專利名稱：群體感應(yīng)信號分子抑制劑產(chǎn)生菌的鑒別方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鑒別產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子抑制劑的微生物 的方法，本發(fā)明還涉及該方法在制備預(yù)防人和畜禽等動(dòng)物疾病的益生素(微生態(tài)制劑)中 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
群體感應(yīng)(Quorum Sensing，QS)是細(xì)菌根據(jù)自身細(xì)胞密度變化進(jìn)行自我協(xié)調(diào)的 一種群體行為。許多細(xì)菌能產(chǎn)生并釋放一種被稱為自誘導(dǎo)物(Auto Inducer，Al)的信號 分子，隨著細(xì)菌密度的增加，信號分子積累到一定濃度時(shí)則會(huì)與胞漿受體蛋白結(jié)合，調(diào)控細(xì) 菌相關(guān)基因的表達(dá)，使細(xì)菌形成一種群體行為來有效地抵御環(huán)境壓力、攻擊宿主等。在一些 致病菌(如銅綠假單胞菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、嗜水氣單胞菌等)中，群 體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控相關(guān)致病因子的產(chǎn)生，如促進(jìn)毒素、蛋白酶的產(chǎn)生、黏附、生物膜(Biofilm) 的形成等。大量文獻(xiàn)表明缺失了群體感應(yīng)系統(tǒng)的菌株其致病能力大大降低，因此細(xì)菌群體 感應(yīng)系統(tǒng)可作為抗感染藥物研發(fā)的新靶標(biāo)。益生素(Probiotic)又稱微生態(tài)制劑或活菌制劑，是一類活性微生物添加劑。一 方面，益生素被動(dòng)物采食后能在消化道特別是腸道內(nèi)發(fā)育、繁殖并起有益作用，能促進(jìn)動(dòng)物 生長發(fā)育，提高飼料利用率，降低幼畜幼禽死亡率，防止消化道疾病，提高機(jī)體免疫力；另一 方面，相對使用抗生素引起的藥物殘留、耐藥菌株產(chǎn)生等問題，作為新型綠色添加劑的益生 素，由于其無殘留、無污染以及不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，有其獨(dú)特的優(yōu)越之處，因而益生素已 成為在畜禽飼料中很有前途的新型飼料添加劑。通過篩選能產(chǎn)生群體感應(yīng)抑制劑的微生物作為微生態(tài)制劑的出發(fā)菌是一個(gè)既發(fā) 揮了群體感應(yīng)信號分子抑制劑的作用，抑制病原菌產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子，抑制其致病因 子的產(chǎn)生，又能發(fā)揮微生態(tài)制劑特性的途徑，從而為人及動(dòng)物疾病的預(yù)防提供更好的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)問題提供一種鑒別產(chǎn)生群體感應(yīng)分子抑制劑的微 生物的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供采用上述方法得到的微生物所制備的微生物在制備 預(yù)防人或動(dòng)物疾病的益生素中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的一種鑒別產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子抑制劑的微生物的方法，包括下列步驟a、將含微生物的樣品用無菌生理鹽水稀釋，取100 μ 1接種于IOml含有500 μ g/L 群體感應(yīng)信號分子(acyl-homoserine lact0ne，AHLs，N-?；呓z氨酸內(nèi)酯)的KG液體培 養(yǎng)基中，28-37°C，200rpm搖床培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基中，連續(xù)3次后將獲得的增菌液 稀釋涂布于LB瓊脂平板上，獲得單個(gè)菌落；b、挑取獲得的單個(gè)菌落做一字型接種于LB瓊脂平板中央，28-37°C培養(yǎng)12_24h ；
C、將 5ml 含有 106CFU/ml 指示菌紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum) ATCC12472 或者農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumfaciens) KYC6 的 45_50°C保溫的 0. 5% LB 瓊脂 傾倒于步驟b所獲得的平板上，24-48h培養(yǎng)，在平板中央分離菌周圍未產(chǎn)生紫色或者藍(lán)色 色素的，說明該菌能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子抑制劑。所述的方法，其中步驟a所用KG液體培養(yǎng)基每升含有氯化鈉l.Og，氯化 鉀0. 