專利名稱：：漢族兒童哮喘易感基因檢測模型及其試劑盒的制作方法漢族兒童哮喘易感基因檢測模型及其試劑盒
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種檢測模型，具體地說，是關于一種漢族兒童哮喘易感基因檢測模型及其試劑盒。
背景技術：
：支氣管哮喘是當今世界上最常見的慢性氣道炎癥性疾病之一，也是兒童呼吸系統(tǒng)常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，給兒童健康和社會造成嚴重危害。近年來隨著分子生物學和遺傳學的不斷發(fā)展，對哮喘基因的研究日漸深入，目前公認哮喘具有明顯家族聚集傾向，是一種復雜的多因子、多基因遺傳病。尋找人類基因組上哮喘發(fā)病的易感基因是后基因組時代疾病易感性研究的一大熱點。2006年是人類完成哮喘和變應性疾病基因易感位點篩選計劃的第10年，也是全世界范圍內解開這些具有復雜表型疾病遺傳基礎的第10個年頭。2006年初，Ober等經過瀏覽大量文獻，得出如下結論迄今為止，共有492篇文獻報道了118個基因與哮喘或變應性疾病表型相關，其中54個基因在25個獨立樣本中得以重復，15個基因(GSTM1、IL10、CTLA4、SPINK5、LTC4S、LTA、GRPA、NOD1、CC16、GSTP1、STAT6、NOS1、CCL5、TBXA2R、TGFB1)在610個樣本中得以重復，10個基因(IL4(白介素4)、IL13(白介素13)、CD14、ADRB2(腎上腺素能β2受體)、HLA-DRBl、HLA-DQBl、TNF、FcERl(IgE高親和力受體)、IL4RA(白介素4受體α)、ADAM33)在>10個樣本中得到重復，因而認為在6個或更多的獨立樣本中得以重復的25個基因與哮喘或變應性疾病表型相關，是真正的哮喘或變應性疾病的易感基因。隨著人類基因組遺傳圖譜繪制的日益完善，第三代多態(tài)性標志即單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP，單核苷酸多態(tài)性)的意義已超出遺傳作圖范疇，成為研究基因組多樣性、識別和定位疾病相關基因的一種新手段，已受到分子生物學工作者的普遍關注和研究。例如，Munthe-KaasMC等人于2008年首次證實TBX21基因SNP與過敏性哮喘密切相關；臺灣有研究表明Eotaxin1基因Thr23Thr純合子具有哮喘保護效應，能顯著降低血漿嗜酸細胞活化趨化因子濃度，等等。這些研究多集中于發(fā)現(xiàn)和驗證單個SNP位點在病例與正常人群間的分布差異。既然哮喘是一種多基因遺傳疾病，發(fā)病機制涉及多條生化通路，那么這些SNP位點之間必然相互關聯(lián)。2007年文獻報道韓國學者通過對本國兒童的7個哮喘候選基因的12個SNP位點進行基因-基因交互作用研究，發(fā)現(xiàn)KDR和TNF基因的兩個SNP位點對哮喘發(fā)生具有協(xié)同作用。到目前為止各國關于哮喘不同SNP位點之間相互關聯(lián)性的研究均很少見。我們認為尋找出這些關聯(lián)的SNP對認識哮喘的發(fā)病機制和從遺傳學角度檢測哮喘的易感體質具有重要的科學意義。然而，傳統(tǒng)的統(tǒng)計學方法最多只能同時對兩個SNP位點進行聯(lián)合研究，若能找到一種可同時對多個位點進行高階交互作用分析的新型統(tǒng)計學方法，則可能獲得較為理想的哮喘易感基因檢測模型。目前有一種研究多個SNP位點相互關聯(lián)關系的主流統(tǒng)計學方法-多因子降維法(multifactordimensionalityreduction，MDR)。這一統(tǒng)計學方法由Ritchie等于2001年提出，“因子”是交互作用研究中的變量(基因型)，“維”是指研究的多因子組合中因子的數(shù)目，以疾病易感性分類(易感型、非易感型)的方式建模，將研究中的多個因子看作一個多因子組合(基因型組合)，這樣就可以把高維的數(shù)據結構降低到一維兩水平(即易感型和非易感型)，此過程即為“降維”。這是一種非參數(shù)、無需遺傳模式的統(tǒng)計學分析方法，適用于病例對照研究，只需具備各位點的遺傳數(shù)據(SNP基因型)，即可進行基因-基因交互作用的分析，而無需其它特殊條件。與傳統(tǒng)統(tǒng)計學建模方法相比較，“多因子降維法”的優(yōu)點是可以大大降低建模所需的自由度，其主要特點是①并不需要指定遺傳模式(顯性或隱性遺傳)和交互作用模型(線性或非線性模型，加法或乘法模型)；②結合MDR軟件包，可以識別多個SNP位點之間的高階交互作用。由于存在種族差異性，為了解中國漢族兒童哮喘發(fā)病的遺傳基礎，初步建立哮喘易感基因檢測模型，本實驗基于上述理論背景，選取了在>10個樣本中得以重復的5個哮喘易感基因的10個SNP位點(分別為IL13基因C-1112T、C1923T和A2044G位點，IL4基因C-590T位點，IL4RA基因I75V和Q551R位點，ADRB2基因R16G和Q27E位點以及FcERl基因C-109T和E237G位點)和在610個樣本中得以重復的3個哮喘易感基因的5個SNP位點(分別為TGFB1(轉化生長因子01)基因C-509T、R25P位點，N0S1(一氧化氮合酶1)基因C5266T位點以及RANTES,即CCL5(趨化因子配體5)基因A-403G和G-28C位點)在漢族人群中進行病例對照研究。哮喘病例組和正常對照組各192例；采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)方法對各樣本進行上述候選位點基因分型；整合所有實驗數(shù)據，進行傳統(tǒng)統(tǒng)計學分析和MDR研究，初步建立漢族兒童哮喘易感基因檢測模型。該模型的建立有助于判別哮喘高危兒童，及早進行干預，防患于未然。這在國內尚屬首次，具有創(chuàng)新性。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種漢族兒童哮喘易感基因檢測模型。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種漢族兒童哮喘易感基因檢測模型，所述的檢測模型由FcERlE237G、FcERlC_109T、ADRB2R16G、IL4RAQ551R、IL4RAI75V、IL4C-590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13C-1112T九個SNP位點組成。