專利名稱：：早期檢測麻痹性貝毒毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
的檢測方法，具體是一種早期檢測麻痹性貝毒毒性的方法。
背景技術(shù)：
：赤潮的頻繁爆發(fā)，不僅惡化了海洋環(huán)境，更重要的是赤潮當(dāng)中很多藻類可產(chǎn)生毒素，這些毒素在海產(chǎn)品中富集，通過食物鏈的傳遞使人在食用海產(chǎn)品后造成中毒現(xiàn)象。雖然藻毒素大多來自于有毒赤潮藻類，但藻類產(chǎn)生的毒素往往通過貝類、魚類等媒介富集，造成人類中毒，因此這些毒素通常被稱為貝毒，根據(jù)毒素的作用機(jī)制不同，藻毒素分為以下五種麻痹性貝毒(PSP)、腹瀉性貝毒(DSP)、記憶缺失性貝毒(ASP)、神經(jīng)性貝毒(NSP)和西加魚毒(CFP)，其中麻痹性貝毒是目前研究最為廣泛，也是對(duì)人類健康危害最大的赤潮毒素。而麻痹性貝毒(PSP)的基本結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)胍鹽基的四水化嘌呤，目前發(fā)現(xiàn)的大約20種化合物屬于麻痹性貝毒一族，有以下幾類(l)氨基甲酸酯類毒素(Carbamatetoxins),包括石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)、新石房蛤毒素(Neosaxitonxin，neoSTX)，漆溝藻毒素1-4(Gonyautoxins，GTX1-4);(2)N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfocabamoyltoxins)，包括GTX5(Bl)、GTX6(B6)，C1-4;(3)脫氨基甲?；惗舅?decarbamoyltoxins),包括dcSTX、dcneoSTX、dcGTXl-4;(4)N-羥基類毒素(N-hydroxycarb柳oyltoxins)包括hySTX和hyneoSTX。目前，用于麻痹性貝毒檢測的方法有生物測試法(Bioassay)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法(LC/MS)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。小白鼠生物檢測法是目前唯一得到國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)生物檢測麻痹性貝毒的方法，此法利用小白鼠腹腔注射麻痹性貝毒提取液后測定其死亡時(shí)間來反映毒素的含量，以"鼠單位"(MU)來表達(dá)，鼠單位的定義是一只20g重的小白鼠腹腔注射后在15min內(nèi)死亡的毒素含量即為一個(gè)鼠單位。1MU的毒素含量相當(dāng)于0.18g的STX。但是生物測試法因需要使用大量動(dòng)物且只能定性不能定量受到批評(píng)，而且該法是在小鼠死亡的基礎(chǔ)上得到麻痹性貝毒的含量，起不到早期預(yù)測的目的?；瘜W(xué)法包括HPLC/MS/MS等儀器分析法，采用HPLC/MS/MS可以檢測所有毒素成份及其含量，其準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較高，檢測時(shí)間比較短。其缺陷在于缺乏標(biāo)準(zhǔn)品，麻痹性貝類毒素由20多種化合物組成，目前能作為商品流通的標(biāo)準(zhǔn)物僅有89種(GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、STX、Neo、GTX5、GTX6、dcSTX)。而且高效液相色譜法不能同時(shí)檢測大量樣品，毒素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，樣品前處理要求較高，需要昂貴的設(shè)備及高素質(zhì)的操作人員，從而限制了高效液相色譜的使用?