L，優(yōu)選 為16ml/hr/L-18ml/hr/L ;所述步驟2)中，所述培養(yǎng)的過程中，所述發(fā)酵體系的溶氧量為 20%-30% (體積百分含量)，優(yōu)選為25%。 上述過程中，所述步驟3)中，流加過程中，使添加的甲醇在發(fā)酵體系中的濃度保 持在O. 1%-0.5% (體積百分含量)，優(yōu)選為0.3% ;所述步驟3)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程 中，發(fā)酵體系的溶氧量為20% -30% (體積百分含量)，優(yōu)選為25%。 上述過程中，所述步驟3)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的時間為90-120小時，優(yōu)選為96小時 或100小時。 上述過程中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為如下培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸 二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60g/l， 硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為17. 2g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15. 85g/l，磷 酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 93g/l，氫氧 化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1.6g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為50g/l ;
所述發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、 葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的 濃度為10g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為3g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 2g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為
50. 5g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為30g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為7g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1.5g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2. 5g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100g/l ; 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生物素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為70g/l，氯化鋅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為25g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為8g/l，一水硫酸錳在所述復(fù)合微量元素中的濃度為2. 5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 7g/l，生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 3g/1 ; 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生物素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為20g/l，氯化鋅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為5g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為lg/l，一水硫酸錳在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. lg/1，生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. lg/1 ; 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生物素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為80g/l，氯化鋅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為30g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為10g/l，一水硫酸錳在所述復(fù)合微量元素中的濃度為5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為1. 5g/1，生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 5g/1。
上述過程中，所述誘導(dǎo)發(fā)酵是在50L發(fā)酵罐中進行的。 本發(fā)明所提供的菌株為重組酵母菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)LACOY12，其保藏編號為CGMCC NO. 3630。 本發(fā)明的重組菌株具有非常高的產(chǎn)P-D-半乳糖苷半乳糖水解酶能力，產(chǎn)率高，可達7000U/ml發(fā)酵液；本發(fā)明制備13 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的方法中，在發(fā)酵的過程中用高濃度的葡萄糖補料，使菌體增殖速度加快；減少了現(xiàn)有技術(shù)中碳源-甲醇混合飼喂的步驟，而代之以流加大量的甲醇，使菌產(chǎn)酶提前，即縮短了發(fā)酵周期；使用的復(fù)合微量元素與現(xiàn)有技術(shù)相比，種類少，用量少，大大降低了成本；將液態(tài)氨作為氮源，既降低了成本，又便于操作，減少了雜菌污染的機會。因此，本發(fā)明重組菌及制備P-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的方法在P -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的生產(chǎn)領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。


圖1為50升罐進行發(fā)酵的發(fā)酵曲線。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 實施例1、重組酵母菌的制備
質(zhì)粒pPIC9購自農(nóng)科院生物技術(shù)研究所。 按照專利(申請?zhí)?2108141. 7)中所述的方法構(gòu)建重組酵母菌，將乳糖酶的編碼基因?qū)胼d體pPIC9中，再轉(zhuǎn)化酵母菌株GS115，篩選得到重組酵母菌。將其中產(chǎn)酶效果好的一株記作巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)LACO Y12 ; 該菌株LAC0 Y12已于2010年2月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 3630，分類命名為巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)。 對照菌的制備將空載體pPIC9轉(zhuǎn)入酵母菌Pichia.pastoris GS115中，得到重組菌，記作GS115-pPIC9。 實施例2、制備13 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶
—、發(fā)酵重組酵母菌的方法 本實驗為重組酵母在50升發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)13 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶。 1、種子培養(yǎng)將重組酵母菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) LAC0 Y12CGMCCNo. 3630接種于預(yù)培養(yǎng)基中，3(TC搖床培養(yǎng)24小時，得到種子培養(yǎng)液。
預(yù)培養(yǎng)基的組成由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸f丐、氫氧化鉀、葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為17. 2g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15. 85g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 93g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1.6g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為50g/l。
2、發(fā)酵培養(yǎng) 1)菌株培養(yǎng)階段向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加復(fù)合微量元素，使復(fù)合微量元素與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為4.37ml : 1L，再按8X的接種量向其中接入種子培養(yǎng)液，攪拌培養(yǎng)16hr。在此培養(yǎng)的過程中，向發(fā)酵體系中加入液態(tài)氨，以使發(fā)酵體系的pH值保持在5. 0，同時液態(tài)氨也作為菌株生長的氮源。在此培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基中的溶氧由100%逐漸降低，當(dāng)碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80%以上，然后進入碳源飼喂階段。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基為如下培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為17. 2g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15. 85g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 93g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1. 6g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為50g/l。 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生物素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為70g/l，氯化鋅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為25g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為8g/l，一水硫酸錳在所述復(fù)合微量元素中的濃度為2. 5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 7g/l，生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 3g/1。 生物素購自北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為14J0102 ; 2)碳源飼喂階段步驟1)完成后，向步驟1)的發(fā)酵體系中流加葡萄糖和復(fù)合
7微量元素的混合溶液，混合溶液的流加速度為16ml/hr/L，葡萄糖在混合溶液中的濃度為450g/l，葡萄糖的流加總量占初始的發(fā)酵培養(yǎng)基體積(即30L)的20% (體積百分含量)，復(fù)合微量元素在混合溶液中的濃度為7. 5ml/L ;此培養(yǎng)過程中，通氣使發(fā)酵體系的溶氧量保持在25% (體積百分含量)；此培養(yǎng)過程的時間為5hr。 3)誘導(dǎo)表達階段步驟2)完成后，向發(fā)酵體系中流加甲醇繼續(xù)培養(yǎng)，使甲醇在發(fā)酵體系中的濃度保持在0.3% (體積百分含量)，甲醇的流加總量占初始的發(fā)酵培養(yǎng)基體積(即30L)的75% (體積百分含量)；此過程中，通氣使發(fā)酵體系的溶氧量保持在25% (體積百分含量)。在此誘導(dǎo)過程中每12個小時取樣一次測定表達的P-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的累積量及酶活。共誘導(dǎo)表達100小時。 二、取上述發(fā)酵過程中，誘導(dǎo)不同時間的發(fā)酵液進行SDS-PAGE分析，檢測酶的表
三、蛋白的酶活性檢測(即酶的效價檢測) 酶活定義1單位乳糖酶為在pH5. 2、60。C下每分鐘分解oNPG產(chǎn)生liimol的oNP(鄰硝基酚)所需要的酶量； 酶活檢測方法1.取0. 5ml發(fā)酵液，稀釋100倍，得到酶檢測液。2.吸取底物溶液(2. 5g/L的oNPG的水溶液)800iiL放在試管中，在6(TC的水浴中平衡3min。 3.在誘導(dǎo)表達的不同時間點，吸取200iiL待測酶檢測液加入試管中，震蕩混勻。在空白對照管中加入200 ii L的0. 1M、pH5. 2、HAc-NaAc緩沖液。4. 15min反應(yīng)之后，吸取lmL的10% TCA溶液加入每個試管中，震蕩混勻。5.從水浴鍋中取出反應(yīng)液試管，每個試管中加入lmol/L的Na^03溶液2mL。 6.反應(yīng)液置于lcm光程的比色皿中，用分光光度計測定420nm下的吸光值，記錄數(shù)據(jù)。 實驗組用由重組菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)LACO Y12的發(fā)酵液稀釋得到的酶檢測液進行實驗。 對照組用由對照菌GS115-pPIC9的發(fā)酵液稀釋得到的酶檢測液進行實驗。
換算公式根據(jù)乳糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出乳糖酶酶活單位計算公式
酶活力(U/ml) = (YX5XN)/15 Y :生成產(chǎn)物oNP的量(ii mol)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計算得出?？蓪?20nm光吸收
值X(扣除空白對照)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得到Y(jié)值。 5 :將200 ii L稀釋酶液中的酶活折算為lmL酶液的活性。 N :酶液的稀釋倍數(shù) 15:反應(yīng)時間，min。 共進行5罐批實驗，結(jié)果取平均數(shù)。酶的效價與誘導(dǎo)時間的關(guān)系如圖l所示。結(jié)果平均13 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的表達量為8mg/ml發(fā)酵液；誘導(dǎo)表達100小時，平均效價為7000U/ml發(fā)酵液；酶比活為875U/mg ;發(fā)酵周期(從接種至發(fā)酵完畢)為121小時。