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是一種漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒，所述的試劑盒由九個小試劑盒組成，所述的九個小試劑盒分別是檢測FcERlE237G、FcERlC_109T、ADRB2R16G、IL4RAQ551R、IL4RAI75V、IL4C-590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13C-1112T的SNP位點小試劑盒，每小試劑盒內裝DNA抽提、PCR擴增、限制性內切酶酶切以及瓊脂糖凝膠電泳步驟的相關試齊II。一種漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒，所述的試劑盒由兩個小試劑盒組成，所述的兩個小試劑盒分別是檢測ADRB2R16G和FcERlC_109T的SNP位點小試劑盒，每小試劑盒內裝DNA抽提、PCR擴增、限制性內切酶酶切以及瓊脂糖凝膠電泳步驟的相關試劑。一種漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒，所述的試劑盒由兩個小試劑盒組成，所述的兩個小試劑盒分別是檢測ADRB2R16G和FcERlE237G的SNP位點小試劑盒，每小試劑盒內裝DNA抽提、PCR擴增、限制性內切酶酶切以及瓊脂糖凝膠電泳步驟的相關試劑。本發(fā)明優(yōu)點在于1、漢族兒童哮喘易感基因檢測模型的建立在國內尚屬首次，具有創(chuàng)新性；與國外類似研究相比較，具有種族特異性。2、本發(fā)明中檢測九個SNP位點的漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒，其具有良好的哮喘檢測效能(OR=345.3478，P值<0.0001，準確度92.97%，靈敏度97.92%，特異度88.02%)。3、本發(fā)明中檢測兩個SNP位點的漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒，比檢測單一SNP位點(R16GAA或E237GG)和檢測其他兩個SNP位點(IL13A2044G和ADRB2R16G)漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒檢測效能好。圖1各SNP(IL13C-1112T，IL13C1923T，IL13A2044G，IL4C-590T)位點的PCR產物(注數(shù)字標記為Marker電泳后的相應片段大小，其余各孔電泳條帶為部分個體的PCR產物片段。)圖2各SNP(ADRB2R16GFcERlC_109T，TGFB1C-509T,FcERlE237G,ADRB2Q27E,TGFB1R25P)位點的PCR產物(注數(shù)字標記為Marker電泳后的相應片段大小，其余各孔電泳條帶為部分個體的PCR產物片段。)圖3各SNP(IL4RAI75V,N0S1C5266T,IL4RAQ551R,RANTESA-403G,RANTESG-28C)位點的PCR產物(注數(shù)字標記為Marker電泳后的相應片段大小，其余各孔電泳條帶為部分個體的PCR產物片段。)圖4:各SNP(IL13C-1112T,IL13C1923T,IL13A2044G,IL4C-590T,IL4RAI75V)位點的酶切產物(注數(shù)字標記為Marker電泳后的相應片段大小，其余各孔電泳條帶為部分個體的酶切產物片段。)圖5各SNP(IL4RAQ551R,ADRB2R16G，ADRB2Q27E，F(xiàn)cERlC_109T，F(xiàn)cERlE237G)位點的酶切產物(注數(shù)字標記為Marker電泳后的相應片段大小，其余各孔電泳條帶為部分個體的酶切產物片段。)圖6各SNP(TGFB1C-590T，TGFB1R25P,N0S1C5266T,RANTESA-403G,RANTESG-28C)位點的酶切產物(注數(shù)字標記為Marker電泳后的相應片段大小，其余各孔電泳條帶為部分個體的酶切產物片段。)具體實施方式下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。實施例11材料與方法1.1材料1.1.1研究對象(1)哮喘病例組2007年至2008年期間來自新華醫(yī)院哮喘專科門診的192例哮喘患兒，男女各半，年齡為312歲。均符合2006年全球哮喘創(chuàng)議(GlobalInitiativeforAsthma,GINA)委員會修訂的兒童哮喘診斷標準頻繁的喘息發(fā)作(或可追溯與某種變應原或刺激因素有關)；發(fā)作時雙肺聞及呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長；支氣管舒張劑有明顯療效，存在可逆性氣流受限；除外其他引起喘息、胸悶和咳嗽的疾病。由于RSV感染患兒常有喘息發(fā)生，故將入組年齡下限定為3歲。75%具有IgE資料的入組患兒，其總IgE水平均在400IU/ml以上。(2)正常對照組同期來自上海師范大學和華東理工大學的192名健康學生，男女各半，年齡為1822歲。入選標準本人及三代以內直系親屬中無哮喘史、無肺部其它疾病史、無變態(tài)反應史。之所以選擇1822歲這一年齡組作為對照，是為了有足夠長時間除外哮喘等疾病診斷，說明至少在此年齡前無哮喘等過敏疾病史。以上兩組均為漢族人群，相互間無親緣關系。1.1.2主要試劑1.1.2.1口腔拭子基因組DNA提取試劑口腔拭子基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，內含緩沖液GA、緩沖液GB、緩沖液GD、緩沖液PW、洗脫緩沖液TB、蛋白酶K，4°C保存。12.1.2.2PCR反應試劑(l)TaKaRaExTaqHotStartVersion購自寶生物工程(大連)有限公司，內含TaKaRaExTaqHS(5U/u1),10XExTaq緩沖液(含Mg2+)、dNTP混合液(dATP、dTTP、dGTP和dCTP各2.5mM)，_20°C保存。(2)金牌Taq酶購自美國應用生物系統(tǒng)公司，內含金牌Taq酶，10X金牌Taq酶HS緩沖液，Mg2+(5(kimol/l)。(3)Q-solution購自吉泰生物科技有限公司，_20°C保存。1.1.2.3瓊脂糖凝膠電泳試劑(1)10XTBE緩沖液1L緩沖液中含Tris堿108克、硼酸55克、0.5XMDTA40ml(PH8.0)，室溫保存。(2)電泳上樣緩沖液6XLoadingBuffer和10XLoadingBuffer均購自寶生物工程(大連)有限公司，室溫保存。(3)10mg/ml溴化乙錠終濃度為0.5ug/ml，室溫保存。