專利名稱：一種建立赤潮藻rflp特征性圖譜的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋浮游植物種類和/或數(shù)量檢測(cè)的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種建立赤 潮藻RFLP特征性圖譜的方法。
背景技術(shù)：
在富饒的海洋世界里，有著許許多多的海洋生物，除了有形式各樣的海洋魚類等 海洋動(dòng)物，還有著為海洋提供基礎(chǔ)生產(chǎn)力的海洋植物。它們分布于海洋的各個(gè)層面，而作為 海洋植物主要組成部分的海洋藻類，是人類的一大寶貴的自然財(cái)富，它們可以作為食物，也 可以做成保健藥品。人們根據(jù)海洋藻類的不同的生活習(xí)慣，把它們分為底棲藻和浮游藻兩 大類型。浮游藻藻體僅由一個(gè)細(xì)胞組成，又稱為單細(xì)胞藻類，是一類具有色素或色素體能 進(jìn)行光合作用，并制造有機(jī)物的自養(yǎng)型單細(xì)胞浮游生物。它們是海洋中最重要的初級(jí)生產(chǎn) 者，也是海洋生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈中最基礎(chǔ)的一環(huán)。浮游藻能漂浮或懸浮在有光的水面上做 極其微弱的浮動(dòng)，與其適應(yīng)漂浮生活的各種體型是分不開的。有的浮游藻為了增大與水面 接觸的表面積，其細(xì)胞周圍生出一圈刺毛、長長的刺或突起物，還有的成群結(jié)隊(duì)的積在一 塊，以擴(kuò)大表面積來利于漂浮。浮游藻植物形狀各有特色，有紡錘形、扇形、星形等。它們多 數(shù)是單細(xì)胞的，也有許多是由單細(xì)胞結(jié)合起來的群體。絕大多數(shù)浮游植物的個(gè)體都非常微 小，只有幾個(gè)至幾百微米，只能在顯微鏡下才能看清楚其形態(tài)結(jié)構(gòu)，但其數(shù)量極多，代謝活 動(dòng)強(qiáng)烈。雖然浮游藻形體微小，運(yùn)動(dòng)能力較弱，但它的存在對(duì)整個(gè)地球生態(tài)系統(tǒng)來說是極 其重要的。首先，浮游藻處于有光的水體表面，它們?cè)谒孢M(jìn)行光合作用，固定無機(jī)碳，使之 轉(zhuǎn)化為碳水化合物。據(jù)估計(jì)，全球約50%的初級(jí)生物力源于海洋，而海洋浮游植物又是海洋 初級(jí)生產(chǎn)力的最主要來源，僅硅藻一類就貢獻(xiàn)了海洋初級(jí)生產(chǎn)力的60%。其次，浮游藻類是 為地球提供化合氮的重要生物，如藍(lán)藻。最后，海洋浮游植物位于海洋食物鏈的最底層，它 們是小型海洋動(dòng)物，尤其是海洋動(dòng)物幼體的直接或間接餌料。某個(gè)海域浮游植物的生物量 和多樣性直接影響該區(qū)域其它高級(jí)動(dòng)物的多樣性和分布。赤潮是海水中某些單細(xì)胞藻類，原生動(dòng)物或細(xì)菌在一定的環(huán)境條件下爆發(fā)性增殖 或聚集在一起而引起水體變色的一種生態(tài)異?，F(xiàn)象。一般稱藻類大量繁殖的現(xiàn)象為藻華， 赤潮也被稱為有害藻華。赤潮是一種自然生態(tài)現(xiàn)象，也是一種人為因素引起的有害生態(tài)現(xiàn) 象。赤潮一般可分為有毒赤潮與無毒赤潮兩類。有毒赤潮是指赤潮生物體內(nèi)含有某種毒素 或能分泌出毒素的生物形成的赤潮。有毒赤潮一旦形成，可對(duì)赤潮區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)、海洋漁 業(yè)、海洋環(huán)境、以及人體健康造成不同程度的損害。無毒赤潮是指生物體內(nèi)不含毒素，又不 分泌毒素的生物體為主形成的赤潮。無毒赤潮對(duì)海洋生態(tài)、海洋環(huán)境、海洋漁業(yè)也會(huì)產(chǎn)生不 同程度的損害。除了根據(jù)毒素的有無對(duì)赤潮進(jìn)行劃分外，赤潮還可以根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)有以 下不同的分類方法。首先，根據(jù)赤潮爆發(fā)的地點(diǎn)，可分為外海性赤潮和近岸、內(nèi)灣性赤潮。 由于大洋上升流區(qū)或水團(tuán)交匯處營養(yǎng)物質(zhì)比較豐富，容易爆發(fā)外海性赤潮。在中國主要分布于東海以南水域。近岸、內(nèi)灣、河口性赤潮，指發(fā)生于近岸區(qū)、內(nèi)灣區(qū)或河口區(qū)等水城的赤 潮。其次，根據(jù)赤潮的來源可分為外來型和原發(fā)型赤潮。所謂外來型赤潮，是指不是在原海 域形成的赤潮，而是在其他水域形成后，由于風(fēng)、浪、流等外力作用被帶到該海域的。其特 點(diǎn)表現(xiàn)在持續(xù)時(shí)間比較短，有時(shí)候會(huì)把同一起赤潮的遷移誤認(rèn)為兩起發(fā)生在不同地方的赤 潮。原發(fā)性赤潮是指原海域自身發(fā)生的赤潮，其特點(diǎn)是持續(xù)時(shí)間較長，而且會(huì)反復(fù)出現(xiàn)。一 般而言在內(nèi)灣發(fā)生的赤潮大多是屬于原發(fā)性赤潮。最后，根據(jù)引發(fā)的赤潮的生物種類的多 少，可分為單相型、雙相型和復(fù)合型赤潮。單相型赤潮是指赤潮爆發(fā)時(shí)，只有一個(gè)赤潮生物 種占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。同理，雙相型即指兩種赤潮生物共存并同時(shí)占優(yōu)勢(shì)而形成的赤潮。