專利名稱：：一種赤潮藻種快速鑒定的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及海洋浮游植物種類和/或數(shù)量檢測(cè)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種赤潮藻種快速鑒定的方法。
背景技術(shù)：
：在富饒的海洋世界里，有著許許多多的海洋生物，除了有形式各樣的海洋魚類等海洋動(dòng)物，還有著為海洋提供基礎(chǔ)生產(chǎn)力的海洋植物。它們分布于海洋的各個(gè)層面，而作為海洋植物主要組成部分的海洋藻類，是人類的一大寶貴的自然財(cái)富，它們可以作為食物，也可以做成保健藥品。人們根據(jù)海洋藻類的不同的生活習(xí)慣，把它們分為底棲藻和浮游藻兩大類型。浮游藻藻體僅由一個(gè)細(xì)胞組成，又稱為單細(xì)胞藻類，是一類具有色素或色素體能進(jìn)行光合作用，并制造有機(jī)物的自養(yǎng)型單細(xì)胞浮游生物。它們是海洋中最重要的初級(jí)生產(chǎn)者，也是海洋生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈中最基礎(chǔ)的一環(huán)。浮游藻能漂浮或懸浮在有光的水面上做極其微弱的浮動(dòng)，與其適應(yīng)漂浮生活的各種體型是分不開的。有的浮游藻為了增大與水面接觸的表面積，其細(xì)胞周圍生出一圈刺毛、長(zhǎng)長(zhǎng)的刺或突起物，還有的成群結(jié)隊(duì)的積在一塊，以擴(kuò)大表面積來(lái)利于漂浮。浮游藻植物形狀各有特色，有紡錘形、扇形、星形等。它們多數(shù)是單細(xì)胞的，也有許多是由單細(xì)胞結(jié)合起來(lái)的群體。絕大多數(shù)浮游植物的個(gè)體都非常微小，只有幾個(gè)至幾百微米，只能在顯微鏡下才能看清楚其形態(tài)結(jié)構(gòu)，但其數(shù)量極多，代謝活動(dòng)強(qiáng)烈。雖然浮游藻形體微小，運(yùn)動(dòng)能力較弱，但它的存在對(duì)整個(gè)地球生態(tài)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)是極其重要的。首先，浮游藻處于有光的水體表面，它們?cè)谒孢M(jìn)行光合作用，固定無(wú)機(jī)碳，使之轉(zhuǎn)化為碳水化合物。據(jù)估計(jì)，全球約50%的初級(jí)生物力源于海洋，而海洋浮游植物又是海洋初級(jí)生產(chǎn)力的最主要來(lái)源，僅硅藻一類就貢獻(xiàn)了海洋初級(jí)生產(chǎn)力的60%。其次，浮游藻類是為地球提供化合氮的重要生物，如藍(lán)藻。最后，海洋浮游植物位于海洋食物鏈的最底層，它們是小型海洋動(dòng)物，尤其是海洋動(dòng)物幼體的直接或間接餌料。某個(gè)海域浮游植物的生物量和多樣性直接影響該區(qū)域其它高級(jí)動(dòng)物的多樣性和分布。赤潮是海水中某些單細(xì)胞藻類，原生動(dòng)物或細(xì)菌在一定的環(huán)境條件下爆發(fā)性增殖或聚集在一起而引起水體變色的一種生態(tài)異?，F(xiàn)象。一般稱藻類大量繁殖的現(xiàn)象為藻華，赤潮也被稱為有害藻華。赤潮是一種自然生態(tài)現(xiàn)象，也是一種人為因素引起的有害生態(tài)現(xiàn)象。赤潮一般可分為有毒赤潮與無(wú)毒赤潮兩類。有毒赤潮是指赤潮生物體內(nèi)含有某種毒素或能分泌出毒素的生物形成的赤潮。有毒赤潮一旦形成，可對(duì)赤潮區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)、海洋漁業(yè)、海洋環(huán)境、以及人體健康造成不同程度的損害。無(wú)毒赤潮是指生物體內(nèi)不含毒素，又不分泌毒素的生物體為主形成的赤潮。無(wú)毒赤潮對(duì)海洋生態(tài)、海洋環(huán)境、海洋漁業(yè)也會(huì)產(chǎn)生不同程度的損害。除了根據(jù)毒素的有無(wú)對(duì)赤潮進(jìn)行劃分外，赤潮還可以根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)有以下不同的分類方法。首先，根據(jù)赤潮爆發(fā)的地點(diǎn)，可分為外海性赤潮和近岸、內(nèi)灣性赤潮。由于大洋上升流區(qū)或水團(tuán)交匯處營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比較豐富，容易爆發(fā)外海性赤潮。在中國(guó)主要分布于東海以南水域。近岸、內(nèi)灣、河口性赤潮，指發(fā)生于近岸區(qū)、內(nèi)灣區(qū)或河口區(qū)等水城的赤潮。其次，根據(jù)赤潮的來(lái)源可分為外來(lái)型和原發(fā)型赤潮。所謂外來(lái)型赤潮，是指不是在原海域形成的赤潮，而是在其他水域形成后，由于風(fēng)、浪、流等外力作用被帶到該海域的。其特點(diǎn)表現(xiàn)在持續(xù)時(shí)間比較短，有時(shí)候會(huì)把同一起赤潮的遷移誤認(rèn)為兩起發(fā)生在不同地方的赤潮。原發(fā)性赤潮是指原海域自身發(fā)生的赤潮，其特點(diǎn)是持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，而且會(huì)反復(fù)出現(xiàn)。一般而言在內(nèi)灣發(fā)生的赤潮大多是屬于原發(fā)性赤潮。最后，根據(jù)引發(fā)的赤潮的生物種類的多少，可分為單相型、雙相型和復(fù)合型赤潮。單相型赤潮是指赤潮爆發(fā)時(shí)，只有一個(gè)赤潮生物種占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。同理，雙相型即指兩種赤潮生物共存并同時(shí)占優(yōu)勢(shì)而形成的赤潮。復(fù)合型赤潮由三種以及三種以上赤潮生物所引起，且每種的數(shù)量都占有總數(shù)的20%以上。赤潮的危害主要表現(xiàn)在首先，大量的二氧化碳被赤潮所消耗，使水體酸堿度發(fā)生較大變化，從而影響海洋生物的群落結(jié)構(gòu)；在赤潮發(fā)生過(guò)程中，由于大量赤潮生物的瘋長(zhǎng)，阻擋了陽(yáng)光到達(dá)水體的深度，降低了水體的透明度，導(dǎo)致生長(zhǎng)于水體深層的水草和海洋動(dòng)物大量死亡，底層生物量銳減。其次，在赤潮生物瘋長(zhǎng)過(guò)程中，不但競(jìng)爭(zhēng)性消耗水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且分泌一些抑制其他生物生長(zhǎng)的物質(zhì)，如赤潮藻毒素。