同時在相同的條件下發(fā)酵對照菌GS115-pPIC9，作為對照組。對照組中沒有檢測到酶活性蛋白。 實施例3、制備13 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶
—、發(fā)酵重組酵母菌的方法 本實驗為重組酵母在50升發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)13 -D-半乳糖苷半乳糖水解
8酶。 1、種子培養(yǎng)方法與實施例2中所述相同，其中預(yù)培養(yǎng)基組成由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為
0. 2g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 5g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/1。 2、發(fā)酵培養(yǎng) 1)菌株培養(yǎng)階段。向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加復(fù)合微量元素，使復(fù)合微量元素與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為4.37ml : 1L，再按5X的接種量向其中接入種子培養(yǎng)液，攪拌培養(yǎng)18hr。在此培養(yǎng)的過程中，向發(fā)酵體系中加入液態(tài)氨，以使發(fā)酵體系的pH值保持在5. 0，同時液態(tài)氨也作為菌株生長的氮源。在此培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基中的溶氧由100%逐漸降低，當(dāng)碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80%以上，然后進入碳源飼喂階段。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為10g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為3g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 2g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 5g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l ; 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生物素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為20g/l，氯化鋅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為5g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為lg/l，一水硫酸錳在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. lg/1，生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. lg/1。 2)碳源飼喂階段。步驟1)完成后，向步驟l)的發(fā)酵體系中流加葡萄糖和復(fù)合微量元素的混合溶液，混合溶液的流加速度為12ml/hr/L，葡萄糖在混合溶液中的濃度為350g/L，葡萄糖的流加總量占初始的發(fā)酵培養(yǎng)基體積(即30L)的15% (體積百分含量)，復(fù)合微量元素在混合溶液中的濃度為6ml/L ;此培養(yǎng)過程中，發(fā)酵體系的溶氧量為20% (體積百分含量)；此培養(yǎng)過程的時間為3hr。 3)誘導(dǎo)表達階段。步驟2)完成后，向發(fā)酵體系中流加甲醇繼續(xù)培養(yǎng)，使甲醇在發(fā)酵體系中的濃度保持在O. 1% (體積百分含量)，甲醇的流加總量占初始的發(fā)酵培養(yǎng)基體積(即30L)的70% (體積百分含量)；此過程中，通氣使發(fā)酵體系的溶氧量保持在20% (體積百分含量)。在此誘導(dǎo)過程中每12個小時取樣一次測定表達的P-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的累積量及酶活。共誘導(dǎo)表達100小時。 取誘導(dǎo)不同時間的發(fā)酵液進行SDS-PAGE分析，檢測酶的表達量并進行酶活分析，方法與實施例2中所述一致。 共進行5罐批實驗，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果平均13 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的表達量為7. 5mg/ml發(fā)酵液；發(fā)酵誘導(dǎo)表達100小時，平均效價為6500U/ml發(fā)酵液；酶比活為866. 7U/mg ;發(fā)酵周期(從接種至發(fā)酵完畢)為121小時。 同時在相同的條件下發(fā)酵對照菌GS115-pPIC9，作為對照組。對照組中沒有檢測到
9酶活性蛋白。 實施例4、制備|3 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶
—、發(fā)酵重組酵母菌的方法 本實驗為重組酵母在50升發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)13 -D-半乳糖苷半乳糖水解 酶。 1、種子培養(yǎng)方法與實施例2中所述相同，其中預(yù)培養(yǎng)基組成由磷酸二氫銨、 硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng) 基中的濃度為100g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為30g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的 濃度為20g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為7g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度 為1. 5g/1，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2. 5g/1，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 100g/l。 2、發(fā)酵培養(yǎng) 1)菌株培養(yǎng)階段。向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加復(fù)合微量元素，使復(fù)合微量元素與發(fā)酵培 養(yǎng)基的體積比為4.37ml : 1L，再按8X的接種量向其中接入種子培養(yǎng)液，攪拌培養(yǎng)16hr。 在此培養(yǎng)的過程中，向發(fā)酵體系中加入液態(tài)氨，以使發(fā)酵體系的pH值保持在5. 0，同時液態(tài) 氨也作為菌株生長的氮源。在此培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基中的溶氧由100%逐漸 降低，當(dāng)碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80%以上，然后進入碳源飼喂階段。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、 葡萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的 濃度為30g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為7g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1.5g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 2. 