專利名稱：一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物生物技術(shù)的最新發(fā)展不僅實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)農(nóng)藝性狀的改良(如提高作物產(chǎn)量， 增強(qiáng)抗病、抗蟲、抗除草劑特性，改良品質(zhì)等)，而且使植物成為生物醫(yī)藥和工業(yè)產(chǎn)品的生物反應(yīng)器(Daniell et al. , Trends Plant Sci 2001,6 :219-226 ；Giddings et al.， NatureBiotech 2000,18 :1151-1156 ；Hood and Jilka, Curr Opin Biotechnol 1999,10 382-386 ；Hood and ffoodard, Plants as Factories for Protein Production 2002, pp. 119-135. Netherlands =Kluwer Academic)。對于絕大多數(shù)禾本科作物，由于其產(chǎn)量高、 生產(chǎn)成本低、耐儲(chǔ)藏且生產(chǎn)規(guī)模容易控制等特點(diǎn)，決定了其為第二代轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的理想載體。近年來利用水稻種子生產(chǎn)具有保健作用的外源蛋白和可食性疫苗研究發(fā)展很快，且已經(jīng)取得了巨大成功。如維生素A、具有降低血糖作用的大豆球蛋白(Glycinin)、具有預(yù)防和治療缺鐵性貧血和提高自身免疫功能的大豆鐵蛋白Ferritin)、具有刺激胰島素分泌預(yù)防糖尿病發(fā)生功能的GLP、乙肝疫苗和花粉過敏癥疫苗等均成功地在水稻中表達(dá)并高水平累積(Goto et al.，Nature Biotech. 1999,17 :282-286 ；Katsube et al.，Plant Physiol. 1999,120 :1063-1073 ；Qu et al.，Planta 2005,222 :225-233 ；Takagi et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. 2005,102 :17525-17530 ；Ye et al.，Science 2000，287 :303-305 ； Zheng et al.，PlantPhysiol. 1995，109 :777-786)。然而缺少相應(yīng)的啟動(dòng)子成為目前生物技術(shù)應(yīng)用(外源基因的理想表達(dá)部位，表達(dá)方式，表達(dá)時(shí)期和表達(dá)水平等)的限制因子。植物基因工程的根本目標(biāo)是培育能使目的基因穩(wěn)定而且高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。 基因表達(dá)受控于轉(zhuǎn)錄起始處的核苷酸序列即啟動(dòng)子成分，它主要包括RNA聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的信號(hào)，以指導(dǎo)合成相應(yīng)的信使RNA分子，進(jìn)一步指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。啟動(dòng)子控制基因轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)還決定了基因的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)方式。目前廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子(包括CaMV35S、ubiquitinl、ACtinl)盡管其表達(dá)效率高， 然而由于其表達(dá)不受時(shí)空限制，它在幾乎所有組織中都能使外源基因表達(dá)，在進(jìn)行種子中外源基因過量表達(dá)過程中，會(huì)驅(qū)動(dòng)基因在種子外的其它組織中表達(dá)，既消耗生物能源，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致一些可能對生物生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響的代謝產(chǎn)物的合成。且上述啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度尚無法滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化的需要。若選擇胚特異性高強(qiáng)度表達(dá)啟動(dòng)子，有助于定時(shí)定向調(diào)控外源有用蛋白的合成，既節(jié)約能源，保證了植物正常生理活動(dòng)不受干擾，同時(shí)又能提高外源有用蛋白在種子中的儲(chǔ)藏水平。植物種子的發(fā)育包括兩個(gè)重要的過程胚胎發(fā)生和種子成熟。隨著胚的逐步成熟， 大量貯藏產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物開始合成和積累，種子逐步成熟。胚胎發(fā)育的形態(tài)發(fā)生階段決定了植物個(gè)體的發(fā)育程序與整體結(jié)構(gòu)模式。