專利名稱：制備阿藿烯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備阿藿烯(ajoene)的方法和包含可以通過(guò)該方法得到的阿藿烯的組合物。本發(fā)明也涉及用于制備蒜素的方法和用于冷凍濃縮蒜素的方法。背景大蒜作為烹飪草藥和食品使用已經(jīng)有千年。此外，大蒜具有許多藥用特性，并且其在民間作為藥物使用已經(jīng)有數(shù)千年。阿藿烯是從大蒜中得到的天然存在的化合物。更具體地，阿藿烯在蒜素的降解過(guò)程中形成，所述蒜素是化學(xué)不穩(wěn)定的、從無(wú)色至稻草色的油，該油被認(rèn)為是大蒜的許多氣味和生物活性的原因。完整無(wú)損的蒜瓣不含蒜素，而無(wú)氣味的前體蒜氨酸[(+)(s-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜)]含有蒜素。通過(guò)存在于大蒜植物中的稱為蒜氨酸酶的C-S-裂解酶將該前體轉(zhuǎn)化為蒜素。在蒜瓣的不同室中發(fā)現(xiàn)了蒜氨酸和蒜氨酸酶，而蒜瓣的切開(kāi)或破碎釋放出酶，使得蒜氨酸酶能夠與蒜氨酸接觸，從而將蒜氨酸轉(zhuǎn)化為蒜素。蒜素具有不穩(wěn)定性和揮發(fā)性，并且自然地將主要降解為二硫化二烯丙基、三硫化二烯丙基、二噻烯和阿藿烯。 在TO-A-2003/004668中描述了用于制備具有高收率和大體積的蒜素的方法，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。目前在多數(shù)研究領(lǐng)域中對(duì)阿藿烯感興趣，但主要在包括人類和動(dòng)物藥品在內(nèi)的醫(yī)藥領(lǐng)域。然而，已經(jīng)縮減了出于該目的的阿藿烯的研究和使用，因?yàn)楝F(xiàn)有的制備阿藿烯的方法對(duì)阿藿烯具有低的選擇性。因此，阿藿烯的制備成本昂貴而且收率相對(duì)較低。例如， US-A-5612077描述了利用食用油制備主要含有Z-阿藿烯的浸出物(macerate)的方法，但數(shù)量少且濃度低。US-A 5741932描述了采用環(huán)糊精制備阿藿烯的方法，該方法是一種復(fù)雜的多步驟方法并且生產(chǎn)的產(chǎn)量小濃度低。此外，對(duì)大蒜和其潛在用途的許多先前的研究對(duì)于活性劑并不具體，該活性劑通常被稱之為“大蒜提取物”或“大蒜油”。因此，需要用于獲得高收率、高產(chǎn)量并且成本合理的阿藿烯的改進(jìn)的方法。還需要用于獲得高收率、高產(chǎn)量并且成本合理的蒜素、即阿藿烯的前體的改進(jìn)的方法。發(fā)明概述根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及制備阿藿烯的方法，所述方法包括以下步驟將含有蒜素的酸性溶液加熱足夠的時(shí)間，使得蒜素的至少一部分被轉(zhuǎn)化為阿藿烯。在第二個(gè)方面，提供了包含阿藿烯的組合物，所述阿藿烯的含量基于組合物的總體積計(jì)為至少約30% w/Vo所述組合物可以通過(guò)本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法獲得。在第三個(gè)方面，提供了制備蒜素的方法，所述方法包括(i)機(jī)械處理蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源并且同時(shí)使經(jīng)機(jī)械處理的產(chǎn)物受到離心力的作用，從而將包含蒜氨酸酶的溶液與蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源分離；和(i)使包含蒜氨酸酶來(lái)源的溶液與蒜氨酸的水溶液接觸，由此使蒜氨酸在包含蒜氨酸酶的溶液中通過(guò)蒜氨酸酶經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)化為蒜素。在第四個(gè)方面，提供了制備蒜素的方法，該方法包括在約0°C至約30°C的溫度下，在過(guò)氧單硫酸鉀的存在下氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接著將所生成的蒜素提取至有機(jī)溶劑中。本發(fā)明的第三和第四個(gè)方面的方法可以用于提供包含蒜素的溶液，所述蒜素在本發(fā)明的第一個(gè)方面被轉(zhuǎn)化為阿藿烯。根據(jù)第五個(gè)方面，提供了提高在蒜素的水溶液中蒜素濃度的方法，所述方法包括冷凍蒜素的水溶液，從而增加蒜素的濃度。發(fā)明詳述制備阿蕾烯的方法根據(jù)上述第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及制備阿藿烯的方法，所述方法包括以下步驟將包含蒜素的酸性溶液加熱足夠的時(shí)間，使得蒜素的至少一部分被轉(zhuǎn)化為阿藿烯。將蒜素轉(zhuǎn)化為阿藿烯的步驟包括將包含蒜素的酸性溶液溫和加熱足夠的時(shí)間， 使得蒜素的至少一部分被轉(zhuǎn)化為阿藿烯。在加熱步驟過(guò)程中的溫度足以引起蒜素轉(zhuǎn)化為阿藿烯(據(jù)信通過(guò)該方法，兩個(gè)分子的蒜素縮合形成一個(gè)分子的阿藿烯，以及其他化合物例如乙烯基二噻烯(vinyl dithiin))。加熱步驟可以在約室溫至約80°C的溫度下進(jìn)行。例如， 加熱步驟可以在約30°C至約80°C，例如約40°C至約70°C的溫度下進(jìn)行。加熱步驟可以在約35 °C至約45 V、或約40 V至約50 V、或約45 °C至約55 °C、或約50 V至約60 V、或約55 °C 至約65°C的溫度下進(jìn)行。在實(shí)施方案中，加熱步驟可以在約30°C、或約40°C、或約50°C、或約60°C的溫度下進(jìn)行。一般地，在加熱足夠的時(shí)間直至反應(yīng)完成或者已經(jīng)獲得需要的轉(zhuǎn)化水平的過(guò)程中，緩慢攪拌包含蒜素的溶液。由蒜素轉(zhuǎn)化為阿藿烯的程度，可以例如通過(guò)采用以下概述的HPLC法并通過(guò)監(jiān)測(cè)蒜素和/或阿藿烯的UV吸收光譜來(lái)監(jiān)測(cè)。通常，溫度越高， 將蒜素轉(zhuǎn)化成阿藿烯所需要的時(shí)間就越短?？梢赃M(jìn)行加熱步驟約1至約10小時(shí)，例如約3 至約8小時(shí)的時(shí)間。在實(shí)施方案中，加熱步驟進(jìn)行約4小時(shí)、或約4. 5小時(shí)、或約5小時(shí)、或約5. 5小時(shí)、或約6小時(shí)、或約6. 5小時(shí)、或約7小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，大部分蒜素被轉(zhuǎn)化為阿藿烯。所謂大部分是指起始溶液中至少50%的蒜素被轉(zhuǎn)化為阿藿烯，例如可以通過(guò)以下概述的HPLC法測(cè)定。例如，可以進(jìn)行加熱步驟直至起始溶液中至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%的蒜素被轉(zhuǎn)化為阿藿烯。有利地，大體上所有的蒜素被轉(zhuǎn)化為阿藿烯。所謂大體上所有的是指加熱步驟持續(xù)至采用以下概述的HPLC法檢測(cè)不到阿藿烯為止。在加熱步驟過(guò)程中溫和攪拌溶液，例如通過(guò)緩慢攪拌使成分混合。優(yōu)選地，控制攪拌的程度以防止乳液的形成。例如，如果乳液開(kāi)始形成，則可能降低攪拌的程度(即降低至緩和的攪拌程度)或者甚至停止攪拌直到任何乳液澄清為止。所述方法還可以包括例如在真空下去除有機(jī)溶劑從而得到包含阿藿烯的油餾分， 阿藿烯的量基于油餾分的總體積計(jì)為至少約30% w/v(即油餾分中每升液體中阿藿烯的克數(shù))?？梢栽谌コ軇┲斑^(guò)濾包含阿藿烯的溶液以去除任何殘留固體物質(zhì)。