專利名稱：微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物學(xué)、酶工程、發(fā)酵工程、生物化學(xué)等領(lǐng)域，具體涉及一種低溫生 淀粉糖化酶微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。該發(fā)明生產(chǎn)的低溫生淀粉糖化酶主要應(yīng)用于糧食加工、 食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡織工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)以及其它淀粉糖化酶應(yīng)用行業(yè)?？梢蕴岣咴系?利用率、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量。
背景技術(shù)：
生淀粉糖化酶是指能將不經(jīng)過(guò)蒸煮糊化的生淀粉直接水解成葡萄糖的酶類，其作 用特點(diǎn)是能夠?qū)⒌矸厶腔瘋鹘y(tǒng)工藝中的糊化、液化、糖化三步合并為一步(王歲樓，食品與 發(fā)酵工業(yè)，1988)。生淀粉糖化酶作為生物制劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于糧食加工、食品工業(yè)、釀 造、發(fā)酵、紡織工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)以及其它淀粉糖化酶應(yīng)用行業(yè)。國(guó)內(nèi)外對(duì)生淀粉糖化酶進(jìn)行 了大量的工作，目前應(yīng)用的生淀粉糖化酶主要為中溫和高溫生淀粉糖化酶，研究主要集中 在中溫生淀粉糖化酶高效菌株選育、發(fā)酵條件優(yōu)化等(Haiyan Sun, et al. Appl Biochem Biotechnol，2009)。有關(guān)低溫生淀粉糖化酶的研究及其產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用還未見(jiàn) 報(bào)道。低溫生淀粉糖化酶與高溫、中溫生淀粉糖化酶相比具有很大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榈蜏?生淀粉糖化酶在低溫條件下具有高酶活力及高催化效率；可減少加工工藝，縮短加工過(guò)程 的時(shí)間并省卻昂貴的加熱或冷卻費(fèi)用；在節(jié)能方面有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)；經(jīng)過(guò)溫和的熱處理可 使低溫酶的活力喪失；低溫或適溫處理有助于提高產(chǎn)品品質(zhì)和質(zhì)量(朱非等，微生物學(xué)報(bào)， 2002)，低溫生淀粉糖化酶上述特性有助于其推廣和應(yīng)用。低溫生淀粉糖化酶的應(yīng)用將對(duì)傳 統(tǒng)的糧食加工、食品、釀造、發(fā)酵、紡織品、醫(yī)藥等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響，利用微生物發(fā)酵生 產(chǎn)的低溫生淀粉糖化酶，按原料重量0. 1%。 0. 5%。的量添加于生料發(fā)酵、食品加工和多孔 淀粉生產(chǎn)等領(lǐng)域中，在8 20°C處理0. 5 1. 5h，可以提高原料的轉(zhuǎn)化率13. 5% 22. 6%， 降低了生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量?？梢詮母旧蠑[脫中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備 和工藝。低溫生淀粉糖化酶將為人類擺脫發(fā)展中所面臨的資源、能源危機(jī)以及環(huán)境污染等 問(wèn)題提供現(xiàn)實(shí)的機(jī)遇。低溫生淀粉糖化酶具有非常廣闊的開(kāi)發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶的方法，該方法主要 是微生物經(jīng)過(guò)低溫馴化后，在14 20°C液體發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶的方法，這種生產(chǎn) 方法獲得的低溫生淀粉糖化酶粗酶液活性可以達(dá)到140U/mL，如再經(jīng)過(guò)分離和純化，可以得 到不同濃度和純度的酶制劑。當(dāng)該酶制劑活性為1000U/mL或1000U/g，0. 1%。 0. 5%。的量 應(yīng)用于生料發(fā)酵、食品加工和多孔淀粉生產(chǎn)等領(lǐng)域中，在8 20°C處理0. 5 1.證，可以提 高原料的轉(zhuǎn)化率13. 5% 22.6%。該酶制劑應(yīng)用操作簡(jiǎn)單、方便、快捷、成本低。可以從根 本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設(shè)備和工藝。本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶的方法具體包括以下步 驟