結(jié)果導(dǎo)致水體中赤潮生物占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而其他生物種類減少，嚴(yán)重破壞水體的生物多樣性。再次，赤潮生物的缺氧或造成水體累積大量硫化氫和甲烷，隔絕了海水與大氣圈的氣體交換，使很多海洋生物窒息或者中毒而死。最后，一些赤潮生物(如某些甲藻)產(chǎn)生的粘液附著在海洋動(dòng)物的鰓上，妨礙呼吸作用，使大型水生動(dòng)物窒息而死，給近海養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。許多赤潮生物含有毒素，該毒素可使海洋動(dòng)物因赤潮生物毒素的積累和食物鏈傳遞作用而中毒死亡或生長(zhǎng)繁殖受到影響。赤潮對(duì)人體健康的影響也很大，直接接觸會(huì)引起皮膚的不適，而一些揮發(fā)性毒素還可能能對(duì)眼睛和呼吸道產(chǎn)生影響，更主要的是由于食物鏈的傳遞作用，有害赤潮產(chǎn)生的赤潮生物毒素會(huì)導(dǎo)致人類的中毒甚至死亡。所以，研究建立赤潮的預(yù)警機(jī)制是必要的，而赤潮的預(yù)警需要了解其結(jié)構(gòu)的多樣性，則必須建立赤潮藻RELP的特征性圖譜，在建立過(guò)程中的PCR擴(kuò)增及條件優(yōu)化等，對(duì)快速鑒定赤潮藻種有重要影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，本發(fā)明運(yùn)用限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)Wtl^ii^PCR-RFLP,l^jM^ilM種的特征酶切圖譜，在此基礎(chǔ)上，發(fā)明了赤潮藻種的快速鑒定方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種赤潮藻種快速鑒定的方法，其中，包括以下步驟a、實(shí)驗(yàn)藻種m及其衍生培養(yǎng)基的配制b、引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證C、實(shí)驗(yàn)藻種18SrDNA片段的獲得d、PCR優(yōu)化及擴(kuò)增e、模擬酶切和實(shí)際酶切對(duì)照實(shí)驗(yàn)f、RFLP區(qū)分鑒別赤潮藻種。所述步驟a為f/2微量元素溶液向950mL重蒸水中加入成分FeC13·6H20,Na2EDTA·2H20，CuS04·5H20,Na2Mo04·2H20,ZnS04·7H20,CoC12·6H20,MnCl2·4H20,定容至1L，高溫滅菌。；f/2維生素溶液向950mL蒸餾水中加入200mgvit.Bl，加入Imlvit.H和vit.B12的儲(chǔ)存液，定容至1L，過(guò)濾滅菌，置于4°C；f/2培養(yǎng)基向950mL蒸溜水中加入成分NaN03，NaH2P04·H20，Na2Si03·9Η20，，并定溶至1L，高溫滅菌，儲(chǔ)存于4°C備用；f/2-Si培養(yǎng)基孔徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾新鮮海水1L，高溫滅菌，配方同f/2培養(yǎng)基，不加Na2Si03·9H20；f/50培養(yǎng)基孔徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾新鮮海水1L，高溫滅菌，冷卻至室溫后中添加40μ1營(yíng)養(yǎng)元素，40μ1微量元素溶液，20μ1維生素溶液，補(bǔ)充過(guò)濾新鮮海水至1L。所述步驟b為(1)實(shí)驗(yàn)藻種目標(biāo)序列(18SrDNA)信息的獲得和比對(duì)基于NCBI中的GenBankDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)信息，獲取實(shí)驗(yàn)藻種的18SrDNA序列的相關(guān)信息，并運(yùn)用DNAstar軟件對(duì)序列信息進(jìn)行對(duì)比，以搜尋合適的設(shè)計(jì)引物的區(qū)域；(2)實(shí)驗(yàn)藻種目標(biāo)序列(18SrDNA)對(duì)比和引物的設(shè)計(jì)根據(jù)DNAstar軟件序列對(duì)比的結(jié)果，通過(guò)PrimerPremier-v軟件對(duì)引物相關(guān)條件的設(shè)置，設(shè)計(jì)出最優(yōu)引物。所述步驟c為(1)實(shí)驗(yàn)藻種基因組DNA的提取與純化(2)PCR反應(yīng)(3)PCR的優(yōu)化選取18SrDNA序列，設(shè)計(jì)出引物1、引物2、引物3，其序列為引物1:18S(R):AACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S(F)TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC引物2:18SrDNA(R)TGTCTCAAAGATTAAGCCATG18SrDNA(F):ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA引物3:18SrDNA(l):ACCTGGTTGATCCTGCCAGT18SrDNA(2):TCACCTACGGAAACCTTGT。所述步驟d為(1)PCR反應(yīng)中Mg2+的濃度的優(yōu)化(2)PCR反應(yīng)中模板起始濃度的優(yōu)化(3)PCR反應(yīng)中引物起始濃度的優(yōu)化然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述步驟e為將實(shí)驗(yàn)藻種序列信息錄入excel軟件，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)用到的限制性內(nèi)切酶的酶切信息，通過(guò)excel軟件，作出酶切片段數(shù)和長(zhǎng)度的信息，建立初級(jí)酶切信息數(shù)據(jù)表；根據(jù)模擬數(shù)據(jù)表建立的信息，進(jìn)行篩選，從中挑選出限制性內(nèi)切酶，運(yùn)用VectorNTISuite9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對(duì)實(shí)驗(yàn)藻種序列進(jìn)行模擬的酶切，并跑出模擬電泳圖，根據(jù)此初步判斷其區(qū)分鑒別程度；選取部分實(shí)驗(yàn)藻種進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，并與的模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際試驗(yàn)的吻合程度，其中，反應(yīng)體系為總體積30μ1，其中18SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物15μ1，酶切反應(yīng)緩沖液5μ1，內(nèi)切酶3μ1，滅菌重蒸水7μ1；反應(yīng)時(shí)間為65°C條件下90min，其酶切產(chǎn)物也用凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖凝膠濃度為1%，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。