；诿庖呒夹g(shù)開發(fā)的藻毒素ELISA方法，該方法的靈敏度可達(dá)到pg級(jí)，并具有更高的置信度，目前國外的一些化學(xué)試劑公司已有商品化的成套試劑盒出售。但我國依然屬于空白，且全部依靠進(jìn)口，昂貴的價(jià)格限制了貝類赤潮藻毒素檢測的免疫方法在基層常規(guī)檢測中的普及應(yīng)用。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，GiresUsup，等在《Toxicon》(生物毒素)(2005，46:93-98)上發(fā)表的(Arapiddetectionmethodforparalyticshellfishpoisoningtoxinsbycellbioassay)(利用細(xì)胞快速檢測麻痹性貝毒毒性的方法)，該文提出利用毒素對(duì)細(xì)胞的毒性作用來檢測毒素方法，具體方法為在培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中加入^+通道活化劑藜盧定或化+/1(+41酶抑制劑烏本苷，細(xì)胞會(huì)由于Na+內(nèi)流過多而造成腫脹，甚至死亡。但如果在以上過程中同時(shí)加入具Na+通道阻斷作用的麻痹性貝毒毒素，Na+內(nèi)流會(huì)因拮抗作用而受到限制，使得細(xì)胞成活，由此可以確定毒素的存在。其不足在于檢測時(shí)間過長需要6小時(shí)甚至更長時(shí)間，細(xì)胞培養(yǎng)需要嚴(yán)格的培養(yǎng)條件和高素質(zhì)的專業(yè)人員，所以該方法同樣很難在現(xiàn)場和海產(chǎn)品市場推廣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種早期檢測麻痹性貝毒毒性的方法，使其解決麻痹性貝毒現(xiàn)場、快速、大批量樣品的檢測分析及毒性早期檢測問題，比目前國內(nèi)常用的小鼠法相比時(shí)間提前2—10倍，而且個(gè)體沒有出現(xiàn)任何癥狀，適于現(xiàn)場快速、大批量樣品的檢測分析及毒性早期檢測。本發(fā)明僅需檢測普通生化指標(biāo)的改變，操作簡單方便，適合現(xiàn)場和基層檢測部門推廣使用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明采用乙酰膽堿和一氧化氮合酶作為生物標(biāo)志物，利用該兩種普通生化指標(biāo)的變化特點(diǎn)檢測貝類毒素的含量，具體方法為將現(xiàn)場貝類樣品制作成檢測液，然后用檢測液腹腔注射小鼠，檢測小鼠腦中乙酰膽堿含量和一氧化氮合酶活力的變化，由乙酰膽堿(Ach)含量和一氧化氮合酶(N0S)活力水平得到麻痹性貝毒含量，從而早期檢測麻痹性貝毒毒性。本發(fā)明具體包括以下步驟(1)制備樣品檢測液貝類樣品采集處理后，溶于HC1中得樣品原液，原液用生理鹽水稀釋得到樣品檢測液。所述的HC1，其濃度為0.lmol/L。(2)小鼠暴露選擇健康的ICR(InstituteofCancerResearcch，美國癌癥研究所)品系成年小鼠，用檢測液對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，15min后取材。(3)腦勻漿制備取注射后小鼠的腦組織碎塊放入勻漿介質(zhì)中進(jìn)行勻漿。所述的勻漿介質(zhì)是由三羥甲基胺基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)，蔗糖配置而成，其摩爾比為Tris:EDTA-2Na:蔗糖=100:1:100。其配置方法為，將Tris，EDTA-2Na用水溶解，再用20Ommol/LHC1進(jìn)行滴定至pH偏弱堿性，然后加蔗糖，以微波進(jìn)行消毒，冷卻后放入冰箱備用。(4)測定乙酰膽堿(Ach)含量ACh和堿性鹽酸羥胺反應(yīng)生成乙酰羥胺酸，產(chǎn)物在酸性條件下與三氯化鐵形成棕黃色化合物，于波長540mn處測其吸光度。