目前對于種子的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)研究已取得了一定的進(jìn)展，但由于克隆種子胚特異性基因在技術(shù)上存在困難，例如，種子儲(chǔ)藏蛋白基因的高水平表達(dá)很容易掩蓋一些低豐度基因的信息(Goldberg et al. ,cell1989,56:149-160)；缺少胚胎發(fā)育過程中的一些特殊分子或細(xì)胞標(biāo)記等原因，目前在分子生物學(xué)水平上對種子胚胎發(fā)育的了解還很少。因而，分離、獲得種子胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子，既有助于更細(xì)致地理解植物胚胎發(fā)育中形態(tài)發(fā)生與細(xì)胞分化的分子機(jī)理，又能廣泛應(yīng)用于植物基因工程研究中，使外源目的基因能在特定的組織中高效表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)對外源基因表達(dá)的定時(shí)、定點(diǎn)定量三維精確調(diào)控，在改良作物品質(zhì)的同時(shí)又可減少對植物的不利影響。脂類是植物種子儲(chǔ)藏能量最有效的形式，幾乎所有植物中的脂類物質(zhì)主要以三酰甘油酯(triacylglycerols，AG)的形式貯藏。與白色脂肪組織中的TAG不同，植物種子的TAG分子之間不是彼此聚合的，而是分散成許多小的相對穩(wěn)定的亞細(xì)胞微滴，這些小的亞細(xì)胞微滴稱為油體。油體外圍由單層磷酸脂膜和油體蛋白(oleosin)所組成的半單位膜所覆蓋。根據(jù)油體蛋白的兩性N末端和C末端在長度及序列上的不同，可將其分為低分子量(L)和高分子量(H)兩類(Hsieh K, Huang AHC. Plant Physiol. 2004,136 3427-34)。水稻種子胚中含有的18KDa和16KDa油體蛋白分別屬于H型和L型(Tzen et al.,Plant Physiol. 1998,94 :1282-1289 ；Wu et al. ,J. Biochem. 1998,123(3) :386-391)。 Junko 等(Transgenic Res. 2006,15 :95-100)利用水稻胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子 01el8 (Qu and Takaiwa, Plant Biotech. J. ,2004,2 :113-125)驅(qū)動(dòng)亞油酸異構(gòu)酶基因在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)，不但提高了水稻種子中的亞油酸含量，并且增強(qiáng)了稻米的防癌和抗動(dòng)脈硬化功能，體現(xiàn)了水稻胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子極大的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子，來源于水稻16 kDa oleosin基因的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子功能的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0. IX SSPE (或0. IX SSC)，0. SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。其中，序列表中序列1是由1438個(gè)脫氧核苷酸組成。上述自序列表中序列1的5'端第1295 1300位核苷酸為植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子TATA盒核心區(qū)。將啟動(dòng)子除TATA盒核心區(qū)外的其他序列通過堿基突變或缺失等發(fā)生變化，一般不會(huì)使啟動(dòng)子活性完全喪失，因此也可根據(jù)需要將啟動(dòng)子的調(diào)控元件改變。含有上述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在所述表達(dá)盒中，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子的下游連接結(jié)構(gòu)基因，或調(diào)節(jié)基因，或結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因，或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA，用于驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)基因，或調(diào)節(jié)基因，或結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因，或者天然小RNA或人工合成的小 RNA的表達(dá)。