所述步驟e進(jìn)一步包括如下步驟選取實(shí)驗(yàn)藻種對(duì)選擇的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作出酶切電泳圖，作出單個(gè)的藻種酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分，并對(duì)相關(guān)酶切實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)照模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建赤潮藻種的RFLP圖庫(kù)，并在此基礎(chǔ)上建立標(biāo)準(zhǔn)化的基于RELP技術(shù)的赤潮藻種分類鑒定方法，對(duì)試驗(yàn)藻進(jìn)行了五次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算條帶大小；收集實(shí)驗(yàn)藻種18SrDNA序列信息，并綜合主要限制性內(nèi)切酶的信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)和VectorNTISuite9軟件，選取用酶，作出模擬電泳圖，優(yōu)選為TaqI酶作為實(shí)驗(yàn)用酶；計(jì)算模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際實(shí)驗(yàn)的對(duì)比結(jié)果，計(jì)算實(shí)際實(shí)驗(yàn)的條帶數(shù)和條帶大小的位置是否與擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。所述步驟e進(jìn)一步包括如下步驟(1)酶切樣品量的優(yōu)化取三個(gè)酶切對(duì)象的量進(jìn)行優(yōu)化，分別是5μ1、10μ1、15μ1，然后進(jìn)行電泳分析；(2)酶切時(shí)間的優(yōu)化取5個(gè)時(shí)間段對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是90min、120min、150min、180min、210min然后進(jìn)行電泳分析；(3)酶切用酶量的優(yōu)化取三個(gè)酶的用量對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是2μ1、3μ1、4μ1;然后進(jìn)行電泳分析，對(duì)各驗(yàn)藻種進(jìn)行了RFLP酶切實(shí)驗(yàn)，在酶切之后固定凝膠濃度以及電泳的電壓、電泳時(shí)間因素，并作出其酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分藻種。所述步驟f為對(duì)未知藻種進(jìn)行培養(yǎng)，提取DNA，對(duì)藻種進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段后對(duì)目的片段進(jìn)行酶切，酶切后進(jìn)行電泳，得到電泳圖譜后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，對(duì)電泳圖譜的分析，應(yīng)根據(jù)電泳圖譜中酶切樣品的片段數(shù)以及片段和marker的相對(duì)位置來(lái)確定，其中，條帶片段大小估算公式L=(WXC)+DL為條帶分子量W目標(biāo)條帶所處的兩條marker之間的比例位置C為條帶所處的兩條marker片段差值D兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)。所述赤潮藻種快速鑒定的方法在檢測(cè)浮游生物群落結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，RFLP作為一種分子多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)手段，其主要功能在于對(duì)生物物種的差性的區(qū)分，作為一種用于鑒定的赤潮藻種的分子生態(tài)學(xué)手段，可以作為傳統(tǒng)鑒定方法的補(bǔ)充和輔助手段。而本發(fā)明，基于FELP建立特征性圖譜，將整個(gè)流程標(biāo)準(zhǔn)化，將有利于對(duì)赤潮藻種進(jìn)行快速簡(jiǎn)捷的初步鑒定。圖1整體模擬酶切電泳結(jié)果圖。圖2為酶切樣品量的優(yōu)化。圖3酶切用酶量?jī)?yōu)化。圖4酶切時(shí)間的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。圖5為判斷結(jié)果示意圖具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種赤潮藻種快速鑒定的方法，其中，包括以下步驟a、實(shí)驗(yàn)藻種m及其衍生培養(yǎng)基的配制b、引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證C、實(shí)驗(yàn)藻種18SrDNA片段的獲得d、PCR優(yōu)化及擴(kuò)增e、模擬酶切和實(shí)際酶切對(duì)照實(shí)驗(yàn)f、RFLP區(qū)分鑒別赤潮藻種。所述步驟a為f/2微量元素溶液向950mL重蒸水中加入成分FeC13·6H20,Na2EDTA·2H20，CuS04·5H20,Na2Mo04·2H20,ZnS04·7H20,CoC12·6H20,MnCl2·4H20,定容至1L，高溫滅菌。