(5)測定一氧化氮合酶(N0S)活力N0S催化左旋精氨酸和分子氧反應(yīng)可生成一氧化氮(N0)，N0與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在波長530nm處測定其吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算出N0S活力。(6)結(jié)果判斷依據(jù)乙酰膽堿(Ach)含量和NOS活力水平分析麻痹性貝毒含量，從而早期檢測其毒性。本發(fā)明的特征是用現(xiàn)場貝類檢測液暴露小鼠，通過神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)變化來檢測麻痹性貝毒毒性。神經(jīng)遞質(zhì)是化學(xué)傳遞物質(zhì)，主要在神經(jīng)元中合成并儲(chǔ)存于突觸前囊泡內(nèi)，信息傳遞過程中由突觸前膜釋放到突觸間隙，作用于相鄰神經(jīng)元突觸后膜，從而產(chǎn)生生理效應(yīng)。按照神經(jīng)信息生物學(xué)的劃分，神經(jīng)遞質(zhì)屬于細(xì)胞外的信使物質(zhì)，被稱為第一信使。它可以通過作用于特定的受體，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)生理狀態(tài)的改變或新物質(zhì)產(chǎn)生，如細(xì)胞電勢的改變、開放離子通道、激活胞內(nèi)第二信使，從而將外界信息傳入細(xì)胞內(nèi)。神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜而統(tǒng)一的信息傳遞過程中起著非常重要的作用。因本發(fā)明中采用的指標(biāo)為神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)乙酰膽堿(Ach)和一氧化氮合酶(N0S)，這些指標(biāo)變化不受現(xiàn)場貝類種類的影響，指標(biāo)檢測不需要昂貴的儀器設(shè)備，克服了細(xì)胞培養(yǎng)繁瑣而又非常專業(yè)細(xì)致的工作，可以在2小時(shí)內(nèi)確定檢測結(jié)果，完全可以在現(xiàn)場進(jìn)行，能同時(shí)反應(yīng)毒素水平與毒力特點(diǎn)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，乙酰膽堿主要存在于大腦皮層、紋狀體、海馬、丘腦等處，與學(xué)習(xí)記憶、感覺運(yùn)動(dòng)等神經(jīng)活動(dòng)有密切關(guān)系。而一氧化氮合酶是合成一氧化氮(N0)的關(guān)鍵酶，一氧化氮合酶主要存在于神經(jīng)吞噬細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞中。正常情況下，該兩種神經(jīng)遞質(zhì)含量比較穩(wěn)定，乙酰膽堿作為細(xì)胞外的信號(hào)分子，儲(chǔ)存于囊泡中，神經(jīng)活動(dòng)興奮期，Ca"進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生興奮釋放偶聯(lián)，使囊泡與突出前膜結(jié)合，胞裂釋放乙酰膽堿，釋放至突觸間隙的乙酰膽堿絕大部分被膽堿酯酶水解。而麻痹性毒素的作用會(huì)影響乙酰膽堿的信號(hào)傳導(dǎo)過程，使得乙酰膽堿無法釋放，導(dǎo)致含量的升高。對(duì)于一氧化氮合酶正常情況下機(jī)體很少表達(dá)，但麻痹性貝毒毒素可以誘導(dǎo)一氧化氮合酶的表達(dá)。神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿和一氧化氮合酶對(duì)麻痹性貝毒很高的靈敏度，在極低的麻痹性貝毒劑量和極短的暴露時(shí)間下，乙酰膽堿和一氧化氮合酶活力就出現(xiàn)了顯著的改變。說明麻痹性貝毒暴露下小鼠腦乙酰膽堿和一氧化氮合酶活力變化有一定的提前性。