例如，可以通過(guò)30cm 13 Whatman紙濾器過(guò)濾包含阿藿烯的溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用醇水溶液和非極性烷烴溶劑例如戊烷，按體積計(jì)以1 1 或2 1的比例分割剛剛轉(zhuǎn)化的包含阿藿烯的溶液。該處理去除了任何非極性蒜素代謝物， 例如聚硫化物和乙烯基二噻烯(vinylditihins)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在真空下，在約40至80°C，優(yōu)選地在約50°C的溫度下來(lái)減少溶劑。這生成了水溶液和不溶性的漿。在轉(zhuǎn)化步驟中使用的酸可以通過(guò)逐滴加入堿，例如， 諸如氫氧化鈉等強(qiáng)堿進(jìn)行中和。然后，用醚例如甲基叔丁基醚(TBME)，按體積計(jì)以約2 1 至約1 1的比例提取所述的溶液和漿。提取可以最多進(jìn)行三次以確保完全提取。包含蒜素的溶液可以含有至少約2000ppm的蒜素，例如至少約5000ppm的蒜素，例如至少約7000ppm的蒜素，例如至少約IOOOOppm的蒜素。有利地，包含蒜素的溶液可以含有至少約15000ppm的蒜素，例如至少約17000ppm，或者例如至少約20000ppm的蒜素。所述的溶液通常包含小于約25000ppm的蒜素，例如小于約22000ppm的蒜素。如下所述，在包含蒜素的溶液中的蒜素可以得自大蒜，所述的大蒜可以是硬頸 (hard-necked)或軟頸(soft-necked)大蒜。硬頸大蒜的品種包括胡蒜(Rocambole)、瓷蒜(Porcelain)、紫紋蒜(Purple Stripe)(有時(shí)稱之為紫條蒜“Purple Streak”)、大理石紫紋蒜(Marbled Purple Mripe)、釉紫紋蒜(Glazed Purple Mripe)、純白大蒜(Pure White)和珍珠白大蒜(Pearl white) 0軟頸大蒜的品種包括洋薊蒜(Artichoke)、亞洲蒜(Asiatic)、扁大蒜(Turban)、銀皮蒜(Silverskin)和克利奧爾銀皮蒜(Silverskin Creole) 0有利地，蒜素得自硬頸大蒜，例如純白大蒜(Pure White)或珍珠白大蒜(Pearl white)(例如，得自中國(guó)的Tiashan地區(qū)的純白大蒜或珍珠白大蒜)。與在非酸性溶液中的轉(zhuǎn)化相比，在對(duì)其加熱并將其轉(zhuǎn)化為阿藿烯的蒜素的酸性溶液中的，當(dāng)蒜素得自硬頸大蒜時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)阿藿烯的收率得到顯著改善(收率增加大約20-25% )。包含被轉(zhuǎn)化為阿藿烯的蒜素的溶液是酸性溶液。包含蒜素的溶液的PH可以為約 5或更小，或者小于5。有利地，包含蒜素的溶液的pH為約3至約5，或者約3至小于5，或者約3至約4。 所述溶液的PH可以大于約2。在實(shí)施方案中，包含蒜素的溶液的pH為約3，或者約4，或者約5?？梢酝ㄟ^(guò)添加適量的適合酸使包含蒜素的溶液酸化為期望的pH。溶液中的蒜素通常具有弱酸的PH。因此，酸的適量是引起包含蒜素的溶液的pH降低至期望的pH的量。酸可以是任何適合的有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的酸為具有小于約5的pKa的強(qiáng)酸。所述的酸可以是選自乙酸、磷酸、硫酸和鹽酸中的一種或多種酸。溶液中酸的量可以為約0. 至5% (ν/ν)。在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液中酸的量可以為約(ν/ ν)。有利地，所述酸為乙酸，例如冰醋酸。該酸具有相對(duì)的揮發(fā)性，并且因此在完成轉(zhuǎn)化步驟之后可以容易地從溶液中去除。在特別有利的實(shí)施方案中，蒜素的溶液包含乙酸，優(yōu)選地冰醋酸，其含量為1份冰醋酸/100份溶液并且具有的PH為約4。所述溶液還包含丙酮和水。在不希望受理論的束縛的同時(shí)，據(jù)信酸作為質(zhì)子供體促進(jìn)蒜素轉(zhuǎn)化為阿藿烯。有利地，在約3至約5，或者約3至小于5的pH下的酸性條件得到更加干凈的阿藿烯產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含較少的雜質(zhì)例如二硫化二烯丙基，以及更高的聚硫化物。包含蒜素的溶液有利地包含適合于將阿藿烯溶劑化的溶劑。適合的溶劑是醇、醚和酮。優(yōu)選的醇包括甲醇、乙醇和丙醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶劑是丙酮。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶劑是丁醇。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶劑是丁酮。在又一個(gè)實(shí)施方案中， 所述有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)小于約100°c，例如小于約90°C、例如小于約80°C、例如小于約70°C、例如小于約60°C。有機(jī)溶劑的量可以為約40%至70% (ν/ν)，且余量為水和酸。阿藿烯以兩種同分異構(gòu)體形式(順式(Z)和反式(E))存在，并且將通常作為兩種同分異構(gòu)體的混合物被分離。然而，可以根據(jù)需要的阿藿烯的Z E比例來(lái)選擇溶劑。丙酮通常得到包含約1 3比例的Z和E同分異構(gòu)體的產(chǎn)品，而作為溶劑的丁醇可以用于獲得具有大于約4 1的Ζ. E比例的產(chǎn)品。包含蒜素和酸的溶液可以包含蒜素、酸、有機(jī)溶劑和水、由它們組成或者大體上由它們組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法的加熱步驟在不存在油，例如食用油的條件下進(jìn)行。本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法使得以高收率制備和分離阿藿烯成為可能，并且其量最高至采用現(xiàn)有的生產(chǎn)方法可以單獨(dú)由大蒜產(chǎn)生的量的約8倍。最大理論收率為兩分子的蒜素得到一分子的阿藿烯。通過(guò)本發(fā)明的方法或得到的一般收率為每四分子的蒜素得到大約一分子的阿藿烯。本發(fā)明的方法也使得以相對(duì)高的量制備和分離阿藿烯成為可能。此外，本發(fā)明的方法使得以相對(duì)高濃度和純度制備和分離阿藿烯成為可能。所謂的高純度，我們是指在去除溶劑之后產(chǎn)生的油餾分包含，按溶液中液體的重量/體積(W/V)計(jì)，至少約30%的量的阿藿烯。在實(shí)施方案中，油餾分包含35% w/v阿藿烯，例如至少約40% w/v阿藿烯，例如至少約45% w/v阿藿烯，例如至少約50% w/v阿藿火布。所述方法還可以包括，例如使用硫酸鎂干燥包含阿藿烯的油餾分和將干燥的油殘留物懸浮于食用油中以形成食用油浸出物(macerate)，所述的食用油浸出物基于油浸出物的總體積以重量/體積計(jì)包含高達(dá)約5%的阿藿烯。在一個(gè)實(shí)施方案中，以重量/體積計(jì)油浸出物包含高達(dá)約4%的阿藿烯。食用油可以是植物油、動(dòng)物油或脂肪、氫化植物油或動(dòng)物脂肪或者合成油或脂肪。優(yōu)選使用液態(tài)油，例如橄欖油。在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用的是橄欖油并且油浸出物包含高達(dá)約4%的阿藿烯(w/v)。依據(jù)最終使用者和應(yīng)用，可以利用適合于使用的油將食用油浸出物進(jìn)一步稀釋至 IOOppm到500ppm的阿藿烯。當(dāng)進(jìn)行適當(dāng)包裝并且例如作為健康補(bǔ)品使用或其他應(yīng)用時(shí)，該產(chǎn)品可以穩(wěn)定至少2年?？梢酝ㄟ^(guò)以下另外的步驟實(shí)現(xiàn)所得到的阿藿烯的進(jìn)一步純化將油殘留物懸浮在有機(jī)極性溶劑中，例如二乙醚，以及與水分離，引起通常以聚硫化物形式存在的非極性化合物的去除?？梢酝ㄟ^(guò)加入(例如，逐滴加入)適量的堿例如氫氧化鈉來(lái)中和任何殘留酸。在所述方法中的任何階段，可以過(guò)濾和/或離心各種溶液以去除固體沉積物，例如在原始蒜素溶液中包含的植物碎屑。制備蒜素的方法在本發(fā)明的第一個(gè)方面的實(shí)施方案中，并根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，通過(guò)包括以下步驟的方法提供了包含蒜素的溶液i)機(jī)械處理蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源并且同時(shí)使經(jīng)機(jī)械處理的產(chǎn)物受到離心力的作用，由此將包含蒜氨酸酶的溶液與蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源分離；和ii)使包含蒜氨酸酶來(lái)源的溶液與蒜氨酸的水溶液接觸，從而使蒜氨酸在包