復(fù)合型 赤潮由三種以及三種以上赤潮生物所引起，且每種的數(shù)量都占有總數(shù)的20%以上。赤潮的危害主要表現(xiàn)在首先，大量的二氧化碳被赤潮所消耗，使水體酸堿度發(fā)生 較大變化，從而影響海洋生物的群落結(jié)構(gòu)；在赤潮發(fā)生過程中，由于大量赤潮生物的瘋長， 阻擋了陽光到達(dá)水體的深度，降低了水體的透明度，導(dǎo)致生長于水體深層的水草和海洋動(dòng) 物大量死亡，底層生物量銳減。其次，在赤潮生物瘋長過程中，不但競爭性消耗水中的營養(yǎng) 物質(zhì)，而且分泌一些抑制其他生物生長的物質(zhì)，如赤潮藻毒素。結(jié)果導(dǎo)致水體中赤潮生物 占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而其他生物種類減少，嚴(yán)重破壞水體的生物多樣性。再次，赤潮生物的缺氧或 造成水體累積大量硫化氫和甲烷，隔絕了海水與大氣圈的氣體交換，使很多海洋生物窒息 或者中毒而死。最后，一些赤潮生物(如某些甲藻)產(chǎn)生的粘液附著在海洋動(dòng)物的鰓上，妨 礙呼吸作用，使大型水生動(dòng)物窒息而死，給近海養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。許多赤潮生物含有毒 素，該毒素可使海洋動(dòng)物因赤潮生物毒素的積累和食物鏈傳遞作用而中毒死亡或生長繁殖 受到影響。赤潮對(duì)人體健康的影響也很大，直接接觸會(huì)引起皮膚的不適，而一些揮發(fā)性毒素 還可能能對(duì)眼睛和呼吸道產(chǎn)生影響，更主要的是由于食物鏈的傳遞作用，有害赤潮產(chǎn)生的 赤潮生物毒素會(huì)導(dǎo)致人類的中毒甚至死亡。所以，研究建立赤潮的預(yù)警機(jī)制是必要的，而赤潮的預(yù)警需要了解其結(jié)構(gòu)的多樣 性，則必須建立赤潮藻RELP的特征性圖譜，而建立赤潮藻的RELP的特征性圖譜一直是本領(lǐng) 域重要的課題之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，本發(fā)明運(yùn)用限制性片斷長度多態(tài)性技術(shù) (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) Wtl^ii^ PCR-RFLP, l^jM^ilM 種的特征酶切圖譜，在此基礎(chǔ)上，建立了一套高效快捷的、基于RFLP的赤潮藻的特征性圖 譜的建立方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其 中，包括以下步驟a、模擬實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表的建立b、模擬酶切電泳圖譜C、模擬酶切和實(shí)際酶切對(duì)照實(shí)驗(yàn)d、實(shí)際酶切實(shí)驗(yàn)e、模擬酶切實(shí)驗(yàn)f、模擬酶切實(shí)驗(yàn)和實(shí)際酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比
g、酶切實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化h、RFLP圖譜的建立i、基于RFLP技術(shù)的赤潮藻種鑒定。
所述步驟a為將實(shí)驗(yàn)藻種序列信息錄入excel軟件，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)用到的限制性內(nèi) 切酶的酶切信息，通過excel軟件，作出酶切片段數(shù)和長度的信息，建立初級(jí)酶切信息數(shù)據(jù)表。所述步驟b為根據(jù)步驟a模擬數(shù)據(jù)表建立的信息，進(jìn)行篩選，從中挑選出限制性 內(nèi)切酶，運(yùn)用Vector NTI Suite 9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對(duì)實(shí)驗(yàn)藻種序列進(jìn)行模 擬的酶切，并跑出模擬電泳圖，根據(jù)此初步判斷其區(qū)分鑒別程度。所述步驟c為選取部分實(shí)驗(yàn)藻種進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，并與的模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)， 驗(yàn)證模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際試驗(yàn)的吻合程度，其中，反應(yīng)體系為總體積30μ 1，其中18S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物15 μ 1，酶切反應(yīng)緩沖液5 μ 1， 內(nèi)切酶3μ 1，滅菌重蒸水7μ 1 ；反應(yīng)時(shí)間為65°C條件下90min，其酶切產(chǎn)物也用凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖凝膠濃度 為1%，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。