專利名稱：：有害赤潮生物細胞表面特異性抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗體，尤其是涉及一種具有高特異性和靈敏度的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
：目前，有害赤潮藻的抗體制備已有報道。亓海剛等(亓海剛，米鐵柱，辛澤毓，等.赤潮異彎藻抗體的制備及酶聯(lián)免疫檢測方法的建立[J].海洋學報，2006，28(5):167-172)報道了制備赤潮異彎藻抗體。向軍儉等(向軍儉，凌欽婕，呂頌輝，等.四種赤潮藻多克隆抗體的制備及特異性分析[J].暨南大學學報，2005，26(5):700-704)制備了四種赤潮藻的抗體血清及赤潮藻的單克隆抗體。向軍儉等(向軍儉，朱小兵，呂頌輝，等.五種赤潮藻單克隆抗體的制備[J].暨南大學學報，2003，24(3):103-108)還制備了五種赤潮藻單克隆抗體。但是涉及有害赤潮生物細胞表面抗體制備的相關(guān)技術(shù)鮮有報道，并且在有害赤潮生物細胞表面抗體制備過程中經(jīng)常被細胞內(nèi)蛋白污染，很難獲得特異型高的抗體。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的有害赤潮生物細胞表面抗體制備過程中容易被細胞內(nèi)蛋白污染，很難獲得特異型高的抗體等問題，提供一種有害赤潮生物細胞表面特異性抗體及其制備方法。本發(fā)明所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體為機體在赤潮藻表面抗原物質(zhì)刺激下，由B細胞分化成的漿細胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。本發(fā)明所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體的制備方法包括以下步驟-1)制備抗原抗原是一種能誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的大分子物質(zhì)，用多聚甲醛分別固定東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻細胞表面蛋白，然后用PBS洗滌藻細胞，得不被胞內(nèi)蛋白污染的東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細胞表面抗原；2)注射抗原將東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細胞表面抗原與完全福式佐劑混合，將混合液注射入43)強化注射注射抗原后再強化注射，強化注射時東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細胞表面抗原與不完全福式佐劑混合，其它操作與步驟2相同；4)檢測抗體效價于收集抗體血清之前的38天收集新西蘭白兔耳靜脈血液，檢測抗體產(chǎn)生情況；5)收集抗體血清最后一次注射后的第35天收集實驗兔的全血液，靜置，離心，收集血清后分裝，貯存。按質(zhì)量百分比，多聚甲醛的濃度最好為0.5%。用PBS洗滌藻細胞最好至少2次?？乖且环N能誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)等。按體積比，東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細胞表面抗原完全福式佐劑最好為1:1，所述新西蘭白兔最好是年齡為36個月的新西蘭白兔；所述注射可采用皮下注射，注射的部位最好為腋窩與腹股溝，注射的量最好每只兔子每次注入的藻個體數(shù)分別為1.0xl(^個東海原甲藻和2.0><106個亞歷山大藻。強化注射最好24次，每次強化注射的間隔時間為510天(以初次注射為第0天)。檢測抗體產(chǎn)生情況可采用酶聯(lián)免疫檢測方法(ELISA)檢測。收集實驗兔的全血液可采用頸部動脈取血的方法，靜置的時間最好為30min2h。本發(fā)明采用0.5%的多聚甲醛分別固定東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻細胞表面蛋白，然后用PBS洗滌藻細胞，可以得到不被胞內(nèi)蛋白污染的抗原。東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻細胞膜會破碎，細胞內(nèi)的蛋白溢出，并隨著PBS洗脫掉，細胞內(nèi)的蛋白不會作為抗原而產(chǎn)生抗體，從而不會污染細胞表面抗原產(chǎn)生的抗體。采用PBS緩沖液洗漆抗原，可以使得細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白洗滌出來，包括一些毒素等。這是因為藻細胞洗過多聚甲醛固定后，會導(dǎo)致藻細胞的質(zhì)膜部分穿孔，從而使得細胞內(nèi)的蛋白跑出。PBS的洗滌過程不會洗脫掉細胞表面蛋白，因為這些蛋白經(jīng)過多聚甲醛的固定，對蛋白質(zhì)交聯(lián)從而起到固定作用，保持細胞表面蛋白穩(wěn)定、形態(tài)結(jié)構(gòu)完好。PBS洗滌抗原的步驟是非常重要的，沒有洗滌的抗原會因為細胞內(nèi)的蛋白在免疫過程中形成抗體，從而會引起后面細胞表面蛋白的交叉反應(yīng)。本發(fā)明方法的有益效果是，用多聚甲醛固定蛋白質(zhì)的同時，使細胞表面各成分交聯(lián)，保持細胞結(jié)構(gòu)度，并且用PBS很容易的洗滌除去胞內(nèi)蛋白及其他污染，制備了無交叉反應(yīng)的高特異性有害赤潮藻表面抗體。對于藻類赤潮，利用該抗體可以迅速的檢測相對應(yīng)的赤潮藻種，檢測極限可以達到十幾個細胞。圖l是東海原甲藻抗體免疫熒光識別細胞表面蛋白圖。在圖1中，A、B、C是東海原甲藻全細胞、細胞殼壁、細胞質(zhì)體免疫熒光圖，D、E、F是東海原甲藻全細胞、細胞殼壁、細胞質(zhì)體明場圖；標尺為2tim。圖2是鏈狀亞歷山大藻抗體免疫熒光識別細胞表面蛋白圖。在圖2中，G、H、I是鏈狀亞歷山大藻全細胞、細胞殼壁、細胞質(zhì)體免疫熒光，J、K、F是鏈狀亞歷山大藻全細胞、細胞殼壁、細胞質(zhì)體明場圖；標尺為4nm。圖3是東海原甲藻抗體免疫印跡識別細胞表面蛋白圖。在圖3中，A是鏈狀亞歷山大藻細胞表面蛋白銀染圖，B是鏈狀亞歷山大藻細胞表面蛋白免疫印跡圖。圖4是鏈狀亞歷山大藻抗體免疫印跡識別細胞表面蛋白圖。在圖4中，C是東海原甲藻細胞殼表面蛋白銀染圖，D是東海原甲藻細胞表面蛋白免疫印跡圖。