8含蒜氨酸酶的溶液中通過(guò)蒜氨酸酶經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)化為蒜素。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(i)在離心式榨汁機(jī)中進(jìn)行，而步驟(ii)可以同時(shí)伴隨至少部分步驟(i)進(jìn)行。離心式榨汁機(jī)也稱為離心式汁液榨取器，通常包括可以以高速率旋轉(zhuǎn)的籃。所述籃具有將蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源(例如蒜瓣，可以對(duì)其去皮或不去皮) 研磨為軟塊或漿料的齒。由于籃以高速度旋轉(zhuǎn)，因此使?jié){料在籃的相反方向拋出。籃的側(cè)面是多孔的，因此允許使用離心力使?jié){料中的液體與漿分離。收集液體溶液(包含蒜氨酸酶)并隨后使其與蒜氨酸溶液接觸。適合的離心式榨汁機(jī)的例子是JE700Proline(RTM) Domestic Juicer。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，一些固體物質(zhì)在分離過(guò)程中可以穿過(guò)孔?？梢酝ㄟ^(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒ɡ邕^(guò)濾和/或離心從蒜氨酸酶溶液中去除任何固體物質(zhì)。出人意料地發(fā)現(xiàn)，使用離心式榨汁機(jī)提供了超過(guò)現(xiàn)有方法的益處。首先，固體植物材料與蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源的液體成分的快速分離使得在其轉(zhuǎn)化為蒜素之前和其轉(zhuǎn)化為蒜素的過(guò)程中蒜氨酸酶的較大溫度控制成為可能，而且也意味著液體成分中的蒜氨酸酶能夠與水性蒜氨酸溶液很快接觸，所述很快通常在約5-30秒的機(jī)械處理時(shí)間內(nèi)，例如在約10-20秒，或者在約10秒內(nèi)的機(jī)械處理時(shí)間?，F(xiàn)有技術(shù)中，W0-A-2003/004668中的共混方法，雖然在那時(shí)能夠生成之前不能實(shí)現(xiàn)水平的蒜素，但共混的原材料(即大蒜)在相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間被共混 (即大約數(shù)分鐘)，這引起溫度升高(通常使包含蒜氨酸酶的溶液的溫度升至約35°C)。相比之下，使用離心式榨汁機(jī)較快地處理原材料意味著溫度有少許或者沒(méi)有升高。因此，在生成的溶液中的蒜氨酸酶很少會(huì)降解，而且將蒜氨酸酶溶液加入到蒜氨酸溶液中一般將不引起任何顯著性的溫度升高，其反過(guò)來(lái)意味著形成的蒜素也將很少會(huì)降解。此外，在生成蒜氨酸酶溶液和與蒜氨酸溶液接觸之間的時(shí)間減少意味著對(duì)于蒜氨酸酶來(lái)說(shuō)具有較少的時(shí)間在處理步驟期間引起自然產(chǎn)生的蒜氨酸的轉(zhuǎn)化。該結(jié)果是更加有效的方法，該方法導(dǎo)致制備的蒜素在產(chǎn)量和純度方面至少與W0-A-2003/004668中描述的方法一樣好并且優(yōu)選地大于TO-A-2003/004668中描述的方法，并且具有由于蒜氨酸酶溶液與天然來(lái)源的蒜氨酸酶的快速分離而引起大量減少的反應(yīng)次數(shù)的另外優(yōu)點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源按照步驟(i)和步驟(ii)處理并且同時(shí)與蒜氨酸的水溶液接觸。因此，該方法連續(xù)地進(jìn)行，蒜氨酸酶的新鮮天然植物來(lái)源被榨汁，同時(shí)包含蒜氨酸酶的溶液被進(jìn)料至包含蒜氨酸的水溶液的反應(yīng)器中。用于本發(fā)明方法中的蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源可以得自蔥屬植物，通常是其鱗莖部分。最優(yōu)選地，蔥屬植物是大蒜(Allium Sativum)，大蒜容易獲得且價(jià)格便宜，同時(shí)具有相對(duì)高濃度的蒜氨酸酶。大蒜可以是硬頸大蒜或軟頸大蒜。硬頸大蒜的品種包括胡蒜 (Rocambole)、瓷蒜(Porcelain)、紫紋蒜(Purple Stripe)(有時(shí)稱之為“紫條蒜” (Purple Mreak))、大理石紫紋蒜(Marbled Purple Stripe)、釉紫紋蒜(Glazed Purple Stripe)、 純白大蒜(Pure White)和珍珠白大蒜(Pearl white)。軟頸大蒜的品種包括洋薊蒜 (Artichoke)、亞洲蒜(Asiatic)、扁大蒜(Turban)、銀皮蒜(Silverskin)和克利奧爾銀皮蒜(Silverskin Creole)。有利地，蒜素得自硬頸大蒜，例如純白大蒜(Pure White)或珍珠白大蒜(Pearl white)(例如，得自中國(guó)的Tiashan地區(qū)的純白大蒜或珍珠白大蒜)。與在非酸性溶液中的轉(zhuǎn)化相比，在對(duì)其加熱并將其轉(zhuǎn)化為阿藿烯的蒜素的酸性溶液中，當(dāng)蒜素得自硬頸大蒜時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)阿藿烯的收率得到顯著改善(收率增加大約20-25% )。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，就蒜氨酸酶而言，大蒜的品質(zhì)可以隨著年限和生成大蒜的當(dāng)?shù)丨h(huán)境的變化而變化。技術(shù)人員將因此能夠直接進(jìn)行初級(jí)測(cè)試以建立任何給定來(lái)源的大蒜的品質(zhì)并確定其對(duì)于根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行處理來(lái)制備蒜素和阿藿烯的適用性。生大蒜通常是以可以以未去皮或去皮狀態(tài)處理的鱗莖和/或蒜瓣形式。優(yōu)選地， 在離心式榨汁機(jī)中進(jìn)行機(jī)械處理之前對(duì)生大蒜進(jìn)行去皮和清洗。在接觸步驟之后，對(duì)包含蒜氨酸酶和蒜氨酸的溶液攪拌約1至6小時(shí)，例如約2-4 小時(shí)，或者直到已經(jīng)實(shí)現(xiàn)蒜氨酸酶和蒜氨酸轉(zhuǎn)化為蒜素的期望水平。在攪拌過(guò)程中的溫度優(yōu)選地保持在約30°C?？梢岳绮捎靡韵赂攀龅姆椒ㄍㄟ^(guò)HPLC并通過(guò)監(jiān)測(cè)蒜素的UV吸收光譜來(lái)監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)化為蒜素的程度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，蒜素的最終濃度可以依據(jù)生大蒜的量和類型而變化。