所述重組表達(dá)載體是上述表達(dá)盒與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體所構(gòu)建的重組載體所述重組表達(dá)載體為重組植物表達(dá)載體，所述重組植物表達(dá)載體含有上述表達(dá)盒并且能夠?qū)⑺龅谋磉_(dá)盒轉(zhuǎn)送進(jìn)入植物宿主細(xì)胞、組織或器官及其后代并且能夠或者至少方便所述的表達(dá)盒整合到宿主的基因組中，它包括但不限于雙元載體、共合載體。上述重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織或器官，得到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無性系或其后代。上述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子可用于培育胚特異性表達(dá)外源基因的植物。利用該植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子培育胚特異性表達(dá)外源基因的植物的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述培育胚特異性表達(dá)外源基因的植物的方法可為將所述外源基因連接于所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子下游，通過植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到在胚中特異性表達(dá)所述外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子下游還可連接有調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件。所述調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件，該調(diào)控元件包括能增強(qiáng)外源基因表達(dá)或調(diào)控基因在植物中表達(dá)部位的元件，如增強(qiáng)子、組成型表達(dá)、組織特異性表達(dá)、誘導(dǎo)型表達(dá)的調(diào)控元件。所述方法中，所述外源基因?yàn)榈鞍拙幋a基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因?yàn)檎xRNA基因和/或反義RNA基因。所述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物為水稻、小麥、玉米、大麥、高粱、燕麥等；所述雙子葉植物是大豆、 油菜、向日葵等。本發(fā)明的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子是通過設(shè)計(jì)引物，以水稻基因組DNA為模板， 利用PCR方法從水稻中分離得到的油體蛋白基因16 kDa oleosin啟動(dòng)子。通過其在水稻中的表達(dá)特異性實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的啟動(dòng)子使葡糖苷酸酶(GUS)報(bào)告基因只在水稻種子胚中特異性表達(dá)。說明本發(fā)明的啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外源基因在植物的胚中特異性的表達(dá)， 適用于任何種子具有胚的植物，即單子葉植物或雙子葉植物。利用本發(fā)明的啟動(dòng)子可提高外源基因在植物胚中的表達(dá)和累積水平，可改良種子品質(zhì)、將具有生理活性的蛋白或短肽導(dǎo)入種子中創(chuàng)制保健型功能新品種、利用種子作生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用外源蛋白或可食性疫苗，增加農(nóng)產(chǎn)品科技附加值等。本發(fā)明的啟動(dòng)子及其應(yīng)用為為揭示整個(gè)植物胚胎發(fā)育的過程和機(jī)理的研究，利用生物技術(shù)改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場等研究奠定了基礎(chǔ)，具有極大的應(yīng)用前景。


圖1為從水稻基因組DNA中PCR擴(kuò)增16 kDa oleosin啟動(dòng)子的電泳圖譜。圖2為16 kDa oleosin啟動(dòng)子融合GUS基因表達(dá)載體oleP-pGPTV-35S_HPT的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為oleP-pGPTV-35S_HPT載體雙酶切鑒定圖譜。圖4為轉(zhuǎn)oleP-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株嵌合引物PCR擴(kuò)增電泳圖譜。圖5為轉(zhuǎn)oleP-pGPTV-35S_HPT載體Ttl代水稻植株Southern雜交結(jié)果。
圖6為轉(zhuǎn)oleP-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株根、莖、葉鞘和葉片⑶S染色結(jié)果。圖7為轉(zhuǎn)oleP-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株在開花后7天，12天，17天種子的⑶S染色結(jié)果。圖8為轉(zhuǎn)oleP-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株種子中的⑶S熒光活性測定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子(16 kDa oleosin啟動(dòng)子)的獲得根據(jù)水稻16 kDa oleosin 基因 cDNA 序列(GenBank 號(hào)為 L76464)，從 GenBank 中查找16 kDa oleosin基因的上游序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增16 kDa oleosin啟動(dòng)子。