(4)Marker購自天根生化科技(北京)有限公司，4°C保存。1.1.2.4限制性內切酶(l)BstUI和NEBuffer2緩沖液購自NewEnglandBioLabsInc.。(2)BsaAI和NEBuffer3緩沖液購自NewEnglandBioLabsInc.。(3)AluI和NEBuffer4緩沖液購自NewEnglandBioLabsInc.。(4)BsmFI和NEBuffer4+BSA緩沖液體系購自NewEnglandBioLabsInc.。(5)BfuI和NEBuffer4緩沖液購自NewEnglandBioLabsInc.。(6)AlwnI禾口NEBuffer4緩沖液購自NewEnglandBioLabsInc.。(7)NcoI和10XBufferTango緩沖液購自MBIFermentas公司。(8)BseXI和10XBufferBseXI緩沖液購自MBIFermentas公司。(9)Tru9I和NEBuffer4+BSA緩沖液體系購自NewEnglandBioLabsInc.。(10)XmnI和NEBuffer2+BSA緩沖液體系購自NewEnglandBioLabsInc.。CN101831501A說明書5/25頁(ll)Eco81I和10XBufferTango緩沖液購自MBIFermentas公司。(12)Sau96I和NEBuffer4緩沖液購自NewEnglandBioLabsInc.。(13)RsaI和NEBuffer1緩沖液購自NewEnglandBioLabsInc.。(14)MnlI^P10XBufferG+10XBufferTango緩沖液體系購自MBIFermentas公司。1.1.3主要儀器(1)TP600型梯度PCR儀(日本TaKaRa公司)(2)4-15型大容量離心機(德國SIGMA公司)(3)TGL-16G型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)(4)FR-980型生物電泳圖像分析系統(tǒng)(上海復日科技有限公司)(5)UV-254型暗箱式紫外透射儀(北京鼎國生物技術有限責任公司)(6)PowerBC3002SI型數(shù)控電泳儀(上海申能博彩生物科技有限公司)(7)DYCP-32A型瓊脂糖水平電泳槽(北京市六一儀器廠)(8)HE-90水平槽制膠器(上海天能科技有限公司)(9)DK-8D型電熱恒溫水槽(上海精宏試驗設備有限公司)(10)P7021TP-6型格蘭仕微波爐(佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司)(ll)JTlOOOl型電子天平(上海精天電子儀器有限公司)(12)QL-901型渦旋器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)(13)手動可調式移液器(大龍醫(yī)療設備有限公司)1.2方法1.2.1標本采集根據知情同意原則，采集口腔頰粘膜拭子。具體方法如下(1)入組兒童于采集前禁食半小時。(2)使用棉簽刮拭面頰內側粘膜10次，期間轉動棉簽以獲取最大細胞收集量。(3)剪下棉簽頭，放入2ml滅菌離心管中，蓋上管蓋，_20°C保存。1.2.2口腔拭子基因組DNA提取(1)在內置棉簽頭的2ml離心管中加入600u1緩沖液GA。(2)加入30iU蛋白酶K(20mg/ml)溶液，蓋上管蓋，渦旋60秒混勻，56°C放置60分鐘，期間每10分鐘渦旋混勻一次。(3)加入600u1緩沖液GB，渦旋30秒混勻，70°C放置10分鐘，此時溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的液滴。(4)加入300u1無水乙醇，渦旋30秒混勻，簡短離心以去除管蓋內壁的液滴。(5)將700yl上一步所得溶液加入一個吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)，12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。(6)將剩余的第(4)步所得溶液全部轉移入吸附柱CR中，重復步驟(5)。(7)向吸附柱CR中加入500ill緩沖液⑶(使用前先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。(8)向吸附柱CR中加入700ill漂洗液PW(使用前先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。7(9)向吸附柱CR中加入500iU漂洗液PW，12000rpm(13400Xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液。(10)將吸附柱CR放回收集管中，12000rpm(13400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CR室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。(11)將吸附柱放入剪去管蓋的1.5ml滅菌離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加100u1洗脫液TB，室溫放置5分鐘，12000rpm(13400Xg)離心30秒。(12)將離心得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置5分鐘，12000rpm(13400Xg)離心2分鐘，將洗脫液轉移入新的1.5ml滅菌離心管中。(13)純化的基因組DNA置-20V保存。1.2.3SNP位點的選擇及引物的設計與合成(1)參考Ober等的報道，選取了在>10個樣本中得以重復的5個哮喘易感基因的10個SNP位點(分別為IL13基因C-1112T、C1923T和A2044G位點，IL4基因C-590T位點，IL4RA基因I75V和Q551R位點，ADRB2基因R16G和Q27E位點以及FcERl基因C-109T和E237G位點)和在610個樣本中得以重復的3個哮喘易感基因的5個SNP位點(分別為TGFB1基因C-509T、R25P位點，N0S1基因C5266T位點以及RANTES，即CCL5基因A-403G和G-28C位點)。(2)分別采用HotStartPCR、TouchDownPCR和巢式PCR方法對上述15個SNP位點進行擴增，應用2.2版本muPlex多重PCR設計系統(tǒng)(在線軟件，網址http//genomicsl4.bu.edu:8080/MuPlex/MuPlex.html)對各位點進行引物設計，這些位點的RS號和引物序列見表1-3。