；f/2維生素溶液向950mL蒸餾水中加入200mgvit.Bl，加入Imlvit.H和vit.B12的儲(chǔ)存液，定容至1L，過(guò)濾滅菌，置于4°C；f/2培養(yǎng)基向950mL蒸餾水中加入成分NaN03，NaH2P04·H20,Na2Si03·9H20,，并定溶至1L，高溫滅菌，儲(chǔ)存于4°C備用；f/2-Si培養(yǎng)基孔徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾新鮮海水1L，高溫滅菌，配方同f/2培養(yǎng)基，不加Na2Si03·9H20；f/50培養(yǎng)基孔徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾新鮮海水1L，高溫滅菌，冷卻至室溫后中添加40μ1營(yíng)養(yǎng)元素，40μ1微量元素溶液，20μ1維生素溶液，補(bǔ)充過(guò)濾新鮮海水至1L。所述步驟b為(1)實(shí)驗(yàn)藻種目標(biāo)序列(18SrDNA)信息的獲得和比對(duì)基于NCBI中的GenBankDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)信息，獲取實(shí)驗(yàn)藻種的18SrDNA序列的相關(guān)信息，并運(yùn)用DNAstar軟件對(duì)序列信息進(jìn)行對(duì)比，以搜尋合適的設(shè)計(jì)引物的區(qū)域；(2)實(shí)驗(yàn)藻種目標(biāo)序列(18SrDNA)對(duì)比和引物的設(shè)計(jì)根據(jù)DNAstar軟件序列對(duì)比的結(jié)果，通過(guò)PrimerPremier-v軟件對(duì)引物相關(guān)條件的設(shè)置，設(shè)計(jì)出最優(yōu)引物。所述步驟c為(1)實(shí)驗(yàn)藻種基因組DNA的提取與純化(2)PCR反應(yīng)(3)PCR的優(yōu)化選取18SrDNA序列，設(shè)計(jì)出引物1、引物2、引物3，其序列為引物1:18S(R):AACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S(F)TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC引物2:18SrDNA(R)TGTCTCAAAGATTAAGCCATG18SrDNA(F):ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA引物3:18SrDNA(l):ACCTGGTTGATCCTGCCAGT18SrDNA(2):TCACCTACGGAAACCTTGT。所述步驟d為(I)PCR反應(yīng)中Mg2+的濃度的優(yōu)化(2)PCR反應(yīng)中模板起始濃度的優(yōu)化(3)PCR反應(yīng)中引物起始濃度的優(yōu)化然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所述步驟e為將實(shí)驗(yàn)藻種序列信息錄入excel軟件，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)用到的限制性內(nèi)切酶的酶切信息，通過(guò)excel軟件，作出酶切片段數(shù)和長(zhǎng)度的信息，建立初級(jí)酶切信息數(shù)據(jù)表；根據(jù)模擬數(shù)據(jù)表建立的信息，進(jìn)行篩選，從中挑選出限制性內(nèi)切酶，運(yùn)用VectorNTISuite9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對(duì)實(shí)驗(yàn)藻種序列進(jìn)行模擬的酶切，并跑出模擬電泳圖，根據(jù)此初步判斷其區(qū)分鑒別程度；選取部分實(shí)驗(yàn)藻種進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，并與的模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際試驗(yàn)的吻合程度，其中，反應(yīng)體系為總體積30μ1，其中18SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物15μ1，酶切反應(yīng)緩沖液5μ1，內(nèi)切酶3μ1，滅菌重蒸水7μ1；反應(yīng)時(shí)間為65°C條件下90min，其酶切產(chǎn)物也用凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖凝膠濃度為1%，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。所述步驟e進(jìn)一步包括如下步驟選取實(shí)驗(yàn)藻種對(duì)選擇的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作出酶切電泳圖，作出單個(gè)的藻種酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分，并對(duì)相關(guān)酶切實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)照模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建赤潮藻種的RFLP圖庫(kù)，并在此基礎(chǔ)上建立標(biāo)準(zhǔn)化的基于RELP技術(shù)的赤潮藻種分類鑒定方法，對(duì)試驗(yàn)藻進(jìn)行了五次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算條帶大??；收集實(shí)驗(yàn)藻種18SrDNA序列信息，并綜合主要限制性內(nèi)切酶的信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)和VectorNTISuite9軟件，選取用酶，作出模擬電泳圖，優(yōu)選為TaqI酶作為實(shí)驗(yàn)用酶；計(jì)算模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際實(shí)驗(yàn)的對(duì)比結(jié)果，計(jì)算實(shí)際實(shí)驗(yàn)的條帶數(shù)和條帶大小的位置是否與擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。