所述步驟d為選取實(shí)驗(yàn)藻種對(duì)選擇的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作出酶切電泳圖， 作出單個(gè)的藻種酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分，并對(duì)相關(guān)酶切實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。所述步驟e為對(duì)照模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建赤潮藻種的RFLP圖庫，并 在此基礎(chǔ)上建立標(biāo)準(zhǔn)化的基于RELP技術(shù)的赤潮藻種分類鑒定方法，對(duì)試驗(yàn)藻進(jìn)行了五次 的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算條帶大小。所述步驟f為收集實(shí)驗(yàn)藻種18S rDNA序列信息，并綜合主要限制性內(nèi)切酶的信 息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫和Vector NTI Suite 9軟件，選取用酶，作出模擬電泳圖，優(yōu)選為Taq I酶 作為實(shí)驗(yàn)用酶；計(jì)算模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際實(shí)驗(yàn)的對(duì)比結(jié)果，計(jì)算實(shí)際實(shí)驗(yàn)的條帶數(shù)和條帶大小 的位置是否與擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。所述步驟g為(1)酶切樣品量的優(yōu)化取三個(gè)酶切對(duì)象的量進(jìn)行優(yōu)化，分別是5μ1、10μ1、 15 μ 1。然后進(jìn)行電泳分析；(2)酶切時(shí)間的優(yōu)化取5個(gè)時(shí)間段對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是90min、120min、 150min、180min、210min然后進(jìn)行電泳分析；(3)酶切用酶量的優(yōu)化取三個(gè)酶的用量對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是2 μ 1、3 μ 1、 4μ1;然后進(jìn)行電泳分析。所述步驟h為對(duì)各驗(yàn)藻種進(jìn)行了 RFLP酶切實(shí)驗(yàn)，在酶切之后固定凝膠濃度以及 電泳的電壓、電泳時(shí)間因素，并作出其酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分藻種。所述步驟i為對(duì)未知藻種進(jìn)行培養(yǎng)，提取DNA，對(duì)藻種進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段 后對(duì)目的片段進(jìn)行酶切，酶切后進(jìn)行電泳，得到電泳圖譜后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，對(duì)電泳圖 譜的分析，應(yīng)根據(jù)電泳圖譜中酶切樣品的片段數(shù)以及片段和marker的相對(duì)位置來確定，其 中，條帶片段大小估算公式L = (WX C)+D
L 為條帶分子量W 目標(biāo)條帶所處的兩條marker之間的比例位置C 為條帶所處的兩條marker片段差值D 兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，RFLP作為一種分子多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)手段，其主要功能在于對(duì)生物物種的差性的區(qū)分，作為一種用于鑒定的赤潮藻種的分子生態(tài)學(xué)手段，可以作為傳統(tǒng)鑒 定方法的補(bǔ)充和輔助手段。而本發(fā)明，基于FELP建立特征性圖譜，將整個(gè)流程標(biāo)準(zhǔn)化，將有 利于對(duì)赤潮藻種進(jìn)行快速簡捷的初步鑒定。


圖1整體模擬酶切電泳結(jié)果圖。圖2為酶切樣品量的優(yōu)化。圖3酶切用酶量優(yōu)化。圖4酶切時(shí)間的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。圖5為判斷結(jié)果示意圖
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其中，包括以下步驟a、模擬實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表的建立b、模擬酶切電泳圖譜C、模擬酶切和實(shí)際酶切對(duì)照實(shí)驗(yàn)d、實(shí)際酶切實(shí)驗(yàn)e、模擬酶切實(shí)驗(yàn)f、模擬酶切實(shí)驗(yàn)和實(shí)際酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比g、酶切實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化h、RFLP圖譜的建立i、基于RFLP技術(shù)的赤潮藻種鑒定。所述步驟a為將實(shí)驗(yàn)藻種序列信息錄入excel軟件，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)用到的限制性內(nèi) 切酶的酶切信息，通過excel軟件，作出酶切片段數(shù)和長度的信息，建立初級(jí)酶切信息數(shù)據(jù)表。