引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成1.2.4PCR擴增1.2.4.lHotStartPCR(1)HotStartPCR反應體系反應總體積為10yl，內含TaKaRaExTaqHS(5U/u1)0.05u1lOXExTaq緩沖液(含Mg2+)1u1dNTP混合液(各2.5mM)1u1正向引物(50pmol/u1)0.1u1反向引物(50pmol/u1)0.1u1基因組DNA0.4u1ddH207.35u1(2)HotStartPCR擴增反應條件95°C5min<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>72°ClOmin4°C①1.2.4.2TouchDownPCR(又稱降落PCR)1.2.4.2.1IL13C-III2T位點的TouchDownPCR<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注引物中加粗部分為參閱文獻添加的序列，是為了增大酶切后片段的差異，便于凝膠電泳區(qū)夕<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Mg2+(50mmo1/1)0.3μ1dNTP(2.5mMeach)0.8μ1正向引物(50ρπιο1/μ1)0.1μ1反向引物(50ρπιο1/μ1)0.1μ1基因組DNA0.4μ1ddH207.25μ1(2)擴增反應條件95°C5min<image>imageseeoriginaldocumentpage12</image>72°CIOmin4"C①1.2.4.2.2IL13A2044G位點的TouchDownPCR(1)反應體系反應總體積為10μ1，內含TaKaRaExTaqHS(5U/μ1)0.05μ1IOXExTaq緩沖液(含Mg2+)1μ1dNTP混合液(各2.5mM)1μ1正向引物(50ρπιο1/μ1)0.1μ1反向引物(50ρπιο1/μ1)0.1μ1基因組DNA0.4μ1ddH207.35μ1(2)擴增反應條件95°C5min<image>imageseeoriginaldocumentpage12</image>72°CIOmin4"C①1.2.4.2.3IL4RAQ551R位點的TouchDownPCR(1)反應體系反應總體積為10μ1，內含金牌Taq酶0.05μ1IOX金牌Taq酶HS緩沖液1.0μ1Mg2+(50mmo1/1)0.3μ1dNTP(2.5mMeach)0.8μ1正向引物(50ρπιο1/μ1)0.1μ1反向引物(50ρπιο1/μ1)0.1μ1基因組DNA0.4μ1ddH207.25μ1(2)擴增反應條件95°C5min950C30sec一68-60°C45sec17個循環(huán)(-0.5°C每輪)72°C60sec95°C30seri30個循環(huán)680C90sec72°CIOmin4"C①1.2.4.3巢式PCR(又稱套式PCR)1·2·4·3·1第一輪PCR(1)反應體系反應總體積為10μ1，內含金牌Taq酶0.05μ110X金牌Taq酶HS緩沖液1.0μ1Mg2+(50mmo1/1)0.3μ15XQ-solution2.0μ1dNTP(2.5mMeach)0.8μ1外側正向引物(50ρπιο1/μ1)0.1μ1外側反向引物(50ρηο1/μ1)0.1μ1基因組DNA0.4μ1ddH205·25μ1(2)擴增反應條件95°C5min95°C30sec"Tm45sec40個循環(huán)72°C1mrn72°CIOmin4°C①1.2.4.3.2第二輪PCRIL13C-1112T和IL4RAQ551R兩位點采用巢式PCR+TouchDownPCR方法進行擴增，即在上述第一輪PCR反應結束后，將PCR產物稀釋1000倍進行2.4.2部分介紹的相應TouchDownPCR反應。而IL4RAI75V和RANTESG-28C兩位點則在上述第一輪PCR反應結束后，將PCR產物稀釋1000倍繼續(xù)進行如下反應(1)反應體系反應總體積為10μ1，內含金牌Taq酶0.05μ110X金牌Taq酶HS緩沖液1.0μ1Mg2+(50mmo1/1)0.3μ1dNTP(2.5mMeach)0.8μ1內側正向引物(50ρπιο1/μ1)0.1μ1內側反向引物(50ρπιο1/μ1)0.1μ1基因組DNA0.4μ1ddH207.25μ1(2)擴增反應條件95°C5min95°C30se~Tm45sec40個循環(huán)72°C1min72°CIOmin4"C①1.2.5PCR產物檢測PCR擴增反應結束后，取PCR產物5μ1與1μ1電泳上樣緩沖液混勻后在2.0%(w/v)的瓊脂糖凝膠(瓊脂糖凝膠在制備過程中已加入溴化乙錠，終濃度為0.5yg/ml)上電泳，按5V/cm的電壓在0.5XTBE緩沖液中電泳；電泳結束后在FR-980型生物電泳圖像分析系統(tǒng)上進行凝膠拍照，分析PCR擴增情況。1.2.6限制性片段長度多態(tài)性分析(1)各SNP位點對應的限制性內切酶見表4。(2)酶切反應體系反應體系體積為10μ1，內含PCR產物5μ1IOXBuffer緩沖體系1μ1100XBSA0.1μ1(僅BsmFI、Tru9I禾口XmnI)限制性內切酶0.5UddH20補足至總體積達10μ1(3)酶切反應溫度及時間各SNP位點的酶切反應溫度見表4；反應時間均為16小時。表4各SNP位點的限制性內切酶、酶切反應溫度和酶切產物片段長度<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表4(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>1.2.7酶切產物檢測取每管酶切產物5μ1與1μ1電泳上樣緩沖液混勻后在4.0%(w/v)的瓊脂糖凝膠(瓊脂糖凝膠在制備過程中已加入溴化乙錠，終濃度為0.5μg/ml)上電泳，按2V/cm的電壓在0.5XTBE緩沖液中電泳；電泳結束后在FR-980型生物電泳圖像分析系統(tǒng)上進行凝膠拍照，記錄結果。I·2·S統(tǒng)計學分析1.2.8.1基因型頻率和等位基因頻率計算(1)基因型頻率的計算A，a分別代表兩種等位基因，N代表例數(shù)AA頻率=NAA/(NAA+NAa+Naa)Aa頻率=NAa/(NAA+NAa+Naa)aa頻率=Naa/(NAA+NAa+Naa)(2)等位基因頻率的計算A，a分別代表兩種等位基因，N代表例數(shù)A頻率=(NaA+l/2NAa)/(NaA+NAa+Naa)a頻率=(Naa+l/2NAa)/(NAA+NAa+Nj1.2.8.2Hardy-ffeinberg平衡吻合度檢驗根據Hardy-Weinberg平衡定律計算各SNP位點在哮喘組和對照組中的預期基因型頻率，應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行卡方檢驗比較觀察到的基因型頻率與預期基因型頻率間的差異，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。