5g，氯化鎂0. 4，氯化鈣0. Ig,硫酸鈉0. 15g，磷酸二氫鉀5. Og, 2-(N-morpholino) ethanesulfonicacid (MES，2_嗎啉乙磺酸)1. Og,另含Img氯化鐵，0. Ig氯化錳，0. 46g氯化 鋅以及500yg C4_14-HSL，其余為水。所述的方法，其中LB瓊脂平板是在LB液體培養(yǎng)基中加入1. 5襯％的瓊脂，LB液體 培養(yǎng)基每升含有胰蛋白胨10. 0g，酵母粉5. 0g，氯化鈉10. 0g，其余為水，PH為7. 0-7. 5。采用上述鑒別方法得到的能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子抑制劑的微生物在制備預(yù)防 人或動(dòng)物疾病的益生素中的應(yīng)用。運(yùn)用該方法制備益生素(微生態(tài)制劑)，能夠有效的抑制致病菌群體感應(yīng)分子的 活性，從而抑制致病菌的致病性。進(jìn)一步，運(yùn)用該技術(shù)制備益生素預(yù)防人及畜禽疾病。本發(fā)明技術(shù)方案的分析，在第一步中，微生物產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子 (acyl-homoserine lactone，AHLs，N-?；呓z氨酸內(nèi)酯)抑制劑能夠降解C4_14_HSL (是群 體感應(yīng)信號分子中的一種)，從而利用C4_14-HSL提供的C源、N源進(jìn)行生長，而且不產(chǎn)生群 體感應(yīng)信號分子抑制劑的微生物則不能生長。第二步LB瓊脂培養(yǎng)基可適合微生物生長；第三步確認(rèn)該微生物能夠群體感應(yīng)信號分子抑制劑，因?yàn)橐种苿┠芤种浦甘揪?色色桿菌ATCC12472產(chǎn)生紫色(以農(nóng)桿菌KYC6為指示菌則為藍(lán)色)，培養(yǎng)皿中央可見有菌 落線(說明微生物能夠生長)，周圍呈現(xiàn)紫色，說明指示菌也能生長。但中間不顯示紫色，說 明存在能抑制指示菌產(chǎn)生紫色的抑制劑。本發(fā)明可用于鑒別的微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌等。本發(fā)明的有益效果1、本方法簡單易得，不需要昂貴的設(shè)備，檢測目標(biāo)明確。2、本方法成本低廉，可迅速獲得能產(chǎn)生群體感應(yīng)抑制劑的微生物，可大規(guī)模篩選 能產(chǎn)生群體感應(yīng)抑制劑的微生物。3、能夠產(chǎn)生細(xì)菌群體感應(yīng)信號分子抑制劑，可抑制致病菌群體感應(yīng)信號分子的活 性，從而抑制致病菌致病因子相關(guān)基因的表達(dá)，從而有效地控制致病菌的感染。4、該方法篩選的菌作為微生態(tài)制劑的出發(fā)菌，能夠促進(jìn)人和動(dòng)物正常菌群的平 衡，有效刺激腸道粘膜免疫，提高飼料率用率。


圖1是產(chǎn)群體感應(yīng)信號分子抑制劑菌篩選示意圖。圖2是群體感應(yīng)信號分子產(chǎn)生菌抑制色素產(chǎn)生的照片。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，其中采用的菌種僅為了使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解本發(fā)明而舉例用，不可理解為本發(fā)明的方法僅能用于這幾個(gè)具體的菌篩選。實(shí)施例中所用的菌種購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。C6-HSL (N-hexanoyl-L-homoserinelactone，購自 Sigma 公司)指含有 6 個(gè) C 原子 數(shù)的側(cè)鏈，C4 C14都可以。實(shí)施例1產(chǎn)群體感應(yīng)信號分子抑制劑芽孢菌的篩選，具體操作如下1、取含有微生物的土樣Ig置于IOml無菌生理鹽水中100°C水浴lOmin，2、取100 μ 1上述樣品液接種于IOml含有500 μ g/L群體感應(yīng)信號分子 (acyl-homoserinelactone，AHLs，N-?；呓z氨酸內(nèi)酯)的KG液體培養(yǎng)基中(250ml的三 角燒瓶)，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)24h。3、取100 μ 1轉(zhuǎn)接到KG液體培養(yǎng)基中，連續(xù)3次后將獲得的增菌液稀釋涂布于LB 瓊脂平板上，獲得單個(gè)菌落。(KG液體培養(yǎng)基每升含有氯化鈉1.(^，氯化鉀0.58，氯化鎂0.4，氯化鈣0. lg，硫 酸鈉 0. 15g，磷酸二氫鉀 5. Og, 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid(MES，2-嗎啉乙磺 酸)1.0g，另含Img氯化鐵，0. Ig氯化錳，0. 46g氯化鋅以及500yg C6-HSL，其余為水。LB 瓊脂平板是在LB液體培養(yǎng)基中加入1. 5襯％的瓊脂，LB液體培養(yǎng)基每升含有胰蛋白胨 10. 0g，酵母粉5. 0g，氯化鈉10. 0g，其余為水，pH為7. 0-7. 5。)