為便于載體構(gòu)建，在每對引物上依次添加兩個(gè)酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。16kDa oleosin啟動(dòng)子的正向引物為 Fl ^y-ACCAAGCTT CGCTGATGTGGTATCATAG-3，(Hind III)和反向引物 Rl :5'ΑΑ6Τ CGACGGGGATCGAGCACACCTGCAG-3’ (Sal I)。CTAB法從水稻(野生型水稻臺(tái)中65號(hào)，該品種為1936年我國臺(tái)灣省育成；曲樂慶等，植物學(xué)報(bào)，2001,43 :1167-1171 ；中國科學(xué)院植物研究所保存)葉片中小量提取基因組DNA，以其為模板，以Fl和Rl為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增16 kDa oleosin啟動(dòng)子序列。 反應(yīng)體系為10μΜ正反向引物各1μ 1，2XGC Buffer 10μ1，基因組DNA 1 μ 1 (IOng)， LATaq(TAKARA)O. 5 unit，加超純水至20 μ 1 ；反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后94°C lmin，55°C lmin30sec, 72°C lmin30sec，30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C，lOmin。PCR 擴(kuò)增得到 1.5kb 的目的條帶，如圖1所示。圖1中第1泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，第2泳道為16 kDa oleosin啟動(dòng)子?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物，直接連接到pT7Blue載體(購自Novagen公司)上進(jìn)行測序。結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的16 kDa oleosin啟動(dòng)子序列大小為1438bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列。將測序檢測表明含有16 kDa oleosin啟動(dòng)子片段的重組載體命名為pT7-oleP。實(shí)施例2、植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子(16 kDa oleosin啟動(dòng)子)表達(dá)載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化l、16KDa oleosin啟動(dòng)子融合⑶S基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建pGPTV-35S-HPT 參照文獻(xiàn)(Qu and Takaiwa, Plant Biotech J 2004，2 :113-125) 所述的方法構(gòu)建，中國科學(xué)院植物研究所保存。用Hind III和Ml I雙酶切pT7-oleP質(zhì)粒和雙元表達(dá)載體PGPTV-35S-HPT。回收含有1438bp的16 kDa oleosin啟動(dòng)子的酶切片段，將該片段連接到PGPTV-35S-HPT的Hind III和Ml I酶識(shí)別位點(diǎn)之間。將得到的重組質(zhì)粒在PCR鑒定的基礎(chǔ)上利用Hind III和Ml I進(jìn)行雙酶切鑒定，得到1. 4kb的16 kDa oleosin啟動(dòng)子的片段。將酶切鑒定表明含有16 kDa oleosin啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒命名為 oelP-pGPTV-35S-HPT (其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示)。其中，oelP-pGPTV-35S_HPT的雙酶切鑒定圖譜，如圖3所示。圖3中泳道1為DNA分子量標(biāo)記，泳道2和3為oelP-pGPTV-35S-HPT Hind III和Ml I雙酶切獲得的片段。2、轉(zhuǎn) oleP-pGPTV-35S_HPT 水稻的獲得用凍融法將oelP-pGPTV-35S_HPT 導(dǎo)入農(nóng)桿菌 EHA105(Hood et al.，TransgenResl993, 2 =208-218 ；中國科學(xué)院植物研究所保存)中，然后轉(zhuǎn)化野生型水稻Kitaake。利用潮霉素篩選方法(按照文獻(xiàn)Hiei et al.，Plant J 1994，6 :271-282所述方法進(jìn)行)，獲得9株Ttl代轉(zhuǎn)oelP-pGPTV-35S-HPT水稻植株。利用PCR方法對上述篩選得到的轉(zhuǎn)oelP-pGPTV-35S-HPT水稻進(jìn)行PCR分子檢測， PCR引物為16 kDa oleosin啟動(dòng)子序列和⑶S基因序列的嵌合引物，S卩16 kDaoleosin啟動(dòng)子序列內(nèi)部正向引物Pl:5’ -gatgaacttgttccttcagttacacg-3，，和⑶S序列內(nèi)部的反向引物 p2 :5，-cgtgacatcggcttcaaatggcgta-3，。