5g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100g/l ; 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生 物素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為80g/l，氯化鋅在所述復(fù)合 微量元素中的濃度為30g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為10g/l，一水硫酸 錳在所述復(fù)合微量元素中的濃度為5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為1. 5g/1， 生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 5g/1。 2)碳源飼喂階段。步驟1)完成后，向步驟1)的發(fā)酵體系中流加葡萄糖和復(fù)合微量 元素的混合溶液，混合溶液的流加速度為24ml/hr/L，葡萄糖在混合溶液中的濃度為550g/ L，葡萄糖的流加總量占初始的發(fā)酵培養(yǎng)基體積(即30L)的25% (體積百分含量)，復(fù)合 微量元素在混合溶液中的濃度為10ml/L ;此培養(yǎng)過程中，通氣使發(fā)酵體系的溶氧量保持在 30% (體積百分含量)；此培養(yǎng)過程的時間為5hr。 3)誘導(dǎo)表達階段。步驟2)完成后，向發(fā)酵體系中流加甲醇繼續(xù)培養(yǎng)，使甲醇在發(fā) 酵體系中的濃度保持在0.5% (體積百分含量)，甲醇的流加總量占初始的發(fā)酵培養(yǎng)基體積 (即30L)的80% (體積百分含量)；此過程中，，通氣使發(fā)酵體系的溶氧量保持在30% (體 積百分含量)。在此誘導(dǎo)過程中每12個小時取樣一次測定表達的P-D-半乳糖苷半乳糖水 解酶的累積量及酶活。共誘導(dǎo)表達100小時。 取誘導(dǎo)不同時間的發(fā)酵液進行SDS-PAGE分析，檢測酶的表達量并進行酶活分析， 方法與實施例2中所述一致。
10
共進行5罐批實驗，結(jié)果取平均數(shù)。結(jié)果平均13 -D-半乳糖苷半乳糖水解酶的表 達量為7. 8mg/ml發(fā)酵液；發(fā)酵誘導(dǎo)表達100小時，平均效價為6800U/ml發(fā)酵液；酶比活為 871. 8U/mg ;發(fā)酵周期(從接種至發(fā)酵完畢)為121小時。 同時在相同的條件下發(fā)酵對照菌GS115-pPIC9，作為對照組。對照組中沒有檢測到 酶活性蛋白。
權(quán)利要求
一種制備β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的方法，包括如下步驟誘導(dǎo)發(fā)酵巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)LACO Y12 CGMCC NO.3630，得到β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)發(fā)酵的方法包括如下步驟1) 向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加復(fù)合微量元素，再接種巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris) LACO Y12 CGMCC NO. 3630，培養(yǎng)16-18小時；2) 向步驟l)的發(fā)酵體系中流加葡萄糖和復(fù)合微量元素的混合溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3-5小時；3) 向步驟2)的發(fā)酵體系中流加甲醇，進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到13-D-半乳糖苷半乳糖水解酶；所述發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡萄 糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l-100g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中 的濃度為10g/l-30g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l-20g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵 培養(yǎng)基中的濃度為3g/l-7g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 2g/l-l. 5g/l，氫氧化鉀 在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 5g/l-2. 5g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l-100g/ 1 ;所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生物 素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為20g/l-80g/l，氯化鋅在所述 復(fù)合微量元素中的濃度為5g/l-30g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為lg/ l-10g/l，一水硫酸錳在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 5g/l-5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微 量元素中的濃度為0. lg/1-l. 5g/l，生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. lg/1-O. 5g/ 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所流加的葡萄糖的 總量占所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積的15% -25% (體積百分含量)，優(yōu)選為20%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所流加的甲醇總 量占所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積的70-80% (體積百分含量)，優(yōu)選為75%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述葡萄糖在 所述葡萄糖和復(fù)合微量元素的混合溶液中的濃度為350g/L-550g/L，優(yōu)選為450g/L ;所述 復(fù)合微量元素在所述葡萄糖與復(fù)合微量元素的混合溶液中的濃度為(6ml-10ml)/lL，優(yōu)選 為7. 5ml/L ;所述葡萄糖和復(fù)合微量元素的混合溶液的流加速度為12ml/hr/L-24ml/hr/L， 優(yōu)選為14ml/hr/L-20ml/hr/L，優(yōu)選為16ml/hr/L-18ml/hr/L ;所述步驟2)中，所述培養(yǎng)的 過程中，所述發(fā)酵體系的溶氧量為20% -30% (體積百分含量)，優(yōu)選為25%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l-5中任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，流加過程中，使 添加的甲醇在發(fā)酵體系中的濃度保持在O. 