最終溶液可以包含至少約2000ppm蒜素，例如至少約5000ppm的蒜素，例如至少約IOOOOppm的蒜素，或者至少約12000ppm的蒜素，或者至少約15000ppm的蒜素，或者至少約17000ppm的蒜素，或者至少約20000ppm的蒜素。所產(chǎn)生的富含蒜素的溶液通常包含約IOOOOppm至22000ppm的蒜素，優(yōu)選地在轉(zhuǎn)化為阿藿烯之前澄清該溶液。澄清方法可以包含低溫沉淀、離心、過(guò)濾和/或添加鹽，或者它們的組合，從而從溶液中沉淀并去除任何蛋白質(zhì)、纖維和其他植物碎屑。該澄清方法一般改進(jìn)了將蒜素轉(zhuǎn)化為阿藿烯和任何隨后的純化步驟的總體過(guò)程。例如，可以使富含蒜素的溶液在低溫下例如在5°C以下靜止沉淀足夠的時(shí)間，例如約1-3天或例如約2天。之后，例如通過(guò)傾析去除清澈的上清液體?？梢酝ㄟ^(guò)離心去除沉淀中的任何殘留液體并在隨后將該殘留液體與上清液體結(jié)合。優(yōu)選地，將整個(gè)處理過(guò)程中的溫度保持在5°C以下。可以過(guò)濾包含蒜素的澄清的上清溶液。在轉(zhuǎn)化為阿藿烯之前，將澄清的蒜素溶液提取到有機(jī)溶劑例如丙酮中。優(yōu)選地，使有機(jī)溶劑冷凍至小于o°c的溫度。攪拌兩種液體一段時(shí)間以確保均化。優(yōu)選地始終將溫度保持在5°C或5°C以下。然后可以將丙酮水溶液在5°C以下，例如0°C以下或-5°c以下或者約-10°C以下的溫度靜止沉淀另外的一段時(shí)間，例如M小時(shí)并去除沉淀。然后可以通過(guò)添加適合的鹽例如氯化鈉使溶液成為鹽溶液，接著攪拌混合物，之后，允許溶液在低于10°C的溫度下靜止足夠的時(shí)間，從而使包含蒜素的有機(jī)溶劑層與鹽水層分離。優(yōu)選地，控制攪拌的程度以防止乳液的形成。例如，如果乳液開(kāi)始形成，則降低攪拌的程度(即降低至緩和的攪拌程度)或者甚至停止攪拌直到任何乳液澄清為止。供選擇地，可以去除乳液并離心至使兩相分離為兩層，隨后將該兩層傾析并返回至母液中。提取步驟可以重復(fù)兩次或三次。例如從水相中提取蒜素至溶劑相中，水相與溶劑相的比例為約1 1至約2 l(v/v)是合適的。在本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法的加熱步驟中可以使用的是包含蒜素的有機(jī)層。所述的鹽可以是無(wú)機(jī)鹽，例如氯化鈉、氯化銨或硫酸銨。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的鹽是氯化鈉。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的鹽是氯化鈉，而所述的有機(jī)溶劑是丙酮。在所述過(guò)程中的任何階段，在用于將蒜素轉(zhuǎn)化為阿藿烯的加熱步驟之前，可以通過(guò)干燥、沉淀、過(guò)濾和/或冷凍處理進(jìn)一步純化富含蒜素的溶劑層以去除任何剩余的植物物質(zhì)。例如，在用于將蒜素轉(zhuǎn)化為阿藿烯的加熱步驟之前，可以例如采用硫酸鎂干燥和例如通過(guò)硅藻土過(guò)濾包含蒜素的有機(jī)溶劑層。
之后，可以通過(guò)進(jìn)一步添加一種或一種以上溶劑來(lái)改進(jìn)蒜素溶劑提取物的組成以優(yōu)化用于將蒜素轉(zhuǎn)化為阿藿烯的條件。適合的溶劑是以上所述的溶劑。隨后，按照以上所描述的過(guò)程將蒜素提取物與酸和任選地水混合并且之后進(jìn)行加熱以使蒜素轉(zhuǎn)化為阿藿烯。如上所述，所述的一種或一種以上溶劑可以根據(jù)需要的阿藿烯的Z E比進(jìn)行選擇。丙酮通常使產(chǎn)生包含Z和E同分異構(gòu)體的產(chǎn)物，所述Z和E同分異構(gòu)體的比例為約 1 3，同時(shí)作為溶劑的丁醇可以用于得到Ζ. E比例大于約4 1的產(chǎn)物。因此，根據(jù)本發(fā)明制備的高量和純度的阿藿烯是至少部分地基于上述的生產(chǎn)蒜素的改進(jìn)方法。作為另外一種選擇，可以出于其他目的儲(chǔ)存蒜素。在約5000ppm以上的濃度時(shí)，蒜素在水中極其不穩(wěn)定。然而，假設(shè)已經(jīng)過(guò)濾溶液以去除雜質(zhì)的條件下，在-40°C下，蒜素在高達(dá)約5000ppm濃度的濃度下穩(wěn)定。此外，在弱酸性溶液的存在下可以增加蒜素的穩(wěn)定性。 在采用溶劑例如二乙醚提取之后，并在不稀釋的條件下，蒜素必須保持在-70°C或-70°C以下，因?yàn)樗馑禺a(chǎn)物會(huì)立即開(kāi)始分解。因此根據(jù)蒜素的最終溶液的濃度，可以進(jìn)行用于稀釋蒜素溶液以便儲(chǔ)存的步驟。因此，為了增加其穩(wěn)定性，優(yōu)選的是盡快稀釋蒜素。例如，可以將所述溶液稀釋至小于約500ppm，例如小于約150ppm。可以通過(guò)使用適當(dāng)?shù)木彌_液例如檸檬酸調(diào)節(jié)pH來(lái)進(jìn)一步穩(wěn)定稀釋的溶液。可以通過(guò)大體上去除所有的蛋白質(zhì)、大蒜碎屑和其他固體物質(zhì)進(jìn)一步增加蒜素的穩(wěn)定性。采用這種方式，可以在約0°c或o°c以下的低溫下，在相對(duì)高濃度水平下長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存蒜素。因此提供了在至少5000ppm的濃度下處理和儲(chǔ)存蒜素的方法，所述方法包括處理具有至少約5000ppm的濃度的蒜素的水溶液以大體上去除所有的蛋白質(zhì)、大蒜碎屑和任何其他固體物質(zhì)；和將蒜素的水溶液儲(chǔ)存在約0°C或0°C以下的溫度。經(jīng)過(guò)處理的蒜素的水溶液在-10°C可以儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)約2個(gè)月的時(shí)間不發(fā)生蒜素的降解。可以根據(jù)以上所述的本發(fā)明的第三個(gè)方面制備蒜素的水溶液。根據(jù)第五個(gè)方面，提供了用于增加蒜素的水溶液中的蒜素濃度的方法，所述方法包括冷凍蒜素的水溶液，從而增加蒜素的濃度?？梢愿鶕?jù)以上所述的本發(fā)明的第三個(gè)方面制備蒜素的水溶液。優(yōu)選地，在冷凍之前，根據(jù)以上所述的方法澄清蒜素的水溶液。例如，在低溫，例如5°C以下，可以將富含蒜素的溶液的水溶液靜止沉淀充足的時(shí)間，例如約1-3天， 或者例如約2天。然后，例如通過(guò)傾析去除澄清的上清液體。可以通過(guò)離心去除沉淀中的任何殘留液體并在隨后將該殘留液體與上清液體結(jié)合。優(yōu)選地，將整個(gè)處理過(guò)程中的溫度保持在5°C以下?？梢赃^(guò)濾包含蒜素的澄清的上清溶液?？梢栽诩s1至約3天，例如約2的時(shí)間，將蒜素的水溶液慢慢冷卻至-10°C或-10°C 以下來(lái)實(shí)現(xiàn)冷凍。緩慢冷卻的意思是溶液從溶液的外部朝向中心逐漸冷凍。有利地，冷凍過(guò)程持續(xù)直至按體積計(jì)約50%的蒜素的溶液被冷凍。該過(guò)程具有增加剩余液體部分中蒜素的濃度的效果。所述方法還可以包括機(jī)械處理冰凍的水性蒜素以生成液體/漿體(slush)，以及在小于約15°C的溫度下，在真空下過(guò)濾液態(tài)漿體以生成具有增加的蒜素濃度的相對(duì)粘的蒜素溶液(相對(duì)于在冷凍之前蒜素的水溶液的粘度)?？梢栽谶^(guò)濾過(guò)程中攪拌液體/漿體以促進(jìn)過(guò)濾過(guò)程。與在冷凍之前蒜素的水溶液中的蒜素的濃度相比，可以將粘性溶液中蒜素的濃度增加高達(dá)約50%。與在冷凍之前蒜素的水溶液中的蒜素的濃度相比，可以將粘性溶液中蒜素的濃度增加至少約10%。 蒜素的粘性溶液或其至少一部分可以根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面處理并將其轉(zhuǎn)化為阿藿烯。 