專利名稱：一種可同時檢測多種赤潮藻的膜分類芯片的制備與應用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及的是一種可同時檢測多種赤潮藻的膜分類芯片的制備與應用方法。
背景技術：
赤潮是指由于海洋浮游生物，包括藻類(主要原因種)、原生動物和細菌的過度繁殖或聚集造成海水變色的現象。近年來，由于人類活動的加劇，海洋日趨富營養(yǎng)化，導致赤潮頻發(fā)，并已成為一種全球性的生態(tài)災害，給水產養(yǎng)殖業(yè)、捕撈業(yè)和濱海旅游業(yè)造成了巨大損失，同時也給海洋生態(tài)環(huán)境帶來負面影響，甚至直接威脅人類健康。有害赤潮在我國呈現出爆發(fā)次數增多、面積擴大、持續(xù)時間延長和危害加劇的趨勢。如在2004年我國爆發(fā)赤潮的次數就達120次，特別是1998— 2000年連續(xù)3年我國的黃海、渤海和南海就發(fā)生面積達上千平方公里的特大赤潮，為世界罕見，因此，赤潮引起了公眾和政府的高度重視。對赤潮原因種 進行正確鑒定是研究、認識和防治其引起的赤潮的前提和基礎，同時更應建立簡單、快速和特異性強的檢測方法，監(jiān)測赤潮高發(fā)區(qū)的水環(huán)境，對可能爆發(fā)的有害赤潮進行預警，特別是指導漁業(yè)生產者及時采取應對措施，以減少經濟損失。特別是由于赤潮藻多種多樣，在全世界的4000多種浮游生物中，能形成赤潮的達260多種。因此，在自然水域中多種赤潮藻常常同時存在，在水環(huán)境的日常監(jiān)測中，就有必要建立一種能同時對自然水樣中的多種赤潮藻進行檢測的技術。當前，對自然水樣中的赤潮藻的檢測的傳統(tǒng)方法，主要是以其分類學特征為基礎，借助光鏡和電鏡對其細胞形態(tài)特征進行觀察，并最終對其進行鑒定。形態(tài)鑒定法的缺點(I)赤潮藻一般個體較小，識別困難，光鏡有時只能鑒定到屬，而要進一步確定其具體種類，可能需要進行電鏡觀察，特別是當要對自然樣品中的多種赤潮藻進行鑒定時，其工作繁鎖且檢測成本較高，難以適應日常水環(huán)境監(jiān)測對大量樣品的快速、準確處理的要求；(2)赤潮的發(fā)生通常是暴發(fā)性事件，自然水體中的赤潮藻在赤潮發(fā)生早期的細胞濃度較低，并與非赤潮藻混合在一起，一些常規(guī)的監(jiān)測手段，如藻種采集、定性和定量記錄等較為困難，因而可能延誤赤潮藻的預警；(3)赤潮藻細胞的表觀形態(tài)極易隨生活環(huán)境和生理狀態(tài)發(fā)生更改，因此其鑒定的經驗依賴度高，這就使得有些赤潮微藻的鑒定成為分類學家的專長，也增加了自然海域中赤潮種源的鑒定、監(jiān)控以及預警的難度。最近，分子生物學技術為赤潮藻的鑒定提供了新思路。赤潮藻的分子檢測技術以藻細胞的基因組核糖體DNA (rDNA)為靶目標，其主要原因是藻類基因相對恒定，不會像其表觀形態(tài)特征隨環(huán)境條件的不同而發(fā)生變化。因此，其可克服形態(tài)學鑒定法的缺點，具有特異性強，檢測迅速的特點。近年來，出現了大量有關赤潮藻分子檢測方法，包括DNA測序、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD) (random amplified polymorphic DNA)、全細胞突光原位雜交(fluorescence insitu hybridization, FISH)、實時突光定量PCR和三明治雜交(sandwichhybridization, SHA),但這些方法都只能對自然樣品中的單種赤潮藻進行檢測。最近，還出現了可對自然樣品中的多種赤潮藻進行并行檢測的基因芯片法。 現有的分子檢測方法的缺點(I)現有的分子檢測技術除基因芯片技術外均只能對自然樣品的單種赤潮藻進行鑒定和檢測，不能對自然樣品的多種赤潮藻進行檢測；(2)現有芯片檢測技術雖然能實現對自然樣品中多種赤潮藻的并行檢測，但其芯片的制備需要基因芯片點樣儀，雜交需要雜交儀，雜交信號結果的判讀需要熒光掃描儀，這些儀器極其昂貴，致使其檢測費用較高，因而難以成為常規(guī)檢測技術。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種可同時檢測多種赤潮藻的膜分類芯片的制備與應用方法。本發(fā)明的技術方案如下一種可同時檢測多種赤潮藻的膜分類芯片的制備方法，包括以下步驟(I)種特異性探針的合成，按下表所示的序列信息合成檢測探針探針信息
權利要求
1.一種可同時檢測多種赤潮藻的膜分類芯片的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(I)種特異性探針的合成，按下表所示的序列信息合成檢測探針探針信息