所述步驟b為根據(jù)步驟a模擬數(shù)據(jù)表建立的信息，進(jìn)行篩選，從中挑選出限制性 內(nèi)切酶，運(yùn)用Vector NTI Suite 9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對(duì)實(shí)驗(yàn)藻種序列進(jìn)行模 擬的酶切，并跑出模擬電泳圖，根據(jù)此初步判斷其區(qū)分鑒別程度。所述步驟c為選取部分實(shí)驗(yàn)藻種進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，并與的模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)， 驗(yàn)證模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際試驗(yàn)的吻合程度，其中，反應(yīng)體系為總體積30μ 1，其中18S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物15 μ 1，酶切反應(yīng)緩沖液5 μ 1， 內(nèi)切酶3μ 1，滅菌重蒸水7μ 1 ；反應(yīng)時(shí)間為65°C條件下90min，其酶切產(chǎn)物也用凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖凝膠濃度為1%，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。所述步驟d為選取實(shí)驗(yàn)藻種對(duì)選擇的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作出酶切電泳圖， 作出單個(gè)的藻種酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分，并對(duì)相關(guān)酶切實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。所述步驟e為對(duì)照模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建赤潮藻種的RFLP圖庫，并 在此基礎(chǔ)上建立標(biāo)準(zhǔn)化的基于RELP技術(shù)的赤潮藻種分類鑒定方法，對(duì)試驗(yàn)藻進(jìn)行了五次 的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算條帶大小。所述步驟f為收集實(shí)驗(yàn)藻種18S rDNA序列信息，并綜合主要限制性內(nèi)切酶的信 息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫和Vector NTI Suite 9軟件，選取用酶，作出模擬電泳圖，優(yōu)選為Taq I酶 作為實(shí)驗(yàn)用酶；計(jì)算模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際實(shí)驗(yàn)的對(duì)比結(jié)果，計(jì)算實(shí)際實(shí)驗(yàn)的條帶數(shù)和條帶大小 的位置是否與擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。所述步驟g為
(1)酶切樣品量的優(yōu)化取三個(gè)酶切對(duì)象的量進(jìn)行優(yōu)化，分別是5μ 1、10μ 1、 15 μ 1。然后進(jìn)行電泳分析；(2)酶切時(shí)間的優(yōu)化取5個(gè)時(shí)間段對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是90min、120min、 150min、180min、210min然后進(jìn)行電泳分析；(3)酶切用酶量的優(yōu)化取三個(gè)酶的用量對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是2 μ 1、3 μ 1、 4μ1;然后進(jìn)行電泳分析。所述步驟h為對(duì)各驗(yàn)藻種進(jìn)行了 RFLP酶切實(shí)驗(yàn)，在酶切之后固定凝膠濃度以及 電泳的電壓、電泳時(shí)間因素，并作出其酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分藻種。所述步驟i為對(duì)未知藻種進(jìn)行培養(yǎng)，提取DNA，對(duì)藻種進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段 后對(duì)目的片段進(jìn)行酶切，酶切后進(jìn)行電泳，得到電泳圖譜后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，對(duì)電泳圖 譜的分析，應(yīng)根據(jù)電泳圖譜中酶切樣品的片段數(shù)以及片段和marker的相對(duì)位置來確定，其 中，條帶片段大小估算公式L = (WX C)+DL 為條帶分子量W 目標(biāo)條帶所處的兩條marker之間的比例位置C 為條帶所處的兩條marker片段差值D 兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)。其中，如圖1所示為整體模擬酶切電泳結(jié)果圖。