所述步驟e進(jìn)一步包括如下步驟(1)酶切樣品量的優(yōu)化取三個(gè)酶切對(duì)象的量進(jìn)行優(yōu)化，分別是5μ1、10μ1、15μ1，然后進(jìn)行電泳分析；(2)酶切時(shí)間的優(yōu)化取5個(gè)時(shí)間段對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是90min、120min、150min、180min、210min然后進(jìn)行電泳分析；(3)酶切用酶量的優(yōu)化取三個(gè)酶的用量對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是2μ1、3μ1、4μ1;然后進(jìn)行電泳分析，對(duì)各驗(yàn)藻種進(jìn)行了RFLP酶切實(shí)驗(yàn)，在酶切之后固定凝膠濃度以及電泳的電壓、電泳時(shí)間因素，并作出其酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分藻種。所述步驟f為對(duì)未知藻種進(jìn)行培養(yǎng)，提取DNA，對(duì)藻種進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段后對(duì)目的片段進(jìn)行酶切，酶切后進(jìn)行電泳，得到電泳圖譜后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，對(duì)電泳圖譜的分析，應(yīng)根據(jù)電泳圖譜中酶切樣品的片段數(shù)以及片段和marker的相對(duì)位置來(lái)確定，其中，條帶片段大小估算公式L=(WXC)+DL為條帶分子量W目標(biāo)條帶所處的兩條marker之間的比例位置C為條帶所處的兩條marker片段差值D兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)。本發(fā)明中的藻種18SrDNA片段的獲得(1)實(shí)驗(yàn)藻種基因組DNA的提取與純化取30ml藻培養(yǎng)液加入到50ml的離心管中，8000rpm離心5分鐘。用500μITE緩沖液沖洗藻細(xì)胞，放入小離心管中。加預(yù)熱到55°C的抽提緩沖液(3%的CTAB;1%的Sarkocyl；20mM的EDTA,pH=8.0；14M的NaCl；0.IM的TriS-HCl；1%的α-疏基乙醇)，55°C處理30分鐘至60分鐘，前10分鐘每5分鐘顛倒混勻一次，之后每10分鐘混勻一次，每次混勻時(shí)顛倒離心管3-5次，直到透明。趁熱從每一管取75μ1細(xì)胞裂解液至一新離心管中。放入4°C冰箱，3分鐘之后，使之冷卻。每管加Iml氯仿/異戊醇(241)，輕柔顛倒使之呈乳濁狀。14000rpm，4°C離心10分鐘。小心取上層清液(600μ1-650μ1)至一新的離心管，加入1/10體積的NaAe(3Μ，ρΗ5.2)和2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇。-80°C靜置15分鐘或-20°C靜置2小時(shí)，使DNA沉淀。14000rpm，4°C離心10分鐘。70%乙醇沉淀2次。常溫放置干燥。用40μ1TE緩沖液溶解。(2)PCR反應(yīng)反應(yīng)體系:Mg2+(25mmol/L)4y1；10XPCR緩沖液5μ1；dNTP混合物(其中Τ、A、G、C各2.5mmmol/L)4y1；引物1μl(30ymol/L)；Taq聚合酶0.3μ1；DNA模板1μ1；用miIliQ水加至總體積為50μ1。程序?yàn)?4°C預(yù)變性IOmin；94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸90s；30個(gè)循環(huán)；延伸720CIOmin0PCR產(chǎn)物用凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖凝膠濃度1%，電壓130V，電泳時(shí)間30min，之后浸入2%的EB(溴化乙錠)中15min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。(3)PCR的優(yōu)化為了尋求最優(yōu)的PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)分別從PCR實(shí)驗(yàn)的以下幾個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化①M(fèi)g2+的濃度固定PCR的其它反應(yīng)條件，變化鎂離子的終濃度。本實(shí)驗(yàn)用于梯度變化為三個(gè)梯度，為別為加入5μ1Mg2+(25mmol/L)、4ylMg2+(25mmol/L)、3y1Mg2+(25mmol/L)。終濃度分別為2.5mmol/L、2mmol/L、1.5mmol/L。②DNA模板濃度固定PCR的其它反應(yīng)條件，對(duì)PCR反應(yīng)中DNA模板的濃度進(jìn)行變化。本實(shí)驗(yàn)對(duì)模板的起始濃度為5個(gè)梯度，及原模板稀釋10倍、20、50倍、100倍、200倍進(jìn)行PCR反應(yīng)。③引物的濃度固定PCR其它的反應(yīng)條件，對(duì)PCR反應(yīng)中引物的濃度進(jìn)行變化，本實(shí)驗(yàn)對(duì)PCR反應(yīng)中引物的濃度對(duì)東海原甲藻為三個(gè)梯度，及0.5μ1(30μmol/L)，1μ1(30μmol/L)，2μ1(30μmol/L)，其終濃度為0.3μmol/L,0.6μmol/L,L2μmol/L。對(duì)旋鏈角毛藻為兩個(gè)梯度，為1μ1(30μπιΟ1/υ，2μ1(30μπιΟ1/υ，其終濃度為0.6μπιΟ1/1，1.2μmol/L。④退火溫度固定PCR其它的反應(yīng)條件，對(duì)PCR反應(yīng)程序的退火溫度進(jìn)行變化，本實(shí)驗(yàn)對(duì)PCR反應(yīng)中的溫度分為8個(gè)梯度，每個(gè)梯度1°C從60°C降落到53°C。例如，用本發(fā)明快速鑒定赤潮藻種其中，如圖1所示為整體模擬酶切電泳結(jié)果圖。在模擬實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合序列信息和酶切結(jié)果的初步分析，對(duì)近百種常用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行了篩選，并從中TaqI酶作為實(shí)驗(yàn)用酶。