2.根據權利要求1所述的可同時檢測多種赤潮藻的膜分類芯片的應用方法，其特征在于，包括以下步驟(1)水樣的采集及藻細胞的過濾采集自然水樣，混勻，用5ml—次性滅菌針頭吸取檢測樣品，將濾膜安置于過濾器上，手推過濾；(2)洗膜及膜的剪切處理用針頭吸取去離子水，將含有藻細胞的濾膜洗滌2次，將濾膜從過濾器取下，用滅菌的剪刀將其剪成碎屑，并用鑷子將膜碎屑放入1. 5mL離心管中；(3)DNA粗提液的制備用槍頭吸取50 - 100 μ I核酸粗提液加入到所述離心管中，IOOOrpm離心30s后，于潤旋振蕩器上劇烈振蕩至少5min, IOOOrpm離心30s后，上清液即為 DNA 粗提液；核酸粗提液2%(m/v) CTAB, O. 5%(ν/ν) β -mercaptoethanol,1. 4MNaCl, 20mM EDTA, IOOmM Tris-Cl ；(4)多重PCR擴增反應用通用引物進行多重PCR反應制備靶核酸，PCR反應體系含 I μ I DNA 粗提液，2. 5 μ 110 XPCR buffer,1. 5μ I MgCl2 (1. 5mM)，I μ I of dNTP (0. 4mM dATP/dTTP/dCTP, 0. 38mM dCTP，0. 02mM DIG-dUTP), I μ I 正向引物 fp :5，-ACCCGCTGAATTTA AGCATA-3 ’ (O. 4mM)和 I μ I 反向引物 rp: 5 ’ -CCTTGGTCCGTCTTTCAAGA-3 ’ (O. 4mM)，16. 8 μ I PCR級水，O. 2μ I (IU)Taq聚合酶；PCR反應條件為:DNA變性，94° C4min ;94。C變性 lmin， 50或55。C退火50s，72。C延伸50s，29個循環(huán)；一個末循環(huán)，72° C7min ；(5)核酸雜交將膜分類芯片放入雜交袋中，按膜的大小加入雜交液，雜交液l%(m/v) Blocking Reagent II, O. 75M NaCl, O. 075M 二水檸檬酸三鈉，50 μ g/ml 鮭精 DNA，雜交液用量為O. 2ml/cm2膜分類芯片，封口混勻后，于42° C水浴中孵育2 6h ;(6)洗膜剪開雜交袋，按下列次序進行洗膜a.用2XSSC/0.l%(v/v) SDS室溫洗膜 5min2 次；b.用 O. 1XSSC/0. 1%SDS42° C 洗膜 15min2 次；c.用 Buffer I 室溫洗膜 2min ； d.用 Buffer II 室溫洗膜 30min ；Buffer I 為:0.1M Tris, O. 15M NaCl, ρΗ7· 5 ；Buffer II 為1%(m/v)Blocking Reagent II, 0.1M Tris, 0. 15NaCl, ρΗ7· 5。(7)抗體反應剪開含探針的雜交袋一角，加入1/5000體積的堿性磷酸酶標記的DIG 抗體，在室溫振蕩30min ;在室溫下分別用Buffer I洗膜15min2次,Buffer III洗膜2minl 次；Buffer III 為0.1M Tris, 0.1M NaCl, 0. 05M MgCl2, ρΗ9· 5 ；(8)顯色反應在雜交袋中按膜大小加入BufferIII，Buffer III用量0. 2ml/cm2膜分類芯片，并按8/1000 (v/v)的比例加入顯色劑，封口混勻，置于暗處，顯色15mirT2h，可短時間取出膜觀察，勿攪動；在樣品明顯出現顏色而本底剛剛有所變色時，停止顯色，取出膜，置于50ml水中15 30min,將膜置于濾紙上晾干，對光觀察結果；(9 )結果判讀參照陰性和陽性對照結果進行檢測樣品的判讀，其中陽性對照有紫紅色斑點、陰性對照無紫紅色斑點；對于檢測樣品，如果對應點樣區(qū)域有顯色斑點，同陽性對照， 則表明水樣中有該種赤潮藻的存在，如果對應區(qū)域無顯色斑點，同陰性對照，則表 明水樣中無該種赤潮藻的存在。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可同時檢測多種赤潮藻的膜分類芯片的制備方法，包括以下步驟(1)種特異性探針的合成；(2)探針溶液的配制；(3)探針陣列的設計；(4)尼龍膜處理；(5)探針點樣及膜處理。現有的基因芯片需要芯片點樣儀進行制備，雜交需要芯片雜交儀，雜交信號的檢測需要熒光掃描儀，這些均是昂貴的儀器，而膜分類芯片的制備只需要毛細吸管或微量移液器，雜交可在雜交袋中進行，雜交信號可直接通過肉眼觀察。現有基因芯片檢測屬高科技技術，操作復雜，對檢測人員的技術要求高，而膜分類芯片制備和應用方法簡單，適宜于推廣應用。該芯片能同時檢測自然樣品中的6種常見赤潮藻，其操作流程簡單，且不需要昂貴的儀器。
文檔編號C12Q1/04GK103045752SQ20131002245
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月21日 優(yōu)先權日2013年1月21日
發(fā)明者陳國福, 張春云, 劉洋 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(威海)