確定選取的哮喘組與對照組在所研究的各個SNP位點均處于遺傳平衡狀態(tài)，具有群體代表性。2.2.8.3基因型、等位基因和基因型組合分布差異統(tǒng)計學分析應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行卡方檢驗以分析各SNP位點在哮喘組與對照組間的基因型、等位基因和基因型組合頻率差異，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。若某SNP位點的基因型及等位基因頻率在組間具有統(tǒng)計學差異，說明該多態(tài)位點與哮喘具有相關性，反之則與哮喘無相關性。1.2.8.4多個SNP位點的高階交互作用分析應用MDR2.Obeta軟件進行多個SNP位點的高階交互作用分析，建立哮喘檢測模型。MDR軟件程序包是基于Java程序編寫的源代碼開放的免費軟件(可在http//www.epistasis.org/mdr.html免費下載)，在多種操作系統(tǒng)下均可進行MDR分析。先安裝Java2RuntimeEnvironment(JRE，可在http://www.java.com/免費下載)，Windows操作系統(tǒng)下直接點擊mdr.jar文件運行程序。2結果2.1各SNP位點的PCR產物和酶切產物檢測結果采用PCR-RFLP方法對15個SNP位點進行基因分型，各SNP位點的PCR產物和酶切產物凝膠電泳圖分別見圖1和圖2。2.2Hardy-ffeinberg平衡吻合度檢驗結果對15個SNP位點在哮喘病例組與正常對照組中分別進行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗，P值均大于0.05，表明這15個SNP位點在病例組與對照組均處于遺傳平衡狀態(tài)，具群體代表性。2.3各SNP位點在哮喘病例組和正常對照組間的基因型和等位基因頻率分布情況15個SNP位點在哮喘病例組與正常對照組間的基因型和等位基因頻率分布情況見表5。在這15個位點中，IL13A2044G、ADRB2R16G和FcERlC_109T三位點在兩組間的基因型和等位基因頻率分布差異具有統(tǒng)計學意義。病例組A2044G位點GG基因型和G等位基因頻率，R16G位點AA基因型和A等位基因頻率，C-109T位點TT基因型和T等位基因頻率均高于對照組。其余十二位點在兩組間的基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義。2.4十個SNP位點的高階交互作用分析采用MDR方法對在>10個樣本中得以重復的5個哮喘易感基因的10個SNP位點(即IL13C-1112T、C1923T、A2044G，IL4C-590T，IL4RAI75V、Q551R，ADRB2R16G、Q27E，F(xiàn)cERlC-109T、E237G)進行高階交互作用分析，分析結果見表6。FcERlE237G、FcERlC-109T、ADRB2R16G、IL4RAQ551R、IL4RAI75V、IL4C_590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13C-1112T組成的九位點模型具有最好的交叉驗證一致性。該模型的哮喘檢測指標為準確度92.97%，靈敏度97.92%，特異度88.02%,OR(95%CI)=345.3478(117.0514，1018.9122)，x2值=286.3984，P值<0.0001。該模型的“If-ThenRules”如下所示(由于篇幅過長，僅摘錄其中極少部分；Class=1代表患者，Class=0代表非患者):IFFcERl_E237G=AAANDFcERl_C_109T=CTANDADRB2_R16G=GGANDIL4RA_Q551R=GGANDIL4RA_I75V=AAANDIL4_C-590T=TTANDIL13_A2044G=GGANDIL13_C1923T=CTANDIL13_C_1112T=CCTHENCLASSIFYAS1.IFFcERl_E237G=AAANDFcERl_C_109T=CTANDADRB2_R16G=AGANDIL4RA_Q551R=AAANDIL4RA_I75V=GGANDIL4_C_590T=TTANDIL13_A2044G=AG<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表5(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注每一位點，將第三列基因型與前兩列基因型之和進行2X2表卡方檢驗。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>ANDILl3C1923／一CTANDILl3C—ll12T—CTTHENCLASSIFYASo．IFFcERlE237G—AAANDFcERlC一109T—TTANDADRB2R16G—AAANDIL4RAQ551R—AGANDIL4RA工75V—AAANDIL4C一590T一TTANDILl3A2044G=GGANDIL13_C1923T=TTANDIL13_C_1112T=CCTHENCLASSIFYAS1.IFFcERl_E237G=AAANDFcERl_C_109T=CTANDADRB2_R16G=AGANDIL4RA_Q551R=AAANDIL4RA_I75V=AGANDIL4_C-590T=TTANDIL13_A2044G=AGANDIL13_C1923T=CCANDIL13_C_1112T=CCTHENCLASSIFYAS0.IFFcERl_E237G=AGANDFcERl_C_109T=CCANDADRB2_R16G=AGANDIL4RA_Q551R=AGANDIL4RA_I75V=AGANDIL4_C_590T=TTANDIL13_A2044G=AAANDIL13_C1923T=CTANDIL13_C_1112T=CTTHENCLASSIFYAS1.IFFcERl_E237G=AGANDFcERl_C_109T=CTANDADRB2_R16G=AGANDIL4RA_Q551R=AAANDIL4RA_I75V=GGANDIL4_C-590T=CTANDIL13_A2044G=AGANDIL13_C1923T=CTANDIL13_C_1112T=CCTHENCLASSIFYAS1.2.5SNP位點兩兩之間的協(xié)同作用分析對上述九位點模型進行兩兩位點之間的協(xié)同作用分析。