1%-0.5% (體積百分含量)，優(yōu)選為0.3% ;所 述步驟3)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程中，發(fā)酵體系的溶氧量為20%-30% (體積百分含量)， 優(yōu)選為25%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l-6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng) 的時間為90-120小時，優(yōu)選為96小時或100小時。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基為下述1)、2) 和3)中的任一種，和/或所述復(fù)合微量元素為下述4) 、5)和6)中的任一種1) 所述發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡 萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為60g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為17. 2g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15. 85g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的 濃度為5g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 93g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度 為1. 6g/l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為50g/l ;2) 所述發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡 萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為10g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為5g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 3g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 2g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為0. 5g/ l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l ;3) 所述發(fā)酵培養(yǎng)基由磷酸二氫銨、硫酸鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氫氧化鉀、葡 萄糖和水組成；磷酸二氫銨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100g/l，硫酸鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃 度為30g/l，硫酸鎂在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為20g/l，磷酸二氫鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為 7g/l，硫酸鈣在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為1.5g/l，氫氧化鉀在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為2. 5g/ l，葡萄糖在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100g/l ;4) 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、 一水硫酸錳、氯化鈷、生物 素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為70g/l，氯化鋅在所述復(fù)合微 量元素中的濃度為25g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為8g/l，一水硫酸錳 在所述復(fù)合微量元素中的濃度為2. 5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 7g/1， 生物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 3g/1 ;5) 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、 一水硫酸錳、氯化鈷、生物 素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為20g/l，氯化鋅在所述復(fù)合微 量元素中的濃度為5g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為lg/l，一水硫酸錳在 所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. lg/l，生 物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. lg/1 ;6) 所述復(fù)合微量元素由七水硫酸亞鐵、氯化鋅、五水硫酸銅、一水硫酸錳、氯化鈷、生物 素和水組成；七水硫酸亞鐵在所述復(fù)合微量元素中的濃度為80g/l，氯化鋅在所述復(fù)合微 量元素中的濃度為30g/l，五水硫酸銅在所述復(fù)合微量元素中的濃度為10g/l，一水硫酸錳 在所述復(fù)合微量元素中的濃度為5g/l，氯化鈷在所述復(fù)合微量元素中的濃度為1. 5g/l，生 物素在所述復(fù)合微量元素中的濃度為0. 5g/1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述誘導(dǎo)發(fā)酵是在50L發(fā)酵罐 中進行的。
10. 重組酵母菌巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)LACO Y12，其保藏編號為CGMCC NO. 3630。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的方法及其專用菌株。本發(fā)明提供的制備β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的方法，包括如下步驟誘導(dǎo)發(fā)酵巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)LACO Y12 CGMCC NO.3630，得到β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶。本發(fā)明的重組菌株具有非常高的產(chǎn)β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶能力，產(chǎn)率高，可達7000U/ml發(fā)酵液；本發(fā)明制備β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶的方法中，在發(fā)酵的過程中用高濃度的葡萄糖補料，使菌體增殖速度加快；減少了現(xiàn)有技術(shù)中碳源-甲醇混合飼喂的步驟，而代之以流加大量的甲醇，使菌產(chǎn)酶提前，即縮短了發(fā)酵周期；使用的復(fù)合微量元素與現(xiàn)有技術(shù)相比，種類少，用量少，大大降低了成本；將液態(tài)氨作為氮源，既降低了成本，又便于操作，減少了雜菌污染的機會。
文檔編號C12N9/38GK101792751SQ20101011021
公開日2010年8月4日 申請日期2010年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月20日
發(fā)明者張偉, 畢建成, 許建立, 谷海先 申請人:中諾生物科技發(fā)展江蘇有限公司