在模擬實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合序列信息 和酶切結(jié)果的初步分析，對(duì)近百種常用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行了篩選，并從中Taq I酶作 為實(shí)驗(yàn)用酶。從模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，對(duì)于選取用酶Taq I，大多實(shí)驗(yàn)藻種的區(qū)分度比較 好，在四種原甲藻中，海洋原甲藻(Prorocentrummicans)禾口東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)以及微小原甲藻(Prorocentrum minimum)區(qū)分比較明顯，和三角棘原甲藻 (Prorocentrumtriestinum)不能區(qū)分，但是Taq I把原甲藻和其他藻種區(qū)分開來。米氏凱 倫藻(Karenia mikimotoi)和短凱倫藻(Karenia brevis)以及裸甲藻(Gymnodinium)不 能區(qū)分，但這三種藻的Taq I的酶切圖譜一致，將它們和其他藻種區(qū)分開來。旋鏈角毛藻 (Chaetoceros curvisetu)禾口柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)也不能區(qū)分，但這兩種藻的Taq I的酶切圖譜一致，將它們和其他藻種區(qū)分開來?？偟膩碚f，除了上述幾種藻種以外，其他實(shí)驗(yàn)藻種在Taq I酶的作用下，酶切圖譜 區(qū)分比較明顯，能把大多數(shù)實(shí)驗(yàn)藻種分開，是一個(gè)比較合適的實(shí)驗(yàn)用酶。如圖2 所示，DNA marker DL2000 (長度片段分別為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、 250bp、100bp)②東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)樣品量5μ 1③東海原甲藻 (Prorocentrum donghaiense)樣品量10 μ 1@東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense) 樣品量15μ1。
如圖3所示DNA marker DL2000 (長度片段分別為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、 250bp、100bp)②Taq I酶用量4μ 1③Taq I酶用量3μ 1④Taq I酶用量2μ 1。如圖4所示DNA marker DL2000 (長度片段分別為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、 250bp、IOObp)②酶切時(shí)間為210min③酶切時(shí)間為150min④酶切時(shí)間為150min ⑤酶切 時(shí)間為120min ⑥酶切時(shí)間為90min酶切優(yōu)化實(shí)驗(yàn)從三個(gè)方面分別進(jìn)行了優(yōu)化，以尋求最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)時(shí)間。 在酶切樣品量的優(yōu)化方面，可以看到，隨著酶切樣品量的增加，其亮度也在逐漸增加(圖 2)，但是由于內(nèi)切酶本身的酶切能力的限制，所以如果樣品過多，可能會(huì)導(dǎo)致酶切反應(yīng)不完 全。通過酶切樣品的梯度優(yōu)化，一般可以認(rèn)為，加入酶切樣品15 μ 1是一個(gè)比較合適的量。 其亮度基本和marker —致，并且酶切完全。在內(nèi)切酶用量的優(yōu)化方面，可以看到，(圖3)隨 著內(nèi)切酶用量的增加，在時(shí)間一定的情況下，其產(chǎn)物條帶越來越弱，從本實(shí)驗(yàn)得出，其酶切 用酶量在3μ 1的時(shí)候?yàn)槔硐胗昧?。在酶切時(shí)間的優(yōu)化方面，分別取五個(gè)時(shí)間段對(duì)酶切實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行了優(yōu)化(圖4)，酶切時(shí)間在90min的時(shí)候其亮度比較好，其后酶切產(chǎn)物亮度隨著時(shí)間的 推移逐漸變淡。所以，總的來說，為了得帶高質(zhì)量的酶切片段，應(yīng)對(duì)酶切實(shí)驗(yàn)的三個(gè)方面進(jìn) 行優(yōu)化并確定最優(yōu)條件。本實(shí)驗(yàn)確定為酶切樣品量為15 μ 1，內(nèi)切酶用量為3 μ 1，酶切時(shí)間 為 90mino酶切實(shí)驗(yàn)從三個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化并確定最優(yōu)條件。本實(shí)驗(yàn)確定酶切樣品量為15 μ 1， 內(nèi)切酶用量為3 μ 1，酶切時(shí)間為90min。RFLP作為一種分子多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)手段，其主要功能在于對(duì)生物物種的差性的區(qū) 分，作為一種用于鑒定的赤潮藻種的分子生態(tài)學(xué)手段，可以作為傳統(tǒng)鑒定方法的補(bǔ)充和輔 助手段。