PCR 反應(yīng)體系為10 μ M 正反向引物各 1 μ 1， IOXEx Buffer 2 μ 1，基因組 DNA 1 μ 1, ExTaq(TAKARA)O. 5 unit，加超純水至 20 μ 1 ；反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min，然后 94°C lmin，55°C lmin30sec, 72°C lmin30sec，30 個(gè)循環(huán)，最后72°C，IOmin0 PCR擴(kuò)增得到0. Skb的目的條帶即為檢測陽性，結(jié)果表明得到9株P(guān)CR檢測陽性的轉(zhuǎn)oelP-pGPTV-35S-HPT水稻Ttl代植株(如圖4所示)。圖4中第1泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，第2泳道以質(zhì)粒為模板的陽性對照，第3泳道為以未轉(zhuǎn)化株系作為模板的陰性對照， 第4 11泳道分別為轉(zhuǎn)oelP-pGPTV-35S-HPT植物表達(dá)載體的Ttl代植株。T0代轉(zhuǎn)基因植株所結(jié)的種子和由該種子長成的植株為T1代，依此類推，T2、T3分別表示轉(zhuǎn)基因植株第2代和第3代。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因水稻植株的Southern雜交檢測用CTAB法提取PCR鑒定呈陽性的Ttl代水稻轉(zhuǎn)基因植株葉片的基因組DNA，約40 μ g DNA加入50單位EcoR I充分酶切后，經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用0. 4N的NaOH將 DNA轉(zhuǎn)移到帶正電核的尼龍膜(購自Amersham pharmacia公司)上。轉(zhuǎn)移后的膜在含有 7% (ff/V) SDS的0. 5M磷酸鈉緩沖液中65°C預(yù)雜交5小時(shí)，用〔α -32Ρ) dCTP隨機(jī)引物法進(jìn)行探針標(biāo)記(購自中國福瑞公司)。所使用的雜交探針是位于GUS內(nèi)部的441bp DNA片段(序列為自GENBANK號(hào)為S69414. 1的第1344-1784位核苷酸序列，以pGPTV_35S_HPT 質(zhì)粒為模版，5，-CTGCGACGCTCACACCGATACC-3’ 和 5’ -TCACCGAAGTTCATGCCAGTCCAG-3，為引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)為探針。65°C雜交20小時(shí)后，在含有0. 1%SDS的2XSSC中于65°C 洗膜兩次，每次15分鐘，再在0. SDS的IXSSC中于65°C洗膜一次，15分鐘。壓X光片M 48小時(shí)后，放射性自顯影。Southern雜交結(jié)果顯示，各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中都能檢測出雜交條帶，并且在不同的株系中，雜交條帶的數(shù)目和出現(xiàn)的位置不完全相同(如圖5所示)，這表明oelP-pGPTV-35S-HPT表達(dá)結(jié)構(gòu)已經(jīng)成功整合到水稻基因組中，并且各個(gè)轉(zhuǎn)基因株系間是相互獨(dú)立的轉(zhuǎn)化個(gè)體。圖5中，第1泳道為非轉(zhuǎn)基因植株對照，2 10泳道為轉(zhuǎn) oelP-pGPTV-35S-HPT 植株。實(shí)施例4、植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子(16 kDa oleosin啟動(dòng)子)的功能驗(yàn)證對轉(zhuǎn)oleP-pGPTV-35S-HPT水稻Ttl代植株進(jìn)行組織化學(xué)染色。具體步驟將轉(zhuǎn) oleP-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株及對照野生型水稻(Kitaake)植株的部分葉片、 根、莖桿組織切成小塊；將開花后7天、12天、17天的灌漿期種子，用解剖刀從中部縱切開。 將處理好的樣品浸泡于GUS反應(yīng)液(0. IM NaPO4緩沖液，pH 7. 0，IOmMEDTA, pH7. 0，5mM鐵氰化鉀，5mM亞鐵氰化鉀，l.OmM X-Gluc, 0. 1% Triton X-100)，37°C反應(yīng)。染色后的組織在 70%乙醇中保存、觀察，并在解剖顯微鏡下照相。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)oelP-pGPTV-35S-HPT載體水稻植株的根、葉片、葉鞘、莖桿均未觀察到⑶S表達(dá)(如圖6所示)；開花后7天的種子糊粉層、亞糊粉層變藍(lán)，胚乳和胚未被染成藍(lán)色；開花后12天的種子與開花后7天的種子相比，糊粉層、亞糊粉層藍(lán)色更明顯、胚變藍(lán)，胚乳未被染成藍(lán)色；開花后17天的種子糊粉層、亞糊粉層和整個(gè)胚的藍(lán)色清晰可見，與開花后12天的種子相比，胚的藍(lán)色更深；而對照野生型水稻(Kitaake)根、葉片、葉鞘、莖桿、以及開花后7天、12天、17天的灌漿期種子都未觀察到⑶S表達(dá)(如圖7所示)。結(jié)果表明16 kDa oleosin啟動(dòng)子使β -葡糖苷酸酶(⑶S) 報(bào)告基因只在水稻種子的胚和糊粉層中特異性表達(dá)。圖6中，1、2、3分別為轉(zhuǎn)基因植株根、 莖、葉鞘及葉片的染色結(jié)果。圖7中，ck為對照野生型水稻(Kitaake)開花后17天的灌漿期種子染色結(jié)果；7d、12d、17d分別表示轉(zhuǎn)oelP-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株開花后 7天、12天、17天灌漿期種子的GUS染色結(jié)果。