所以利用該技術(shù)既可用于定量表征麻痹性貝毒劑量-效應(yīng)(反應(yīng))關(guān)系，還可以早期檢測麻痹性貝毒毒性。隨著我國生活水平的提高，公眾對(duì)海產(chǎn)品的消費(fèi)日益增加，海產(chǎn)品貝類在養(yǎng)殖過程中容易受到赤潮毒素污染，且目前缺乏海產(chǎn)品的市場準(zhǔn)入機(jī)制。近年來在我國東海和南海曾多次發(fā)生以有毒亞歷山大藻為主要赤潮生物之一的大面積赤潮，嚴(yán)重危害海水養(yǎng)殖業(yè)和海岸環(huán)境。而本發(fā)明能夠提高麻痹性貝毒毒素檢測靈敏度和縮短檢測時(shí)間，可以保護(hù)公眾健康及海洋生態(tài)環(huán)境安全。目前全球赤潮藻毒素檢驗(yàn)市場規(guī)模超過320億美元，在我國海產(chǎn)品貝類中赤潮藻毒素的檢測還只能用小鼠測試法、高效液相色譜法、色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法來檢測某些毒素，耗時(shí)較長，且靈敏度較低。在國外免疫診斷試劑盒已初步用于分析不同類型的藻毒素，這種免疫測試的敏感性要比相應(yīng)的鼠生物測試法或HPLC方法敏感得多，但價(jià)格相當(dāng)昂貴如96孔直接ELISA試劑盒價(jià)格為275歐元，麻痹性貝毒毒素單樣檢測為18歐元。而本發(fā)明能夠快速現(xiàn)場檢測麻痹性貝毒毒素，與單樣毒素檢測價(jià)格相比至少減少5倍。具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。本發(fā)明實(shí)施例整個(gè)檢測過程從貝類送檢到最后得到結(jié)果不會(huì)超過2小時(shí)，極大縮短了檢測時(shí)間。本發(fā)明所需要的儀器設(shè)備為分光光度計(jì)、臺(tái)式低速離心機(jī)、水浴鍋、手術(shù)剪刀、濾紙、移液管、燒杯等，這些設(shè)備非常普通、價(jià)格便宜，而且完全可以進(jìn)行便攜式的組裝。本發(fā)明所需要的試劑為鹽酸、氫氧化鈉、生理鹽水、三羥甲基氨基甲垸、乙二胺四乙酸二鈉、蔗糖、蒸餾水、硫酸毒扁豆堿、三氯乙酸、三氯化鐵、無水磷酸二氫鈉等，這些試劑也是非常普通和常見的試劑，所需要的試劑也可以以試劑盒的形式進(jìn)行攜帶。所以本發(fā)明極大縮短了檢測時(shí)間，顯著降低了檢測成本，所需的人員技術(shù)水平不高，非常適合基層現(xiàn)場快速檢測，符合我國國清。實(shí)施例1樣品檢測液的制備貝類樣品采集后清洗外殼的附著物，將貝肉與殼分離，分別挑出消化腺與其它軟組織，經(jīng)溶漿機(jī)溶漿后溶于0.lmol/LHC1中，用NaOH調(diào)pH值至3_4，水浴加熱5分鐘，冷卻后取上清液離心，離心的上清即為樣品原液，原液用0.9%生理鹽水稀釋得到樣品檢測液。2小鼠暴露選擇健康的ICR(InstituteofCancerResearcch，美國癌癥研究所)品系成年小鼠，體重25g-30g，用體重劑量為1ug/kg和lOwg/kg檢測液對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。暴露15rnin后股動(dòng)脈取血處死，在冰盤內(nèi)迅速除去小鼠的腦顱骨，剝離硬腦膜，取出完整的腦組織。每組5只小鼠。3腦勻漿制作稱取Tris1.21g(0.Olmol)，EDTA-2Na37.23mg(0.OOOlmol)以及蔗糖3.42g(0.Olmol)。將Tris1.21g及EDTA-2Na37.23mg加水500ml溶解，再用20O鵬ol/LHC1進(jìn)行滴定至pH7.4，然后加3.42g蔗糖，再加水定容至1000ml。放入鹽水瓶中。以微波進(jìn)行消毒3min-5min，冷卻后放入冰箱備用。取小鼠腦組織塊(0.21.0g)，在冰凍的生理鹽水中漂洗，除去其上粘附的血液和血塊，濾紙拭干，稱重，然后放入510ml的小燒杯中。勻槳介質(zhì)的重量為組織塊重的9倍。