從模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，對(duì)于選取用酶TaqI，大多實(shí)驗(yàn)藻種的區(qū)分度比較好，在四種原甲藻中，海洋原甲藻(Prorocentrummicans)禾口東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)以及微小原甲藻(Prorocentrumminimum)區(qū)分比較明顯，和三角棘原甲藻(Prorocentrumtriestinum)不能區(qū)分，但是TaqI把原甲藻和其他藻種區(qū)分開來(lái)。米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)和短凱倫藻(Kareniabrevis)以及裸甲藻(Gymnodinium)不能區(qū)分，但這三種藻的TaqI的酶切圖譜一致，將它們和其他藻種區(qū)分開來(lái)。旋鏈角毛藻(Chaetoceroscurvisetu)禾口柔弱角毛藻(Chaetocerosdebilis)也不能區(qū)分，但這兩種藻的TaqI的酶切圖譜一致，將它們和其他藻種區(qū)分開來(lái)?？偟膩?lái)說(shuō)，除了上述幾種藻種以外，其他實(shí)驗(yàn)藻種在TaqI酶的作用下，酶切圖譜區(qū)分比較明顯，能把大多數(shù)實(shí)驗(yàn)藻種分開，是一個(gè)比較合適的實(shí)驗(yàn)用酶。如圖2所示，DNAmarkerDL2000(長(zhǎng)度片段分別為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp)②東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)樣品量5μ1③東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)樣品量10μ1@東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)樣品量15μ1。如圖3所示DNAmarkerDL2000(長(zhǎng)度片段分別為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp)②TaqI酶用量4μ1③TaqI酶用量3μ1④TaqI酶用量2μ1。如圖4所示DNAmarkerDL2000(長(zhǎng)度片段分別為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp)②酶切時(shí)間為210min③酶切時(shí)間為150min④酶切時(shí)間為150min⑤酶切時(shí)間為120min⑥酶切時(shí)間為90min酶切優(yōu)化實(shí)驗(yàn)從三個(gè)方面分別進(jìn)行了優(yōu)化，以尋求最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)時(shí)間。在酶切樣品量的優(yōu)化方面，可以看到，隨著酶切樣品量的增加，其亮度也在逐漸增加(圖2)，但是由于內(nèi)切酶本身的酶切能力的限制，所以如果樣品過(guò)多，可能會(huì)導(dǎo)致酶切反應(yīng)不完全。通過(guò)酶切樣品的梯度優(yōu)化，一般可以認(rèn)為，加入酶切樣品15μ1是一個(gè)比較合適的量。其亮度基本和marker—致，并且酶切完全。在內(nèi)切酶用量的優(yōu)化方面，可以看到，(圖3)隨著內(nèi)切酶用量的增加，在時(shí)間一定的情況下，其產(chǎn)物條帶越來(lái)越弱，從本實(shí)驗(yàn)得出，其酶切用酶量在3μ1的時(shí)候?yàn)槔硐胗昧?。在酶切時(shí)間的優(yōu)化方面，分別取五個(gè)時(shí)間段對(duì)酶切實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了優(yōu)化(圖4)，酶切時(shí)間在90min的時(shí)候其亮度比較好，其后酶切產(chǎn)物亮度隨著時(shí)間的推移逐漸變淡。所以，總的來(lái)說(shuō)，為了得帶高質(zhì)量的酶切片段，應(yīng)對(duì)酶切實(shí)驗(yàn)的三個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化并確定最優(yōu)條件。本實(shí)驗(yàn)確定為酶切樣品量為15μ1，內(nèi)切酶用量為3μ1，酶切時(shí)間為90mino酶切實(shí)驗(yàn)從三個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化并確定最優(yōu)條件。本實(shí)驗(yàn)確定酶切樣品量為15μ1，內(nèi)切酶用量為3μ1，酶切時(shí)間為90min。RFLP作為一種分子多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)手段，其主要功能在于對(duì)生物物種的差性的區(qū)分，作為一種用于鑒定的赤潮藻種的分子生態(tài)學(xué)手段，可以作為傳統(tǒng)鑒定方法的補(bǔ)充和輔助手段。對(duì)于整個(gè)RFLP流程來(lái)說(shuō)，其標(biāo)準(zhǔn)化的方式很重要，將整個(gè)流程標(biāo)準(zhǔn)化，將有利于對(duì)赤潮藻種進(jìn)行快速簡(jiǎn)捷的初步鑒定。流程如下對(duì)未知藻種進(jìn)行培養(yǎng)，提取DNA，對(duì)藻種進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段后對(duì)目的片段進(jìn)行酶切，酶切后進(jìn)行電泳，得到電泳圖譜后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，對(duì)電泳圖譜的分析，應(yīng)根據(jù)電泳圖譜中酶切樣品的片段數(shù)以及片段和marker的相對(duì)位置來(lái)確定。條帶片段大小估算公式L=(WXC)+DL為條帶分子量W:目標(biāo)條帶所處的兩條marker之間的比例位置(如圖23中③條帶與250bp條帶間距離為a,與500bp條帶間距離為b，則W=a/(a+b)C為條帶所處的兩條marker片段差值D兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)程序<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>TaqI酶切標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>酶切電泳標(biāo)準(zhǔn)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>例在圖5中，首先判定目標(biāo)藻種具有三條條帶，①條帶位于750bp條帶以上大約五分之一處、通過(guò)條帶和marker的相對(duì)位置，計(jì)算得知其片段分子量大約為750+(1000-750)/5二810bp。