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因水稻的組織⑶S熒光活性測定對轉(zhuǎn)oleP-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株開花后17天的灌漿期種子進(jìn)行⑶S 定量分析，方法按照J(rèn)efferson等的熒光檢測方法(Jefferson，Plant Mol. Biol. Report, 1987,5 :387-405)進(jìn)行。具體為取1粒種子，置于1. 5ml印pendorf管中，用玻璃棒將種子碾碎，加入 30 μ 1 抽提液(50mM NaPO4 (ρΗ7· 0)，IOmM β -Mercaptoethanol, IOmMNa2EDTA (ρΗ 8.0),0.1% SDS,0. 1% Triton X-100)，搖勻。4°C 15，OOOrpm 離心 lOmin，取 10 μ 1 上清于新管中，加入90 μ 1保溫至37°C的反應(yīng)液(ImM MUG)，37°C反應(yīng)60分鐘，加入900 μ 1終止液 (0. 2Μ Na2CO3)，室溫終止反應(yīng)。用F-4500 (日立)型熒光分光光度計(jì)在360nm激發(fā)波長和 460nm吸收波長下檢測相對4MU含量。以牛血清蛋白為對照，利用BIO-Rad Protein Assay Kit測定蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明，16 KDa oleosin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S在轉(zhuǎn)基因水稻種子中表達(dá)的活性為7. 7士3. 5pmol 4MU/min/ μ g蛋白(如圖8所示)。圖8中，1_8分別為不同轉(zhuǎn)oleP-pGPTV-35S-HPT載體Ttl代水稻植株種子中⑶S表達(dá)活性1為6. 4pmol 4MU/min/ μ g 蛋白，2 為 11. 8pmol 4MU/min/μ g 蛋白，3 為 11. 7pmol 4MU/min/μ g 蛋白，4 為 4. 2pmol 4MU/min/ μ g 蛋白，5 為 1. 7pmol4MU/min/ μ g 蛋白，6 為 7. 3pmol 4MU/min/ μ g 蛋白，7 為 8. 8pmol 4MU/min/ μ g 蛋白，8 為 9. 6pmol 4MU/min/ μ g 蛋白。
權(quán)利要求
1.一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子，其序列是下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有70%以上同源性，且具有植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子功能的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子的表達(dá)盒。
3.含有權(quán)利要求1所述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌。
4.權(quán)利要求1所述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因是在胚中特異性表達(dá)的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述培育轉(zhuǎn)基因植物，是將所述外源基因連接于所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子下游，通過植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選得到在胚中特異性表達(dá)所述外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子下游還連接有調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控元件。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述外源基因?yàn)榈鞍拙幋a基因和/或非蛋白編碼基因；所述蛋白編碼基因優(yōu)選為品質(zhì)改良基因；所述非蛋白編碼基因?yàn)檎xRNA 基因和/或反義RNA基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述單子葉植物為水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥；所述雙子葉植物是大豆、油菜或向日葵。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子，1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子功能的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外源基因在植物的胚中特異性的表達(dá)，適用于任何種子植物。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102250894SQ20101018425
公開日2011年11月23日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者代玲玲, 曲樂慶 申請人:中國科學(xué)院植物研究所