用移液槍取總量為2/3的勻漿介質(zhì)于燒杯中，用眼科小剪盡快剪碎組織。將剪碎的組織迅速倒入玻璃勻漿管，再倒入剩余的1/3勻漿介質(zhì)，沖洗后一起倒入管中。左手持勻漿管將下端插入盛冰水混和物的燒杯或其它器皿中，右手將搗碎桿垂直插入套管中上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨數(shù)十次(35min)，使組織充分研碎勻漿化。勻漿以3000r/min4000r/min離心3min5min，取適量上清液進(jìn)行神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)測定。4乙酰膽堿測定(Ach)取組織勻漿0.8mL，加入1.4mL雙蒸水混合。加入0.2mL硫酸毒扁豆堿，緩慢滴加三氯乙酸0.8mL，充分混勻后離心(3000轉(zhuǎn)/min，2min)。分別取上清lmL于測定管和對(duì)照管中。另設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管與空白管，標(biāo)準(zhǔn)管加乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液O.lmL、雙蒸水0.65mL、三氯乙酸0.25mL;空白管加入雙蒸水0.75mL、三氯乙酸0.25mL。測定、標(biāo)準(zhǔn)、空白三管。顯色步驟操作相同加入堿性羥胺1.0mL，混勻，靜置5min;加入HC10.5mL，加入三氯化鐵0.5mL。對(duì)照管顯色步驟與上面順序相反。反應(yīng)15min，于600nm，lcm光徑比色，讀取吸光度值。組織勻漿中Ach含量計(jì)n^/t、測定管OD值-對(duì)照管OD值^j誕&非a旦^/,、AChW/m,t)=標(biāo)準(zhǔn)管。D值—空白管。D值x50x4+樣種蛋白曰里Ong/mD5—氧化氮合酶(NOS)測定測定步驟測定步驟見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>樣本(ml)A*試劑一底物緩沖液"2002001)試劑二促進(jìn)劑(u1)1010試劑三顯色劑(u1)100100混勻，37'C水浴反應(yīng)10min試劑四透明劑U1)100100試劑五終止液(ul)20002000最后，混勻，530nm處，lcm光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管的吸光度值。計(jì)算公式區(qū)(U/ml)=測定管OD—空白管OD反應(yīng)液總體積1Mnnn呈色物納摩爾消光系數(shù)取樣量比色光徑x反應(yīng)時(shí)間'6結(jié)果判斷所測結(jié)果采用公開軟件一SPSSll.0軟件進(jìn)行分析，均值間比較采用t檢驗(yàn)，偏方差分析，不同變量間的相關(guān)性分析采用偏相關(guān)分析。依據(jù)乙酰膽堿(Ach)含量和NOS活力水平，分析麻痹性貝毒含量，從而早期檢測其毒性。結(jié)果顯示乙酰膽堿含量和一氧化氮合酶活力均隨檢測液濃度的增加而上升，而且具有顯著性差異。當(dāng)麻痹性貝毒毒素含量在小鼠半數(shù)致死量濃度10yg/kg的1/10即1ug/kg時(shí)，乙酰膽堿含量和一氧化氮合酶活力也均表現(xiàn)出明顯的改變，而在此濃度暴露下15min時(shí)，小鼠沒有表現(xiàn)任何癥狀，與空白組相比從宏觀個(gè)體上沒有出現(xiàn)任何的差異，但腦中腦乙酰膽堿含量和一氧化氮合酶活力均表現(xiàn)出顯著變化，所以利用該生物標(biāo)志物能夠早期檢測麻痹性貝毒毒素含量，整個(gè)檢測時(shí)間從得到貝類到最后結(jié)果不會(huì)超過2個(gè)小時(shí)，所以可以利用本發(fā)明對(duì)麻痹性貝毒毒素進(jìn)行現(xiàn)場快速檢測。