同理，②條帶位于750bp條帶以下大約五分之二處、可計(jì)算出其片段大約為650bp左右。③條帶位于250bp條帶以上大約二分之一處，可計(jì)算出其片段大約為350bp左右，根據(jù)以上信息可返回圖庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，對(duì)比得知圖譜和東海原甲藻一致，即可初步判定其為東海原甲藻。為了驗(yàn)證公式，對(duì)東海原甲藻進(jìn)行了五次的重復(fù)酶切，并計(jì)算條帶大小，條帶大小結(jié)果。五次重復(fù)酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果后計(jì)算條帶分子量結(jié)果如下，可以看出，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差比較穩(wěn)定，可以用來(lái)進(jìn)行一個(gè)條帶分子量大小的估算。驗(yàn)證條帶大小公式的重復(fù)實(shí)驗(yàn)計(jì)算結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求一種赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟a、實(shí)驗(yàn)藻種f/2及其衍生培養(yǎng)基的配制b、引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證c、實(shí)驗(yàn)藻種18SrDNA片段的獲得d、PCR優(yōu)化及擴(kuò)增e、模擬酶切和實(shí)際酶切對(duì)照實(shí)驗(yàn)f、RFLP區(qū)分鑒別赤潮藻種。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟a為f/2微量元素溶液向950mL重蒸水中加入成分FeC13·6H20,Na2EDTA·2H20，CuS04·5H20,Na2Mo04·2H20,ZnS04·7H20,CoC12·6H20,MnCl2·4H20,定容至1L，高溫滅菌；f/2維生素溶液向950mL蒸餾水中加入200mgvit.Bl，加入Imlvit.H和vit.B12的儲(chǔ)存液，定容至1L，過(guò)濾滅菌，置于4°C；f/2培養(yǎng)基向950mL蒸餾水中加入成分NaN03，NaH2P04'H20,Na2Si03·9Η20，，并定溶至1L，高溫滅菌，儲(chǔ)存于4°C備用；f/2-Si培養(yǎng)基孔徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾新鮮海水1L，高溫滅菌，配方同f/2培養(yǎng)基，不加Na2Si03·9H20；f/50培養(yǎng)基孔徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾新鮮海水1L，高溫滅菌，冷卻至室溫后中添加40μ1營(yíng)養(yǎng)元素，40μ1微量元素溶液，20μ1維生素溶液，補(bǔ)充過(guò)濾新鮮海水至1L。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟b為(1)實(shí)驗(yàn)藻種目標(biāo)序列(18SrDNA)信息的獲得和比對(duì)基于NCBI中的GenBankDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)的相關(guān)信息，獲取實(shí)驗(yàn)藻種的18SrDNA序列的相關(guān)信息，并運(yùn)用DNAstar軟件對(duì)序列信息進(jìn)行對(duì)比，以搜尋合適的設(shè)計(jì)引物的區(qū)域；(2)實(shí)驗(yàn)藻種目標(biāo)序列(18SrDNA)對(duì)比和引物的設(shè)計(jì)根據(jù)DNAstar軟件序列對(duì)比的結(jié)果，通過(guò)PrimerPremier-v軟件對(duì)引物相關(guān)條件的設(shè)置，設(shè)計(jì)出最優(yōu)引物。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟c為(1)實(shí)驗(yàn)藻種基因組DNA的提取與純化(2)PCR反應(yīng)(3)PCR的優(yōu)化選取18SrDNA序列，設(shè)計(jì)出引物1、引物2、引物3，其序列為引物1:18S(R):AACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S(F)TGATCCTTCTGGAGGTTCACCTAC引物2:18SrDNA(R)TGTCTCAAAGATTAAGCCATG18SrDNA(F):ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA引物3:18SrDNA(l):ACCTGGTTGATCCTGCCAGT18SrDNA(2):TCACCTACGGAAACCTTGT。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟d為(I)PCR反應(yīng)中Mg2+的濃度的優(yōu)化(2)PCR反應(yīng)中模板起始濃度的優(yōu)化(3)PCR反應(yīng)中引物起始濃度的優(yōu)化然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟e為將實(shí)驗(yàn)藻種序列信息錄入excel軟件，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)用到的限制性內(nèi)切酶的酶切信息，通過(guò)excel軟件，作出酶切片段數(shù)和長(zhǎng)度的信息，建立初級(jí)酶切信息數(shù)據(jù)表；根據(jù)模擬數(shù)據(jù)表建立的信息，進(jìn)行篩選，從中挑選出限制性內(nèi)切酶，運(yùn)用VectorNTISuite9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對(duì)實(shí)驗(yàn)藻種序列進(jìn)行模擬的酶切，并跑出模擬電泳圖，根據(jù)此初步判斷其區