ADRB2R16G和FcERlC-109T兩位點的聯(lián)合研究見表7，按是否攜帶R16GAA純合子或C-109TTT純合子分為不同的基因型組合。攜帶AA+TT組合者較僅攜帶單一的AA(即AA+非TT)或TT(S卩非AA+TT)者患哮喘的危險性顯著升高。IL13A2044G和ADRB2R16G兩位點的聯(lián)合研究見表8，按是否攜帶A2044GGG純合子或R16GAA純合子分為不同的基因型組合。攜帶GG+AA、GG+非AA或非GG+AA者較非GG+非AA者患哮喘的危險性升高，且GG+AA升高程度高于GG+非AA或非GG+AA。ADRB2R16G和FcERlE237G的聯(lián)合研究見表9，按是否攜帶R16GAA純合子或E237GGG純合子分為不同的基因型組合。攜帶非AA+GG者與非AA+非GG者相比，患哮喘的危險性無統(tǒng)計學差異，但攜帶AA+GG或AA+非GG者較非AA+非GG者患哮喘的危險性升高，且AA+GG升高程度高于AA+非GG。表7ADRB2R16G和FcERlC-lOOT的協(xié)同作用分析[例數(shù)(％)]<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注將ΑΑ+ΤΤ組分別與AA+非ΤΤ、非ΑΑ+ΤΤ、非AA+非TT三組進行比較表8IL13A2044G和ADRB2R16G的協(xié)同作用分析[例數(shù)(％)]<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注將GG+AA、GG+非AA和非GG+AA三組分別與非GG+非AA組進行比較表9ADRB2R16G和FcERlE237G的協(xié)同作用分析[例數(shù)(％)]<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注將AA+GG、AA+非GG和非AA+GG三組分別與非AA+非GG組進行比較3討論哮喘是一種復雜的多因子、多基因遺傳病。多種基因可能分別或共同控制與哮喘有關特征表型的表達，如血清總IgE水平、血清抗原特異性IgE水平、氣道高反應性、細胞因子合成及分泌等，其調控的最后或共同途徑則為氣道慢性炎癥。尋找出這些相互關聯(lián)的基因對認識哮喘的發(fā)病機制和從遺傳學角度檢測哮喘的易感體質具有重要的科學意義。在過去的十多年里，哮喘基因研究已取得很大進展。2006年初，Ober等經過瀏覽大量文獻，得出結論，認為在6個或更多的獨立樣本中得以重復的25個基因與哮喘或變應性疾病表型相關，是真正的哮喘或變應性疾病易感基因，其中10個基因在>10個樣本中得到重復，15個基因在610個樣本中得以重復。由于存在種族差異性，為了解中國漢族兒童哮喘發(fā)病的遺傳基礎，尋找出相互關聯(lián)的基因位點，初步建立哮喘基因檢測模型，本實驗選取了上述在>10個樣本中得以重復的5個哮喘易感基因的10個SNP位點和在610個樣本中得以重復的3個哮喘易感基因的5個SNP位點，進行了單一位點、高階交互作用以及兩兩協(xié)同作用分析。一、單一位點分析本實驗對包括過敏性哮喘患兒和健康大學生各192例，共384例的漢族人群進行了病例對照研究。之所以選擇健康大學生而不選擇健康兒童作為對照，是為了有足夠長時間除外哮喘等疾病診斷，說明至少在成年以前無相關病史。對上述15個候選SNP位點進行單點分析，發(fā)現(xiàn)IL13A2044G、ADRB2R16G和FcERlC-109T三位點在病例組與對照組間的基因型和等位基因頻率分布差異具有統(tǒng)計學意義；病例組A2044G位點GG基因型和G等位基因頻率，R16G位點AA基因型和A等位基因頻率，C-109T位點TT基因型和T等位基因頻率均高于對照組，這表明IL13A2044G、ADRB2R16G和FcERlC-109T三位點均與漢族兒童哮喘發(fā)生相關，是主效應位點；A2044GGG純合子、R16GAA純合子和C-109TTT純合子均為哮喘易感基因型。文獻資料顯示，IL-13A2044G與血清總IgE升高明顯相關，后者是哮喘進展的一大高危因素；該多態(tài)性使IL13與受體結合的親和力降低，導致局部IL13濃度升高，與受體結合后信號轉導增強，引發(fā)嚴重的支氣管哮喘；A2044GSNP還與特應性、運動誘發(fā)氣道高反應性的嚴重程度以及肺功能降低有關。ADRB2R16G能增高氣道反應性，并通過顯著下調受體數(shù)量而影響支氣管擴張劑的療效。？戰(zhàn)附-川肌等位基因與編碼？戰(zhàn)附日鏈的MS4A2基因啟動子活性增高有關，C-109TSNP使肥大細胞MS4A2基因表達增加，導致氣道促炎癥反應介質釋放增多；C-109TTT純合子基因型與過敏性哮喘患者血漿總IgE水平升高有關。本研究結果還顯示，十五個候選SNP位點中，除上述三個主效應位點外，其余十二位點在病例組與對照組間的基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義，說明這些多態(tài)性與漢族兒童哮喘發(fā)病無明顯相關性，為非主效應位點。這與中國人群的某些類似研究結論相符，但與國外的一些文獻報道并不相一致，其原因可能是不同種族人群之間的遺傳背景不同，也可能與本實驗樣本量多少有關，擬加大樣本含量對上述SNP位點做進一步研究。二、高階交互作用分析2001年Ritchie等提出的多因子降維法是目前研究多個SNP位點相互關聯(lián)關系的主流統(tǒng)計學方法。采用MDR法對多個SNP位點進行高階交互作用分析可獲得較為理想的哮喘易感基因檢測模型。由于本實驗樣本量有限，參與統(tǒng)計分析的SNP位點總數(shù)不能過多，否則影響MDR分析的效能。本實驗在對SNP位點進行單點分析時發(fā)現(xiàn)IL13、ADRB2和FcERl這三個基因與漢族兒童哮喘發(fā)生相關，三者均為在>10個樣本中得以重復的哮喘易感基因，因此在采用MDR法進行多位點高階交互作用分析以初步建立哮喘基因檢測模型時，僅選取在>10個樣本中得以重復的5個哮喘易感基因的10個候選SNP位點進行研究。結果顯示，ADRB2R16G和IL13A2044G組成的兩位點模型以及FcERlE237G、FcERlC-109T,ADRB2R16G、IL4RAQ551R、IL4RAI75V、IL4C-590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13C-1112T組成的九位點模型均具有良好的交叉驗證一致性(前者為9/10，后者為10/10)。