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面的替代實(shí)施方案并且根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)方面，通過(guò)包括以下步驟的方法提供了包含蒜素的溶液在約0°c至約30°C的溫度下，在過(guò)氧單硫酸鉀的存在下氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接著將所生成的蒜素提取至有機(jī)溶劑中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溫度等于或小于約10°C，例如約5°C。二硫化二烯丙基和過(guò)氧單硫酸鉀的量可以足以生成具有約2000至約22000ppm 的濃度的蒜素的水溶液。例如，二硫化二烯丙基和過(guò)氧單硫酸鉀的量可以足以生成具有約 5000ppm、或約 7000ppm、或約 lOOOOOppm、或約 12000ppm、或約 15000ppm、或約 17000ppm、或約20000ppm的濃度的蒜素的水溶液。有利地，在一段時(shí)間例如約2小時(shí)內(nèi)，在攪拌下將全部的過(guò)氧單硫酸鉀逐漸添加至二硫化二烯丙基的溶液中。由二硫化二烯丙基合成制備蒜素的方法是已知的[例如，Cavallito. C. J.. Bailey, J. H.，J. Am. Chem. Soc. 66，(1944). 1950-1951 ；Small, L. V. D.，Bailey, J. H.， Cavallito C. J.，J. Am. Chem. Soc. 69，(1947)，1710-1713)]。在這些方法中，過(guò)氧化氫是氧化劑。這些方法也需要使用揮發(fā)性的和低沸點(diǎn)溶劑，例如醚，而使用大量的此種溶劑存在安全性問(wèn)題，本發(fā)明要解決的是這些安全性問(wèn)題。阿蕾烯本發(fā)明涉及包含阿藿烯的組合物，所述阿藿烯的量基于組合物中液體的重量/體積(w/v)計(jì)為至少約30%。所述組合物可以通過(guò)按照本發(fā)明的第一個(gè)方面的方法獲得。在實(shí)施方案中，所述組合物包含35% w/v的阿藿烯，例如至少約40% w/v的阿藿烯，例如至少約45% w/v的阿藿烯，例如至少約50% w/v的阿藿烯。本發(fā)明涉及食用油浸出物，所述食用油浸出物基于所生成的油浸出物的總體積以 w/v計(jì)包含高達(dá)約5%的阿藿烯。通過(guò)將充足的阿藿烯濃縮物懸浮在油中以生成需要的濃度獲得油浸出物。在一個(gè)實(shí)施方案中，以重量/體積計(jì)所述油浸出物包含高達(dá)約4%的阿藿烯。食用油可以是任何適合的植物油。食用油可以是植物油、動(dòng)物油或脂肪、氫化植物油或動(dòng)物脂肪或者合成油或脂肪。優(yōu)選使用液態(tài)油，例如橄欖油。在實(shí)施方案中，食用油可以是橄欖油。本發(fā)明因此使得通過(guò)商業(yè)上可行的方法大批量制備阿藿烯成為可能。例如，所述方法使得制備千克量的阿藿烯成為可能。因此，本發(fā)明也涉及以千克規(guī)模制備的阿藿烯。根據(jù)本發(fā)明的方法提供了藥理活性物質(zhì)阿藿烯，所述阿藿烯的量使其有可能制備包含標(biāo)準(zhǔn)化量的阿藿烯的商品。根據(jù)本發(fā)明制備的阿藿烯適合于任何已知和建議的應(yīng)用。阿藿烯的穩(wěn)定性使其能夠用于制備標(biāo)準(zhǔn)化的藥品、食品、動(dòng)物飼料添加劑，以及用于化妝品應(yīng)用。特別是用于心血管疾病，例如動(dòng)脈硬化、血栓事件、尤其是高血壓，以及用于各種細(xì)菌感染、真菌感染和對(duì)于一些器官紊亂和代謝紊亂的補(bǔ)救。作為預(yù)防性健康補(bǔ)救，阿藿烯也可以用于食品添加劑行業(yè)。為了避免疑義，本申請(qǐng)涉及在以下編號(hào)的段落中描述的主題
1. 一種制備阿藿烯的方法，所述方法包括(a)提供包含蒜素的溶液；(b)增加包含蒜素的溶液的鹽濃度并將蒜素提取至有機(jī)溶劑中，從而形成包含蒜素的溶劑層和鹽水層；(c)任選地，分離溶劑層和鹽水層；和(d)將蒜素轉(zhuǎn)化為阿藿烯。2.根據(jù)第1段的方法，其中，步驟(d)包括在室溫至有機(jī)溶劑的沸點(diǎn)之間的溫度下，加熱蒜素約1至約5小時(shí)的時(shí)間，所述蒜素被提取到所述有機(jī)溶劑中。3.根據(jù)第1或2段的方法，所述方法還包括如果在加熱步驟(d)之前未進(jìn)行權(quán)利要求1的步驟(c)，則分離溶劑層和鹽水層；和去除有機(jī)溶劑以生成包含阿藿烯的油餾分， 所述阿藿烯的量基于油餾分的總體積計(jì)為至少約30% w/Vo4.根據(jù)第3段的方法，其中，所述油餾分采用有機(jī)極性溶劑提取以去除殘留有機(jī)溶劑，并干燥以去除殘留水分。5.根據(jù)第3或4段的方法，所述方法還包括將所述油餾分懸浮在食用油中以形成油浸出物，所述油浸出物包含基于油浸出物的總體積計(jì)約4% -5% w/v的阿藿烯。6.根據(jù)前述任一段的方法，其中，所述步驟(b)中的有機(jī)溶劑選自醇、醚和酮。7.根據(jù)第6段的方法，其中，所述溶劑是丙酮、丁醇或丁酮。8.根據(jù)前述任一段的方法，其中，所述鹽是氯化鈉。9.根據(jù)第4段的方法，其中，所述有機(jī)極性溶劑是二乙醚。10.根據(jù)前述任一段的方法，其中，在步驟(d)之前，過(guò)濾和/或離心包含蒜素的溶劑層。11.根據(jù)前述任一段的方法，其中，步驟b)包括在最長(zhǎng)達(dá)約2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)添加鹽，接著在最長(zhǎng)達(dá)約2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)添加有機(jī)溶劑，并且其中將所述溶液的溫度保持在約 0°C至 50°C。12.根據(jù)第1-10段中任一段的方法，其中，步驟b)包括在最長(zhǎng)達(dá)約2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)添加有機(jī)溶劑，接著在最長(zhǎng)達(dá)約2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)添加鹽，并且其中將所述溶液的溫度保持在約0°C至50°C。13.根據(jù)前述任一段的方法，其中，在攪拌下將所述鹽和有機(jī)溶劑加至包含蒜素的溶液中，并且其中防止在添加所述鹽和有機(jī)溶劑過(guò)程中乳液的形成。14.根據(jù)第11-12段中任一段的方法，其中，所述鹽是氯化鈉而所述有機(jī)溶劑是丙酮，并且其中步驟d)包括在約50-55°C的溫度下加熱蒜素約3-5小時(shí)的時(shí)間，優(yōu)選地約4小時(shí)。15.根據(jù)前述任一段的方法，其中，步驟a)包括i)機(jī)械處理蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源并且同時(shí)使經(jīng)機(jī)械處理的產(chǎn)物受到離心力的作用，從而將包含蒜氨酸酶的溶液與蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源分離；和ii)使包含蒜氨酸酶來(lái)源的溶液與蒜氨酸的水溶液接觸，由此使蒜氨酸在包含蒜氨酸酶的溶液中通過(guò)蒜氨酸酶經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)化為蒜素。16.根據(jù)第15段的方法，其中，步驟⑴在離心式榨汁機(jī)中進(jìn)行。17.根據(jù)第15或16段的方法，其中，步驟(ii)與步驟⑴的至少一部分同時(shí)進(jìn)行。18.根據(jù)第15-17段中任一段的方法，其中，在接觸步驟之后，攪拌包含蒜氨酸、蒜氨酸酶和蒜素的溶液約1-3小時(shí)。
13