權(quán)利要求1、一種早期檢測麻痹性貝毒毒性的方法，其特征在于，將現(xiàn)場貝類樣品制作成檢測液，然后用檢測液腹腔注射小鼠，檢測小鼠腦中乙酰膽堿含量和一氧化氮合酶活力的變化，由乙酰膽堿含量和一氧化氮合酶活力水平得到麻痹性貝毒含量，從而早期檢測麻痹性貝毒毒性。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的早期檢測麻痹性貝毒毒性的方法，其特征是，包括以下步驟(1)制備樣品檢測液貝類樣品采集處理后，溶于HC1中得樣品原液，原液用生理鹽水稀釋得到樣品檢測液；(2)小鼠暴露選擇健康的美國癌癥研究所品系成年小鼠，用檢測液對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，取材；(3)腦勻漿制備取注射后小鼠的腦組織碎塊放入勻漿介質(zhì)中進(jìn)行勻漿；(4)測定乙酰膽堿含量乙酰膽堿和堿性鹽酸羥胺反應(yīng)生成乙酰羥胺酸，產(chǎn)物在酸性條件下與三氯化鐵形成棕黃色化合物，于波長540nm處測其吸光度；(5)測定一氧化氮合酶活力一氧化氮合酶催化左旋精氨酸和分子氧反應(yīng)生成一氧化氮，一氧化氮與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在波長530nm處測定其吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算出一氧化氮合酶活力；(6)結(jié)果判斷依據(jù)乙酰膽堿含量和一氧化氮合酶活力水平，得到麻痹性貝毒含量，從而早期檢測其毒性。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的早期檢測麻痹性貝毒毒性的方法，其特征是，步驟(1)中，所述的HC1，其濃度為0.lmol/L。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的早期檢測麻痹性貝毒毒性的方法，其特征是，步驟(2)中，所述小鼠暴露，其時(shí)間為15min。5、根據(jù)權(quán)利要求2所述的早期檢測麻痹性貝毒毒性的方法，其特征是，步驟(3)中，所述的勻漿介質(zhì)是由三羥甲基胺基甲垸、乙二胺四乙酸二鈉、蔗糖配置而成，三羥甲基胺基甲垸、乙二胺四乙酸二鈉、蔗糖摩爾比為100:1:100。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述的早期檢測麻痹性貝毒毒性的方法，其特征是，所述的勻漿介質(zhì)，其配置方法為將三羥甲基胺基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉用水溶解，再用20Ommol/LHC1進(jìn)行滴定至pH偏弱堿性，然后加蔗糖，以微波進(jìn)行消毒，冷卻后放入冰箱備用。全文摘要本發(fā)明公開了一種生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
的早期檢測麻痹性貝毒毒性的方法，將現(xiàn)場貝類樣品制作成檢測液，然后用檢測液腹腔注射小鼠，檢測小鼠腦中乙酰膽堿含量和一氧化氮合酶活力的變化，由乙酰膽堿含量和一氧化氮合酶活力水平得到麻痹性貝毒含量，從而早期檢測麻痹性貝毒毒性。本發(fā)明解決麻痹性貝毒現(xiàn)場、快速、大批量樣品的檢測分析及毒性早期檢測問題，比目前國內(nèi)常用的小鼠法相比時(shí)間提前2-10倍，且個(gè)體沒有出現(xiàn)任何癥狀，適于現(xiàn)場快速、大批量樣品的檢測分析及毒性早期檢測。本發(fā)明僅需檢測普通生化指標(biāo)的改變，操作簡單方便，適合現(xiàn)場和基層檢測部門推廣使用。文檔編號(hào)G01N33/50GK101196517SQ20071017215公開日2008年6月11日申請(qǐng)日期2007年12月13日優(yōu)先權(quán)日2007年12月13日發(fā)明者仵彥卿,劉元嫄,宋玉玲,張鑒達(dá),王文華,程金平申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)