具體實施例方式以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。本發(fā)明方法采用0.5%的多聚甲醛分別固定東海原甲藻(尸raroce欣"附A"g/^e"5e)和鏈狀亞歷山大藻C4/m^n'鵬c她"e/to)細胞表面蛋白，細胞用0.5%多聚甲醛固定2h或4。C過夜后，以10,000g離心力收集藻液，去除固定液后，用PBS緩沖液洗滌3次，然后將藻液懸浮于PBS緩沖液(磷酸緩沖液)中。將制備的東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細胞表面抗原與等體積的完全福式佐劑完全混合。然后將混合液注射入選取的年齡為36個月的新西蘭白兔內(nèi)。注射采用皮下注射，注射點分別為腋窩與腹股溝。每只兔子每次注入的藻個體數(shù)分別為1.0x107個東海原甲藻和2.0x106個亞歷山大藻。強化注射時間分別是在第14、21、49天(以初次注射為第0天)。強化注射時全細胞抗原與不完全福式佐劑混合，其它操作與上相同。于第35天收集兔子耳靜脈血液，檢測抗體產(chǎn)生情況。第59天，采用頸部動脈取血的方法收集實驗兔的全血液。兔全血液收集后于室溫靜置30min2h后離心，收集血清后分裝、貯存于一20。C冰箱中。東海原甲藻抗體與其它藻種的免疫熒光交叉反應(yīng)結(jié)果參見表1，鏈狀亞歷山大藻抗體與其它藻種的免疫熒光交叉反應(yīng)結(jié)果參見表2。表1和表2中免疫熒光標記強度"3+"代表強標記，"+，，代表低標記，"-"代表無標記，表1和2中沒有中等標記。6表l藻種名稱稀釋度i:畫E&慮麵CCMPPfrfe對i蹦附March，1998HK鵬'w"譲HKi附/owwDYW爿.efl敏e/to爿.柳.w幽附C力/,C&ae阮emssp+++3+3+7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1.有害赤潮生物細胞表面特異性抗體，其特征在于為機體在赤潮藻表面抗原物質(zhì)刺激下，由B細胞分化成的漿細胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。2.如權(quán)利要求1所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)制備抗原抗原是一種能誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的大分子物質(zhì)，用多聚甲醛分別固定東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻細胞表面蛋白，然后用PBS洗滌藻細胞，得不被胞內(nèi)蛋白污染的東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細胞表面抗原；2)注射抗原-將東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細胞表面抗原與完全福式佐劑混合，將混合液注射入新西蘭白兔內(nèi)3)強化注射注射抗原后再強化注射，強化注射時東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細胞表面抗原與不完全福式佐劑混合，其它操作與步驟2)相同；4)檢測抗體效價于收集抗體血清之前的38天收集新西蘭白兔耳靜脈血液，檢測抗體產(chǎn)生情況；5)收集抗體血清最后一次注射后的第35天收集實驗兔的全血液，靜置，離心，收集血清后分裝，貯存。3.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于按質(zhì)量百分比，多聚甲醛的濃度為0.5%。4.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于用PBS洗滌藻細胞至少2次。5.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于抗原是一種能誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)的大分子物質(zhì)。6.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于按體積比，東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細胞表面抗原完全福式佐劑為1:1。7.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于所述新西蘭白兔是年齡為36個月的新西蘭白兔。8.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于所述注射采用皮下注射，注射的部位為腋窩與腹股溝，注射的量每只兔子每次注入的藻個體數(shù)分別為1.(^107個東海原甲藻和2.0xl()S個亞歷山大藻。9.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于強化注射24次，每次強化注射的間隔時間為510天。10.如權(quán)利要求2所述的有害赤潮生物細胞表面特異性抗體的制備方法，其特征在于檢測抗體產(chǎn)生情況采用酶聯(lián)免疫檢測方法檢測；收集實驗兔的全血液采用頸部動脈取血的方法，靜置的時間為30min2h。全文摘要有害赤潮生物細胞表面特異性抗體及其制備方法，涉及一種抗體。提供一種有害赤潮生物細胞表面特異性抗體及其制備方法。抗體為機體在赤潮藻表面抗原物質(zhì)刺激下，由B細胞分化成的漿細胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白。先制備不被胞內(nèi)蛋白污染的東海原甲藻和鏈狀亞歷山大藻全細胞表面抗原，再與完全福式佐劑混合，將混合液注射入新西蘭白兔內(nèi)，注射抗原后再強化注射；于收集抗體血清之前的3～8天收集新西蘭白兔耳靜脈血液，檢測抗體產(chǎn)生情況；最后一次注射后的第3～5天收集實驗兔的全血液，靜置，離心，收集血清后分裝，貯存。對于藻類赤潮，利用該抗體可以迅速的檢測相對應(yīng)的赤潮藻種，檢測極限可以達到十幾個細胞。文檔編號C07K16/14GK101486765SQ200910111080公開日2009年7月22日申請日期2009年2月20日優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日發(fā)明者成李,洪華生,王大志,荔陳,黃旭光申請人:廈門大學