19. 一種制備蒜素的方法，所述方法包括(a)機(jī)械處理蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源并且同時(shí)使經(jīng)機(jī)械處理的產(chǎn)物受到離心力的作用，從而將包含蒜氨酸酶的溶液與蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源分離；和(b)使包含蒜氨酸酶來(lái)源的溶液與蒜氨酸的水溶液接觸，由此使蒜氨酸在包含蒜氨酸酶的溶液中通過(guò)蒜氨酸酶經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)化為蒜素。20.根據(jù)第19段的方法，其中，步驟(i)在離心式榨汁機(jī)中進(jìn)行。21.根據(jù)前述任一段的方法，其中，所述蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源是生大蒜。22.根據(jù)第21段的方法，其中，所述生大蒜為優(yōu)選地已經(jīng)去皮并清洗的蒜瓣的鱗莖形式。23.根據(jù)前述任一段的方法，其中，所述包含蒜素的溶液包含至少約5000ppm的蒜
ο24.根據(jù)前述任一段的方法，其中，所述包含蒜素的溶液包含至少約IOOOOppm的標(biāo)素。25.根據(jù)前述任一段的方法，其中，所述包含蒜素的溶液包含至少約12000ppm的標(biāo)素。26.根據(jù)前述任一段的方法，其中，所述包含蒜素的溶液包含至少約15000ppm的標(biāo)素。27.根據(jù)第1-14段中任一段的方法，其中，步驟a)包括在約0°C至約30°C的溫度下，在過(guò)氧單硫酸鉀的存在下，氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接著將所生成的蒜素提取至有機(jī)溶劑中。28. 一種制備蒜素的方法，所述方法包括在約0°C至約30°C的溫度下，在過(guò)氧單硫酸鉀的存在下，氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接著將所生成的蒜素提取至有機(jī)溶劑中。29.根據(jù)第27或觀段的方法，其中二硫化二烯丙基和過(guò)氧單硫酸鉀的量足以生成具有約5000ppm至約20000ppm濃度的蒜素的水溶液。30.根據(jù)第27- 段中任一段的方法，其中，所述溫度等于或小于約10°C。31.根據(jù)第27-30段中任一段的方法，其中，在約2小時(shí)的時(shí)間內(nèi)，將全部量的過(guò)氧單硫酸鉀逐漸添加至二硫化二烯丙基的溶液中。32. 一種通過(guò)根據(jù)第1-17、20力6和觀_30中任一段的方法可以獲得的組合物，所述組合物包含基于組合物的總體積計(jì)至少約30% w/v的阿藿烯。33.根據(jù)第31段的組合物，所述組合物包含至少約35% w/v的阿藿烯。34.根據(jù)第32段的組合物，所述組合物包含至少約40% w/v的阿藿烯。35.根據(jù)第33段的組合物，所述組合物包含至少約45% w/v的阿藿烯。36.根據(jù)第34段的組合物，所述組合物包含至少約50% w/v的阿藿烯。現(xiàn)結(jié)合以下實(shí)施例，將僅通過(guò)實(shí)施例的方式并且在不限制本發(fā)明范圍的情況下描述本發(fā)明。
實(shí)施例反相HPLC 法-蒜素濃度的測(cè)定(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)蒜素溶液校正)
峰鑒定蒜素09. 5分鐘柱=Ace 5 C18 ；尺寸250X4. 6mm保護(hù)柱Ace5C18流動(dòng)相50 %甲醇-50 %水溫度30°C檢測(cè)波長(zhǎng)2IOnm(UV)樣品體積20 μ L樣品溶劑水流速L0ml/min-阿藿烯濃度的測(cè)定(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)阿藿烯溶液校正)峰鑒定阿藿烯(一起洗脫的Ε/Ζ)@11. 1分鐘使用的柱ACE5 C18 ；尺寸250 X 4. 6讓保護(hù)柱Ace5 C18流動(dòng)相溶劑A水-溶劑B甲醇流速1.0ml/min梯度分鐘％ 溶劑B050151002010020.01502550溫度30°C檢測(cè)波長(zhǎng)254nm*UV)樣品體積20 μ L樣品溶劑甲醇-確定阿藿烯E和Z同分異構(gòu)體的正相法(通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)阿藿烯溶液校正)峰鑒定Ζ阿藿烯@14分鐘；E阿藿烯@17分鐘使用的柱二氧化硅；尺寸250X4. 6讓，由NN Scientific Ltd.制造保護(hù)柱Ace5C18流動(dòng)相92%己烷-8% 2-丙醇溫度30°C檢測(cè)波長(zhǎng)240nm(UV)樣品體積20 μ L樣品溶劑2-丙醇、流速1. Oml/min實(shí)施例1將采用離心式榨汁機(jī)(JE700 Proline(RTM)Domestic Juicer extractor)制備的 5升富含蒜氨酸酶的大蒜汁液提取物與35升10%的蒜氨酸溶液在反應(yīng)器中共混并攪拌3小時(shí)。大蒜是得自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)的預(yù)先去皮的西班牙白蒜品種(Spanish white variety) 0用水套使反應(yīng)溫度保持在30°C。通過(guò)使用上述的HPLC法確定反應(yīng)完成。測(cè)定所生成的40升溶液具有15000ppm的蒜素濃度。將40升蒜素溶液在4°C下靜止沉淀48小時(shí)。除去澄清的上清液。通過(guò)在0°C下，以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘去除剩余沉淀中的液體，并將去除的液體與上清液組合。通過(guò)Whatman 113濾紙過(guò)濾澄清的溶液，然后置于100升反應(yīng)器中。 將40升冰冷丙酮加入到反應(yīng)器中并攪拌兩種液體2小時(shí)以確保完全同質(zhì)化。使溫度始終保持在5°C以下。之后，將丙酮水溶液在-10°C下靜止沉淀M小時(shí)。除去任何沉淀。向澄清的溶液中添加15kg的氯化鈉并在隔板式反應(yīng)器中攪拌混合物3小時(shí)。允許該溶液靜止 12小時(shí)并使其冷卻至小于10°C，該時(shí)間足以使不溶混丙酮層從鹽水層中分離。測(cè)定上部丙酮層和底部鹽水層的蒜素濃度分別為3% (w/v)和0.1% (w/v) 0丙酮層采用硫酸鎂干燥并通過(guò)硅藻土過(guò)濾。該過(guò)程剩余25升丙酮。然后使丙酮層與25升的丙酮/水/乙酸(65/34/1 (ν/ν))的溶液在100升反應(yīng)器中混合。然后，在60°C 下加熱溶液5小時(shí)。通過(guò)以上所描述的HPLC阿藿烯法來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。然后，使反應(yīng)混合物通過(guò)30cm 113Whatman濾紙進(jìn)行紙慮。之后在50°C，真空下減少濾液以去除溶劑。以2000ppm 離心殘留物5分鐘。將沉淀液體放置在分離漏斗中并去除底部的油。在80°C，真空下減少油以去除任何殘留溶劑。共得到275g的油，其中通過(guò)HPLC法確定阿藿烯的含量為35% (w/ ν)，并確定Ε/Ζ比例為3 1(如上所述)。實(shí)施例2采用實(shí)施例1中所描述的步驟，生成30升15000ppm的蒜素溶液。使液體靜止沉淀48小時(shí)后，在真空下通過(guò)硅藻土過(guò)濾。然后將澄清的溶液與IlKg的氯化鈉在100升反應(yīng)器中混合。在-io°c下冷卻反應(yīng)器M小時(shí)。然后通過(guò)紙過(guò)濾液體以去除蛋白質(zhì)、纖維和過(guò)量的鹽。將液體轉(zhuǎn)移到100升反應(yīng)器中。向反應(yīng)器中加入30升冰冷的丙酮，用設(shè)計(jì)用于確保充足渦流的葉輪緩慢攪拌液體，從而在不生成過(guò)量乳液的情況下使蒜素從水層轉(zhuǎn)移到有機(jī)層。