4、挑取獲得的單個(gè)菌落做一字型接種于LB瓊脂平板中央，30°C培養(yǎng)24_48h ；5、將5ml含有106CFU/ml指示菌紫色色桿菌ATCC12472的45_50°C保溫的0. 5% LB瓊脂傾倒于步驟4所獲得的平板上，24-48h培養(yǎng)，在平板中央分離菌周圍未產(chǎn)生紫色色 素，說明該菌能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子抑制劑(圖2)。圖2中可見培養(yǎng)皿中央可見有菌落線，說明分離的微生物能夠生長，周圍呈現(xiàn)紫 色，說明指示菌也能生長，但中間不顯示紫色，說明中央菌落線的微生物產(chǎn)生了能夠抑制指 示菌紫色色桿菌ATCC12472產(chǎn)生紫色的抑制劑。該分離的微生物可用于制備預(yù)防人或動(dòng)物疾病的益生素。制備益生素的方法為本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。實(shí)施例2 操作過程如實(shí)施例1，所不同的是指示菌采用農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumfaCiens)KYC6，培養(yǎng)皿周圍呈現(xiàn)藍(lán)色，中央菌落線周圍不顯色。 該分離的微生物可用于制備預(yù)防人或動(dòng)物疾病的益生素。制備益生素的方法為本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。
權(quán)利要求
一種鑒別產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子抑制劑的微生物的方法，其特征在于包括下列步驟a、將含微生物的樣品用無菌生理鹽水稀釋，取100μl接種于10ml含有500μg/L群體感應(yīng)信號分子N ?；呓z氨酸內(nèi)酯的KG液體培養(yǎng)基中，28 37℃，200rpm搖床培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基中，連續(xù)3次后將獲得的增菌液稀釋涂布于LB瓊脂平板上，獲得單個(gè)菌落；b、挑取獲得的單個(gè)菌落做一字型接種于LB瓊脂平板中央，28 37℃培養(yǎng)12 24h；c、將5ml含有106CFU/ml指示菌紫色色桿菌(Chromobacterium violaceum)ATCC12472或者農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumfaciens)KYC6的45 50℃保溫的0.5％LB瓊脂傾倒于步驟b所獲得的平板上，24 48h培養(yǎng)，在平板中央分離菌周圍未產(chǎn)生紫色或者藍(lán)色色素的，說明該菌能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟a所用KG液體培養(yǎng)基每升含有氯化鈉 1. Og,氯化鉀0. 5g，氯化鎂0. 4，氯化鈣0. Ig,硫酸鈉0. 15g，磷酸二氫鉀5. Og, 2-嗎啉乙磺 酸1. 0g，另含Img氯化鐵，0. Ig氯化錳，0. 46g氯化鋅以及500 μ g C4_14_HSL，其余為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于LB瓊脂平板是在LB液體培養(yǎng)基中加入 1. 5襯％的瓊脂，LB液體培養(yǎng)基每升含有胰蛋白胨10. 0g，酵母粉5. 0g，氯化鈉10. 0g，其余 為水，pH 為 7. 0-7. 5。
4.采用權(quán)利要求1所述鑒別方法得到的能產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子抑制劑的微生物在 制備預(yù)防人或動(dòng)物疾病的益生素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了群體感應(yīng)信號分子抑制劑產(chǎn)生菌的鑒別方法及應(yīng)用。該方法通過將含有微生物的樣品接種于含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的KG培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌后接種在LB平板上獲得單個(gè)菌落，采用指示菌紫色色桿菌或農(nóng)桿菌進(jìn)行檢測，分離菌周圍不產(chǎn)生色素表明該菌能夠產(chǎn)生群體感應(yīng)信號分子抑制劑。該技術(shù)可用于人和動(dòng)物上作為疾病預(yù)防的益生素的篩選及應(yīng)用。該技術(shù)具有方法簡單，能有效控制致病菌致病因子的產(chǎn)生，同時(shí)又提高動(dòng)物粘膜免疫功能，提高飼料利用率的特點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/04GK101914607SQ20101023670
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者儲(chǔ)衛(wèi)華 申請人:儲(chǔ)衛(wèi)華;江蘇星海動(dòng)物藥業(yè)科技有限公司