兩位點模型的哮喘檢測指標為準確度64.06%，靈敏度73.96%，特異度54.17%,OR(95%Cl)=3.3564(2.1844，5.1571)，χ2值=31.6133，P值<0.0001。九位點模型為準確度92.97%，靈敏度97.92%，特異度88.02%,0R(95%Cl)=345.3478(117.0514，1018.9122)，χ2值=286.3984，P值<0.0001。最佳模型判讀時，在所有等級的模型中，應選擇交叉驗證一致性最大的模型。上述九位點模型的各項哮喘檢測指標均優(yōu)于兩位點模型，因此選擇該九位點模型作為最佳檢測模型，它包含了前述的三個主效應位點以及另外六個非主效應位點。該模型“If-ThenRules”顯示的是九個SNP位點形成的所有基因型組合的哮喘易感性分類(易感型、非易感型)。MDR方法適合對病例對照研究進行多個基因位點的交互作用分析，目前已成功應用于哮喘等多種疾病的研究。韓國學者報道，KDRV297I和TNFG-308A組成的兩位點模型對檢測本國兒童罹患變應性疾病的準確度為64.1%，交叉驗證一致性為10/10。一項有關Eotaxin基因與哮喘的研究顯示，由兩個主效應位點(Eot2+1272A>G和Eot3+77C>T)與三個非主效應位點(Eot2+304C>A、Eot3+716A>G和Eot3+1579G>Α)組成的五位點模型對韓國人群的哮喘檢測準確度為64.3%，交叉驗證一致性為10/10，P值<0.001。香港的LeungTF通過MDR分析，得出結論IL13R130Q、ADRB2R16G和STAT6C1570T三位點存在顯著的交互作用，共同決定中國哮喘兒童FVC的改變。迄今為止，尚無漢族兒童哮喘檢測模型的相關報道，本研究屬首次，具有創(chuàng)新性。三、兩兩協(xié)同作用分析IL13A2044G、ADRB2R16G禾PFcERlC-109T三個主效應位點的OR值分別為2.255、2.575和1.961，而由這三個主效應位點以及另外六個非主效應位點組成的九位點模型OR值高達345.3478。九位點模型患哮喘的危險度顯著高于單一SNP位點，提示不同位點之間存在相互協(xié)同作用。本實驗進一步對九位點模型進行兩兩位點之間的協(xié)同作用分析，發(fā)現(xiàn)攜帶ADRB2R16GAA和FcERlC-109TTT組合者較僅攜帶單一的R16GAA或C-109TTT者患哮喘的危險性顯著升高；攜帶IL13A2044GGG和ADRB2R16GAA組合者較僅攜帶單一的A2044GGG或R16GAA者患哮喘的危險性升高；攜帶ADRB2R16GAA和FcERlE237GGG組合者較僅攜帶單一的R16GAA或E237GGG者患哮喘的危險性升高，表明ADRB2R16G和FcERlC_109T，IL13A2044G和ADRB2R16G，ADRB2R16G和FcERlE237G兩兩之間均存在協(xié)同作用。這就解釋了為什么九位點模型較單一SNP位點患哮喘的危險性顯著升高，也解釋了為什么九位點模型的OR值明顯高于前述的兩位點模型。目前，有關兩個SNP位點之間協(xié)同作用的研究報道并不少見。例如，LlanesE研究發(fā)現(xiàn)單一SNP位點IL4RAI50V或Q551R均與哮喘表型無關，但兩者聯(lián)合則與哮喘表型密切相關，表明這兩個非主效應位點之間存在協(xié)同作用。本課題組2008年發(fā)表的一篇論著報道了IL13A2044G和ADRB2R16G多態(tài)性對兒童哮喘發(fā)生的協(xié)同作用。香港學者的研究顯示IL13R130Q、ADRB2R16G和STAT6C1570T三者交互作用，共同決定中國哮喘兒童FVC的改變。迄今為止，尚未見文獻資料報道ADRB2R16G和FcERlC_109T，ADRB2R16G和FcERlE237G兩兩之間的協(xié)同研究。綜上所述，十五個候選SNP位點中，IL13A2044G、ADRB2R16G禾口FcERlC-109T與漢族兒童哮喘發(fā)病相關，為主效應位點，其余十二位點與漢族兒童哮喘發(fā)病無明顯相關性，為非主效應位點；主效應位點之間，主效應位點和非主效應位點之間存在兩兩協(xié)同作用；由三個主效應位點和六個非主效應位點組成的九位點模型對漢族兒童哮喘具有良好的檢測效能，成為本研究確立的最佳檢測模型。漢族兒童哮喘易感基因檢測模型的建立在國內尚屬首次，具有創(chuàng)新性；與國外類似研究相比較，具有種族特異性。然而，這只是檢測模型的初步建立，其最終確定還需不斷完善。Ritchie指出，病例、對照數(shù)各200例時，檢測兩位點交互作用，MDR的效能達到80%以上。即使在5%的基因型錯分和5%缺失數(shù)據的情況下，對大多數(shù)模型該結果仍然真實。但是，同樣這個樣本含量，進行10個位點交互作用時，MDR的效能下降至60%左右。因此，模型完善首要進行的工作就是進一步擴大樣本含量。此外，Ober等確定的哮喘易感基因有25個之多，而本實驗僅對其中的8個基因進行了研究，為獲得更準確的檢測模型，需增加擬研究的基因位點數(shù)目。實驗樣本量的擴大以及待研究基因位點數(shù)目的增加，導致對實驗技術的要求提高。本實驗采用的PCR-RFLP技術是經典的基因分型方法，且價格低廉，但其耗費的時間和人力較多，僅適用于小樣本量研究。后續(xù)研究需改善實驗方法，采用實時熒光定量PCR技術或高通量SNP基因分型技術進行大樣本量研究。另外，這些年來，統(tǒng)計學方法不斷發(fā)展，應密切關注，及時吸納，爭取在現(xiàn)有方法基礎上獲得更好的檢測模型。目前，關于哮喘易感基因檢測模型的建立尚處于實驗探索階段，在經過上述各種改進獲得較為完善的模型后，還需臨床實驗驗證。MDR所創(chuàng)造的是區(qū)分高危、低危個體的理想的判別分類模型。檢測模型的最終確立，將有助于判別哮喘高危兒童，及早進行干預，防患于未然，對有效降低哮喘患病率具有積極意義。此外，循著基因-基因統(tǒng)計學交互作用的研究結果，還可進行相應功能水平上的生物學交互作用研究，這或許將打開另一扇認識哮喘發(fā)病機制的大門。在后基因組時代，兒童哮喘基因研究的主要目標是了解各相關基因的功能，其中包括基因-基因、基因_環(huán)境之間復雜的交互作用。雖然目前還無法做到完全確認所有的基因-基因交互作用，但至少能對該多基因疾病中相對重要的一些交互作用予以探討，這將有助于今后對哮喘更全面的認識。