對(duì)于整個(gè)RFLP流程來說，其標(biāo)準(zhǔn)化的方式很重要，將整個(gè)流程標(biāo)準(zhǔn)化，將有利于 對(duì)赤潮藻種進(jìn)行快速簡捷的初步鑒定。流程如下對(duì)未知藻種進(jìn)行培養(yǎng)，提取DNA，對(duì)藻種進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段后對(duì)目的片段進(jìn) 行酶切，酶切后進(jìn)行電泳，得到電泳圖譜后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，對(duì)電泳圖譜的分析，應(yīng)根 據(jù)電泳圖譜中酶切樣品的片段數(shù)以及片段和marker的相對(duì)位置來確定。條帶片段大小估算公式L = (WX C)+DL 為條帶分子量W:目標(biāo)條帶所處的兩條marker之間的比例位置(如圖23中③條帶與250bp條帶 間距離為a,與500bp條帶間距離為b，則W = a/ (a+b)C 為條帶所處的兩條marker片段差值
D 兩條marker條帶中較小的一條的分子量酶切電泳標(biāo)準(zhǔn)體系 例在圖5中，首先判定目標(biāo)藻種具有三條條帶，①條帶位于750bp條帶以 上大約五分之一處、通過條帶和marker的相對(duì)位置，計(jì)算得知其片段分子量大約為 750+(1000-750)/5 = 810bp。同理，②條帶位于750bp條帶以下大約五分之二處、可計(jì)算出 其片段大約為650bp左右。③條帶位于250bp條帶以上大約二分之一處，可計(jì)算出其片段 大約為350bp左右，根據(jù)以上信息可返回圖庫進(jìn)行對(duì)比，對(duì)比得知圖譜和東海原甲藻一致， 即可初步判定其為東海原甲藻。為了驗(yàn)證公式，對(duì)東海原甲藻進(jìn)行了五次的重復(fù)酶切，并計(jì)算條帶大小，條帶大小 結(jié)果。五次重復(fù)酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果后計(jì)算條帶分子量結(jié)果如下，可以看出，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差比較 穩(wěn)定，可以用來進(jìn)行一個(gè)條帶分子量大小的估算。驗(yàn)證條帶大小公式的重復(fù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算結(jié)果
權(quán)利要求
一種建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，包括以下步驟a、模擬實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表的建立b、模擬酶切電泳圖譜c、模擬酶切和實(shí)際酶切對(duì)照實(shí)驗(yàn)d、實(shí)際酶切實(shí)驗(yàn)e、模擬酶切實(shí)驗(yàn)f、模擬酶切實(shí)驗(yàn)和實(shí)際酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比g、酶切實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化h、RFLP圖譜的建立i、基于RFLP技術(shù)的赤潮藻種鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟a 為將實(shí)驗(yàn)藻種序列信息錄入excel軟件，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)用到的限制性內(nèi)切酶的酶切信息，通 過excel軟件，作出酶切片段數(shù)和長度的信息，建立初級(jí)酶切信息數(shù)據(jù)表。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟b 為根據(jù)步驟a模擬數(shù)據(jù)表建立的信息，進(jìn)行篩選，從中挑選出限制性內(nèi)切酶，運(yùn)用Vector NTI Suite 9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對(duì)實(shí)驗(yàn)藻種序列進(jìn)行模擬的酶切，并跑出模擬 電泳圖，根據(jù)此初步判斷其區(qū)分鑒別程度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟c 為選取部分實(shí)驗(yàn)藻種進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，并與的模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際 試驗(yàn)的吻合程度，其中，反應(yīng)體系為總體積30 μ 1，其中18S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物15 μ 1，酶切反應(yīng)緩沖液5 μ 1，內(nèi) 切酶3μ 1，滅菌重蒸水7μ 1 ；反應(yīng)時(shí)間為65°C條件下90min，其酶切產(chǎn)物也用凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖凝膠濃度為 