允許溶液靜止12小時(shí)并冷卻至小于10°C ；該時(shí)間足以使不溶混丙酮層從鹽水層中分離。在雙層的界面生成大約10升的乳液。以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘來(lái)破壞該乳液。測(cè)定上部丙酮層和底部鹽水層的蒜素濃度分別為2% (w/v)和0.08% (w/v) 0然后使丙酮層與25升的丙酮/水/乙酸(65/34/1)的溶液在100升反應(yīng)器中混合。然后，在40°C下加熱溶液6. 5小時(shí)。通過(guò)以上所描述的HPLC阿藿烯法監(jiān)測(cè)反應(yīng)。隨后，使反應(yīng)混合物通過(guò)30cm 113ffhatman濾紙進(jìn)行紙慮。之后將液體相對(duì)2X 10升的戊烷分離以去除非極性的蒜素代謝物，例如聚硫化物和乙烯基二噻烯(vinyl dithiins)。然后在50°C，真空下減少濾液以去除溶劑。通過(guò)攪拌，使殘留物和油均質(zhì)化。通過(guò)逐滴添加濃縮的氫氧化鈉溶液中和液體中殘留的乙酸。然后，用2X5升的甲基叔丁基醚提取水性液體。接著，將甲基叔丁基醚與硫酸鎂結(jié)合。隨后，在50°C，在真空下減少干燥的甲基叔丁基醚。得到總計(jì)210g的油，并且測(cè)定阿藿烯含量為50% (w/v)，測(cè)定E/Z比例為3:1。實(shí)施例3采用實(shí)施例2中所描述的步驟，生成30升15000ppm的蒜素溶液。通過(guò)以3000rpm 的轉(zhuǎn)速離心45分鐘來(lái)澄清該液體。然后，用13Kg的硫酸銨使該液體飽和。攪拌所述溶液以確保飽和；通過(guò)過(guò)濾去除任何未溶解的鹽。之后，用15升冰冷丙酮提取該溶液。將丙酮溶液轉(zhuǎn)移至隔絕容器中；通過(guò)添加干冰使反應(yīng)器的溫度降至-70°C。之后，使冰冷溶液在真空下通過(guò)紙濾器上的硅藻土過(guò)濾。然后，用硫酸鎂干燥濾液并再次經(jīng)硅藻土過(guò)濾。然后使丙酮層與15升的丙酮/水/乙酸(65/34/1)的溶液在100升反應(yīng)器中混合。隨后，在50°C下加熱溶液4小時(shí)。通過(guò)HPLC阿藿烯法來(lái)監(jiān)測(cè)反應(yīng)。然后，使反應(yīng)混合物通過(guò)30cm 113Whatman濾紙進(jìn)行紙慮。然后在60°C，在真空下減少濾液以去除溶劑。用 10升50%的甲醇溶液溶解殘留物。該溶液隨后針對(duì)2X5升的己烷清洗。接著，用2. 5升的二氯甲烷提取水層。用硫酸鎂干燥DCM，然后減少DCM。生成258ml液體，阿藿烯的含量為40%。實(shí)施例4使用實(shí)施例1中描述的步驟生產(chǎn)15升15000ppm的蒜素溶液。通過(guò)在4°C下沉淀M 小時(shí)使蒜素溶液澄清。然后，在-10°C下使所述溶液冰凍48小時(shí)。接著，用錘子打碎冰凍的塊，并用家用攪拌機(jī)使冰凍的塊粉碎至精細(xì)的漿體。通過(guò)粗糙級(jí)篩過(guò)濾所述的漿體以去除大冰粒。真空下過(guò)濾所述的漿體3小時(shí)。始終攪拌所述的液體/漿體從而幫助過(guò)濾。使溫度保持在10°C以下。收集6升濾液并采用以上所描述的HPLC蒜素法測(cè)定其具有30000ppm 的蒜素含量。該濾液為粘性溶液。將剩余的固體漿體/冰放置在室溫下解凍12小時(shí)，得到 9升的液體，蒜素含量為5000ppm。然后，采用與實(shí)施例1中詳細(xì)描述的轉(zhuǎn)化和提取步驟處理6升蒜素溶液。共得到 250g的油，通過(guò)以上所描述的HPLC法測(cè)定阿藿烯的含量為30%并測(cè)定E/Z比例為3 1實(shí)施例5如實(shí)施例1所述生成阿藿烯。將所生成的阿藿烯進(jìn)一步在硫酸鎂上干燥并懸浮在橄欖油中以得到包含約4%阿藿烯的油浸出物。根據(jù)最終使用者和應(yīng)用，采用任何適合的食用油進(jìn)一步稀釋該濃縮物，用于在IOOppm至500ppm的濃度使用。當(dāng)進(jìn)行適當(dāng)包裝并且作為健康補(bǔ)品使用或其他已知的應(yīng)用時(shí)，該產(chǎn)品可以穩(wěn)定最少2年。實(shí)施例6將IOml的二硫化二烯丙基(DADS)攪拌至IOOml乙醇/水(1 1)中。在2小時(shí)內(nèi)緩慢添加20g過(guò)氧單硫酸鉀，并在10°C以下攪拌直至觀察不到進(jìn)一步的反應(yīng)。然后，過(guò)濾所生成的溶液，之后用二乙醚OX50ml)提取該溶液。將二乙醚層結(jié)合并用10%鹽水溶液 2X50ml清洗。采用硫酸鎂干燥該醚層，然后真空下減少。去除溶劑，產(chǎn)生了大于90%的純蒜素黃色油狀物(表達(dá)為純物質(zhì)的)。然后，根據(jù)實(shí)施例1所述處理該純的蒜素，以使其轉(zhuǎn)化為阿藿烯。
權(quán)利要求
1.一種制備阿藿烯的方法，所述方法包括以下步驟將包含蒜素的酸性溶液加熱足夠的時(shí)間，使得至少一部分蒜素被轉(zhuǎn)化為阿藿烯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中，所述溶液包含有機(jī)溶劑和水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中，步驟中的所述有機(jī)溶劑選自醇、醚和酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中，所述有機(jī)溶劑是丙酮、丁醇或丁酮。
5.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中，所述酸性溶液包含有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中，所述酸具有小于約5的pKa。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中，所述酸是選自乙酸、磷酸、硫酸和鹽酸中的一種或多種酸。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中，在所述溶液中所述酸的量為約0.至5% (ν/ν)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中，在所述溶液中所述酸的量為約0.1%至約(ν/ν)0
10.根據(jù)權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)的方法，其中，所述有機(jī)溶劑的量為約50%至70%(ν/ ν)，且余量為水。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述酸是乙酸，而所述有機(jī)溶劑是丙酮，溶液的余量為水。
12.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中，所述加熱步驟在約30°C至約80°C的溫度下進(jìn)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中，所述溫度為約40°C或約50°C或約60°C。
14.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中，大量的蒜素被轉(zhuǎn)化為阿藿烯。
15.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中，基本上所有的蒜素被轉(zhuǎn)化為阿藿烯。
16.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中，所述蒜素的酸性溶液具有約3至約5的 pH，或者約3至小于5的pH。
17.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，所述方法還包括去除有機(jī)溶劑以得到包含阿藿烯的油餾分，所述阿藿烯的量基于油餾分的總體積計(jì)為至少約30% w/v.