4結論漢族兒童哮喘易感基因檢測模型初步建立，由FcERlE237G、FcERlC_109T、ADRB2R16G、IL4RAQ551R、IL4RAI75V、IL4C-590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13C-1112T九個SNP位點組成，具有良好的哮喘檢測效能，但該模型仍需進一步完善。實施例2漢族兒童哮喘易感基因檢測模型的臨床應用新華醫(yī)院兒內科將來自漢族人群的病例對照各192例作為研究對象，就8個基因的15個單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNPs)位點進行基因分型，采用研究多個SNP位點相互關聯(lián)關系的主流統(tǒng)計學方法——多因子降維法(multifactordimensionalityreduction,MDR)進行統(tǒng)計分析，初步建立了由FcERlE237G、FcERlC-109T、ADRB2R16G、IL4RAQ551R、IL4RAI75V、IL4C-590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13C-1112T九個SNP位點組成的漢族兒童哮喘易感基因檢測模型，其具有良好的哮喘檢測效能(0R=345.3478，P值<0.0001，準確度92.97%，靈敏度97.92%，特異度88.02%)。漢族兒童哮喘易感基因檢測模型的建立在國內尚屬首次，具有創(chuàng)新性；與國外類似研究相比較，具有種族特異性。MDR所創(chuàng)建的是區(qū)分高危、低危個體的理想的判別分類模型，該模型顯示九個SNP位點形成的所有基因型組合的哮喘易感性分類(易感型、非易感型)。檢測模型的確立，將有助于判別哮喘高危兒童，及早進行干預，防患于未然，對有效降低哮喘患病率具有積極意義?，F(xiàn)將漢族兒童哮喘易感基因檢測模型的臨床應用簡介如下1、對該模型申請專利，并將其開發(fā)成漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒。該試劑盒由九小盒組成，每小盒分別對應九位點模型中的一個SNP位點，進行基因分型。每小盒內裝DNA抽提、PCR擴增、限制性內切酶酶切以及瓊脂糖凝膠電泳四步驟的相關試劑。2、該檢測試劑盒的適用對象為散布在社區(qū)的潛在哮喘患兒，即那些具有個人或家族過敏史，但尚無哮喘者，這些潛在患兒在一定條件下就可能發(fā)為哮喘。國外提出哮喘三級預防的概念，其中一級預防就是在疾病尚未發(fā)生時就采取積極有為的措施，如改變高危人群的生活環(huán)境、飲食習慣等，防止哮喘的發(fā)生。我們可以采用漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒對那些潛在患兒進行早期篩查，確定哮喘高危兒童，對其有針對性地采取諸如避免過敏原等措施，防患于未然，有效降低哮喘患病率，節(jié)約大量資源。3、檢測步驟(1)采集被檢者的口腔頰粘膜拭子；(2)提取口腔拭子基因組DNA；(3)對特異性DNA片段進行PCR擴增；(4)采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測PCR產物；(5)對PCR產物進行限制性內切酶酶切反應；(6)采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測酶切反應產物，確定基因型；(7)每個SNP位點的基因分型方法同上所述，重復九次，獲得九個SNP位點的基因型；(8)根據九位點的基因型結果，判別哮喘易感性分類，即確定該被檢者是哮喘高危還是低危兒童；(9)對哮喘高危兒童及其家庭進行哮喘教育和管理。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。權利要求一種漢族兒童哮喘易感基因檢測模型，其特征在于，所述的檢測模型由FcER1E237G、FcER1C-109T、ADRB2R16G、IL4RAQ551R、IL4RAI75V、IL4C-590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13C-1112T九個SNP位點組成。2.一種漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒由九個小試劑盒組成，所述的九個小試劑盒分別是檢測FcERlE237G、FcERlC-109T、ADRB2R16G、IL4RAQ551R、IL4RAI75V、IL4C-590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13C-1112T的SNP位點小試劑盒，每小試劑盒內裝DNA抽提、PCR擴增、限制性內切酶酶切以及瓊脂糖凝膠電泳步驟的相關試劑。3.一種漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒由兩個小試劑盒組成，所述的兩個小試劑盒分別是檢測ADRB2R16G和FcERlC_109T的SNP位點小試劑盒，每小試劑盒內裝DNA抽提、PCR擴增、限制性內切酶酶切以及瓊脂糖凝膠電泳步驟的相關試齊11°4.一種漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒由兩個小試劑盒組成，所述的兩個小試劑盒分別是檢測ADRB2R16G和FcERlE237G的SNP位點小試劑盒，每小試劑盒內裝DNA抽提、PCR擴增、限制性內切酶酶切以及瓊脂糖凝膠電泳步驟的相關試齊11°全文摘要本發(fā)明涉及一種漢族兒童哮喘易感基因檢測模型，所述的檢測模型由FcER1E237G、FcER1C-109T、ADRB2R16G、IL4RAQ551R、IL4RAI75V、IL4C-590T、IL13A2044G、IL13C1923T和IL13C-1112T九個SNP位點組成。本發(fā)明還提供了漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒，本發(fā)明優(yōu)點在于漢族兒童哮喘易感基因檢測模型的建立在國內尚屬首次，具有創(chuàng)新性；與國外類似研究相比較，具有種族特異性。本發(fā)明中檢測九個SNP位點的漢族兒童哮喘易感基因檢測試劑盒，其具有良好的哮喘檢測效能(OR＝345.3478，P值＜0.0001，準確度92.97％，靈敏度97.92％，特異度88.02％)。文檔編號C12Q1/68GK101831501SQ201010183908公開日2010年9月15日申請日期2010年5月25日優(yōu)先權日2010年5月25日發(fā)明者華麗,鮑一笑申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院