1%，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟d 為選取實(shí)驗(yàn)藻種對(duì)選擇的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作出酶切電泳圖，作出單個(gè)的藻種酶切 圖譜，用于鑒別和區(qū)分，并對(duì)相關(guān)酶切實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟e 為對(duì)照模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建赤潮藻種的RFLP圖庫，并在此基礎(chǔ)上建立標(biāo) 準(zhǔn)化的基于RELP技術(shù)的赤潮藻種分類鑒定方法，對(duì)試驗(yàn)藻進(jìn)行了五次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算 條帶大小。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟 f為收集實(shí)驗(yàn)藻種18S rDNA序列信息，并綜合主要限制性內(nèi)切酶的信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫和 Vector NTI Suite 9軟件，選取用酶，作出模擬電泳圖，優(yōu)選為Taq I酶作為實(shí)驗(yàn)用酶；計(jì) 算模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際實(shí)驗(yàn)的對(duì)比結(jié)果，計(jì)算實(shí)際實(shí)驗(yàn)的條帶數(shù)和條帶大小的位置是否與擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟g為(1)酶切樣品量的優(yōu)化取三個(gè)酶切對(duì)象的量進(jìn)行優(yōu)化，分別是5μ 1、10μ 1、15μ 1，然后進(jìn)行電泳分析；(2)酶切時(shí)間的優(yōu)化取5個(gè)時(shí)間段對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是90min、120min、150min、 180min、210min然后進(jìn)行電泳分析；(3)酶切用酶量的優(yōu)化取三個(gè)酶的用量對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是2μ 1、3 μ 1、4 μ 1 ； 然后進(jìn)行電泳分析。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟h 為對(duì)各驗(yàn)藻種進(jìn)行了 RFLP酶切實(shí)驗(yàn)，在酶切之后固定凝膠濃度以及電泳的電壓、電泳時(shí) 間因素，并作出其酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分藻種。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟 i為對(duì)未知藻種進(jìn)行培養(yǎng)，提取DNA，對(duì)藻種進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段后對(duì)目的片段進(jìn)行酶 切，酶切后進(jìn)行電泳，得到電泳圖譜后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，對(duì)電泳圖譜的分析，應(yīng)根據(jù)電 泳圖譜中酶切樣品的片段數(shù)以及片段和marker的相對(duì)位置來確定，其中，條帶片段大小估算公式L = (WXC) +DL 為條帶分子量W 目標(biāo)條帶所處的兩條marker之間的比例位置C 為條帶所處的兩條marker片段差值D 兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其中，包括以下步驟a、模擬實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表的建立，b、模擬酶切電泳圖譜，c、模擬酶切和實(shí)際酶切對(duì)照實(shí)驗(yàn)，d、實(shí)際酶切實(shí)驗(yàn)，e、模擬酶切實(shí)驗(yàn)，f、模擬酶切實(shí)驗(yàn)和實(shí)際酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比，g、酶切實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，h、RFLP圖譜的建立，i、基于RFLP技術(shù)的赤潮藻種鑒定。本發(fā)明作為一種用于鑒定的赤潮藻種的分子生態(tài)學(xué)手段，可以作為傳統(tǒng)鑒定方法的補(bǔ)充和輔助手段。本發(fā)明基于FELP建立特征性圖譜，將整個(gè)流程標(biāo)準(zhǔn)化，將有利于對(duì)赤潮藻種進(jìn)行快速簡捷的初步鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101864485SQ201010184808
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者于志剛, 張濤, 甄毓, 米鐵柱 申請(qǐng)人:中國海洋大學(xué)