(qū)分鑒別程度；選取部分實(shí)驗(yàn)藻種進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)，并與的模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際試驗(yàn)的吻合程度，其中，反應(yīng)體系為總體積30μ1，其中18SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物15μ1，酶切反應(yīng)緩沖液5μ1，內(nèi)切酶3μ1，滅菌重蒸水7μ1；反應(yīng)時(shí)間為65°C條件下90min，其酶切產(chǎn)物也用凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖凝膠濃度為1%，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟e進(jìn)一步包括如下步驟選取實(shí)驗(yàn)藻種對(duì)選擇的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作出酶切電泳圖，作出單個(gè)的藻種酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分，并對(duì)相關(guān)酶切實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)照模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建赤潮藻種的RFLP圖庫(kù)，并在此基礎(chǔ)上建立標(biāo)準(zhǔn)化的基于RELP技術(shù)的赤潮藻種分類鑒定方法，對(duì)試驗(yàn)藻進(jìn)行了五次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算條帶大小；收集實(shí)驗(yàn)藻種18SrDNA序列信息，并綜合主要限制性內(nèi)切酶的信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)和VectorNTISuite9軟件，選取用酶，作出模擬電泳圖，優(yōu)選為TaqI酶作為實(shí)驗(yàn)用酶；計(jì)算模擬實(shí)驗(yàn)和實(shí)際實(shí)驗(yàn)的對(duì)比結(jié)果，計(jì)算實(shí)際實(shí)驗(yàn)的條帶數(shù)和條帶大小的位置是否與擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟e進(jìn)一步包括如下步驟(1)酶切樣品量的優(yōu)化取三個(gè)酶切對(duì)象的量進(jìn)行優(yōu)化，分別是5μ1、10μ1、15μ1，然后進(jìn)行電泳分析；(2)酶切時(shí)間的優(yōu)化取5個(gè)時(shí)間段對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是90min、120min、150min、180min、210min然后進(jìn)行電泳分析；(3)酶切用酶量的優(yōu)化取三個(gè)酶的用量對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，分別是2μ1、3μ1、4μ1；然后進(jìn)行電泳分析；對(duì)各驗(yàn)藻種進(jìn)行了RFLP酶切實(shí)驗(yàn)，在酶切之后固定凝膠濃度以及電泳的電壓、電泳時(shí)間因素，并作出其酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分藻種。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，所述步驟f為對(duì)未知藻種進(jìn)行培養(yǎng)，提取DNA，對(duì)藻種進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段后對(duì)目的片段進(jìn)行酶切，酶切后進(jìn)行電泳，得到電泳圖譜后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，對(duì)電泳圖譜的分析，應(yīng)根據(jù)電泳圖譜中酶切樣品的片段數(shù)以及片段和marker的相對(duì)位置來(lái)確定，其中，條帶片段大小估算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>為條帶分子量W目標(biāo)條帶所處的兩條marker之間的比例位置C為條帶所處的兩條marker片段差值D兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)。10.一種如權(quán)利要求1-9任一所述赤潮藻種快速鑒定的方法在檢測(cè)浮游生物群落結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種赤潮藻種快速鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟a、實(shí)驗(yàn)藻種f/2及其衍生培養(yǎng)基的配制，b、引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證，c、實(shí)驗(yàn)藻種18SrDNA片段的獲得，d、PCR優(yōu)化及擴(kuò)增，e、模擬酶切和實(shí)際酶切對(duì)照實(shí)驗(yàn)，f、RFLP區(qū)分鑒別赤潮藻種。本發(fā)明作為一種用于鑒定的赤潮藻種的分子生態(tài)學(xué)手段，可以作為傳統(tǒng)鑒定方法的補(bǔ)充和輔助手段。本發(fā)明，基于FELP建立特征性圖譜，將整個(gè)流程標(biāo)準(zhǔn)化，將有利于對(duì)赤潮藻種進(jìn)行快速簡(jiǎn)捷的初步鑒定，有利于浮游植物赤潮的爆發(fā)預(yù)警。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101824481SQ20101018480公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年5月28日優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日發(fā)明者于志剛,張濤,甄毓,米鐵柱申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)