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中，所述油餾分采用有機(jī)極性溶劑提取以去除殘留有機(jī)溶劑，并干燥以去除殘留水分。
19.根據(jù)權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括將所述油餾分懸浮在食用油中以形成油浸出物，所述油浸出物包含基于油浸出物的總體積計(jì)約4% -5% w/v的阿藿烯，其中所述食用油任選地為橄欖油。
20.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中，所述包含蒜素的溶液通過(guò)包括以下步驟的方法制備i)機(jī)械處理蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源并且同時(shí)使經(jīng)機(jī)械處理的產(chǎn)物受到離心力的作用，從而將包含蒜氨酸酶的溶液與蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源分離；和 )使包含蒜氨酸酶來(lái)源的溶液與蒜氨酸的水溶液接觸，由此使蒜氨酸通過(guò)所述的蒜氨酸酶經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)化為蒜素，從而生成包含蒜氨酸的水溶液。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中，在離心式榨汁機(jī)中進(jìn)行步驟i)。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21的方法，其中，所述步驟ii)與步驟i)的至少一部分同時(shí)進(jìn)行。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22中任一項(xiàng)的方法，其中，在所述接觸步驟之后，攪拌包含蒜氨酸、蒜氨酸酶和蒜素的溶液約1至4小時(shí)，其中任選地，將攪拌過(guò)程中的溫度保持在約30°C。
24.根據(jù)權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)的方法，其中，在轉(zhuǎn)化之后將所述蒜素提取至有機(jī)溶劑中。
25.根據(jù)權(quán)利要求M的方法，其中，所述有機(jī)溶劑選自醇、醚和酮。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其中，所述溶劑是丙酮、丁醇或丁酮。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中，所述有機(jī)溶劑與根據(jù)權(quán)利要求2-16中任一項(xiàng)所述的方法中使用的有機(jī)溶劑相同。
28.根據(jù)權(quán)利要求M-27中任一項(xiàng)的方法，其中，在鹽例如氯化鈉的存在下進(jìn)行提取。
29.根據(jù)權(quán)利要求M-28中任一項(xiàng)的方法，其中，在攪拌下將所述鹽和有機(jī)溶劑加至包含蒜素的溶液中，并且其中在加入所述鹽和有機(jī)溶劑過(guò)程中防止乳液的形成或者至少將乳液的形成最小化。
30.一種制備蒜素的方法，所述方法包括(a)機(jī)械處理蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源并且同時(shí)使經(jīng)機(jī)械處理的產(chǎn)物受到離心力的作用，從而將包含蒜氨酸酶的溶液與蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源分離；和(b)使包含蒜氨酸酶來(lái)源的溶液與蒜氨酸的水溶液接觸，由此使蒜氨酸在包含蒜氨酸酶的溶液中通過(guò)蒜氨酸酶經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)化為蒜素。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中，所述方法為權(quán)利要求20- 中任一項(xiàng)中所限定的方法。
32.根據(jù)權(quán)利要求20-31中任一項(xiàng)的方法，其中，所述蒜氨酸酶的天然植物來(lái)源是生大蒜ο
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中，所述生大蒜為優(yōu)選地已經(jīng)去皮并清洗的蒜瓣的鱗莖形式。
34.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中，所述包含蒜素的溶液包含至少約5000ppm的蒜素。
35.根據(jù)權(quán)利要求31的方法，其中，所述包含蒜素的溶液含有至少約IOOOOppm的蒜素， 或者其中所述包含蒜素的溶液含有至少約15000ppm的蒜素，或者其中所述包含蒜素的溶液含有至少約20000ppm的蒜素，或者其中所述包含蒜素的溶液含有至少約22000ppm的蒜素ο
36.根據(jù)權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)的方法，其中，所述包含蒜素的溶液通過(guò)包括以下步驟的方法制備在約0°C至約30°C的溫度下，在過(guò)氧單硫酸鉀的存在下，氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接著將所生成的蒜素提取至有機(jī)溶劑中。
37.一種制備蒜素的方法，所述方法包括在約0°C至約30°C的溫度下，在過(guò)氧單硫酸鉀的存在下，氧化包含二硫化二烯丙基的溶液；接著將所生成的蒜素提取至有機(jī)溶劑中。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的方法，其中，所述二硫化二烯丙基和過(guò)氧單硫酸鉀的量足以生成具有約5000ppm至約22000ppm濃度的蒜素水溶液。
39.根據(jù)權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)的方法，其中，所述溫度等于或小于約10°C。
40.一種組合物，所述組合物包含基于組合物的總體積計(jì)至少約30% w/v的阿藿烯。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的組合物，所述組合物可通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-四、34-36和38-39中任一項(xiàng)的方法獲得。
42.根據(jù)權(quán)利要求40或41的組合物，所述組合物包含至少約35%W/v阿藿烯，或者包含至少約40% w/v阿藿烯，或者包含至少約45% w/v阿藿烯，或者包含至少約50% w/v阿霍火布ο
43.以千克規(guī)模制備的并且通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1-四、34-36和38-39中任一項(xiàng)的方法獲得的阿藿烯。
44.一種提高蒜素水溶液中的蒜素濃度的方法，所述方法包括冷凍蒜素的水溶液，從而增加蒜素的濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于制備阿藿烯的方法，所述方法包括加熱含有蒜素的酸性溶液的步驟，并涉及可以通過(guò)該方法制備的阿藿烯。本發(fā)明還涉及制備蒜素的方法，其中(1)機(jī)械處理蒜氨酸酶植物來(lái)源，使產(chǎn)物受到離心力的作用并且因此使所制備的蒜氨酸酶的溶液與蒜氨酸的水溶液接觸；或(2)在0℃至30℃下，在過(guò)氧單硫酸鉀的存在下，氧化包含二硫化二烯丙基的溶液，并且將得到的蒜素提取至有機(jī)溶劑中。此外，本發(fā)明涉及通過(guò)冷凍水溶液來(lái)提高水溶液中蒜素的濃度的方法。
文檔編號(hào)C12P11/00GK102356064SQ201080010319
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2010年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者D·M·威廉姆斯, G·J·S·艾瓦斯, R·A·桑德斯 申請(qǐng)人:尼姆生物科技有限公司