(1)將產(chǎn)生生淀粉糖化酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌在14 20°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)， 制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(3)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基 中，在14 20°C培養(yǎng)72 144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶結(jié)束；(4)將(3)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(5)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化， 制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。本發(fā)明中使用的菌種來(lái)源于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生長(zhǎng)條件按菌種保藏單位提供的說(shuō)明進(jìn)行。生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌(例 如，CGMCC菌種編號(hào):1. 2323τ或1. 447或1. 504或3. 2790等)，菌株先活化，再經(jīng)過(guò)逐級(jí)低 溫馴化，進(jìn)行低溫生淀粉糖化酶發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)按本發(fā)明方法進(jìn)行培養(yǎng)。低溫馴化后的菌株斜 面在4°C環(huán)境中可保存2個(gè)月，用25 45%甘油制成的菌懸液在零下80°C條件下可以長(zhǎng)期 保藏。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一(1)、培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
1.0L, pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基生淀粉0. 5 5. 0g，蛋白胨0. 1 2. 0g，牛肉膏0. 1
2.0g, NH4NO3O. 5 5. 0g, K2HPO4O. 5 5. 0g, MgSO4. 7Η20 0. 1 2. 0g, FeSO4. 7Η20 0. 01 0. 5g，KCl 0. 1 2. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。其 中生淀粉在105°C下干熱滅菌2h，然后在常溫下無(wú)菌操作加入。③液體種子培養(yǎng)基蛋白胨5. 0 20. Og,酵母膏5. 0 20. Og,葡萄糖0. 5 2. 0g, K2HPO4L 0 5. Og,自來(lái)水1. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產(chǎn)酶培養(yǎng)基玉米生淀粉30. 0 100. 0g，牛肉膏10. 0 20. 0g，NaCl 3. 0 5. 0g，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0. 01 0. 2g, K2HP043. 0 5. 0g，MgSO4 · 7Η20 0· 2 2. 0g,自來(lái)水 1. 0L, pH值6. 0,121°C高壓蒸氣滅菌30min。其中生玉米淀粉在105°C下干熱滅菌池，然后在常溫 下無(wú)菌操作加入。(2)將產(chǎn)生生淀粉糖化酶的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC) 提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌在14 16°C培養(yǎng)48 72h， 按5%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將(4)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積3 5%的接種量接入10L的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在14 16°C培養(yǎng)120 144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化， 制備成不同活性、純度和劑型的低溫生淀粉糖化酶制劑。實(shí)施例二 (1)、培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
1.0L, pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基生淀粉0. 5 5. 0g，蛋白胨0. 1 2. 0g，牛肉膏0. 1
2.0g, NH4NO3O. 5 5. 0g, K2HPO4O. 5 5. 0g, MgSO4. 7Η20 0. 1 2. 0g, FeSO4. 7Η20 0. 01
0.5g，KCl 0. 1 2. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。其 中生淀粉在105°C下干熱滅菌2h，然后在常溫下無(wú)菌操作加入。③液體種子培養(yǎng)基蛋白胨5. 0 20. Og,酵母膏5. 0 20. Og,葡萄糖0. 5 2. 0g, K2HPO4L 0 5. Og,自來(lái)水1. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產(chǎn)酶培養(yǎng)基玉米生淀粉30. 0 100. 0g，牛肉膏10. 0 20. 0g，NaCl 3. 0 5. 0g，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0. 01 0. 2g, K2HP043. 0 5. 0g，MgSO4 · 7Η20 0· 2 2. 0g,自來(lái)水 1. 0L, pH值6. 0,121°C高壓蒸氣滅菌30min。其中生玉米淀粉在105°C下干熱滅菌池，然后在常溫 下無(wú)菌操作加入。(2)將產(chǎn)生生淀粉糖化酶的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC) 提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌在16 18°C培養(yǎng)48 72h， 按5%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將(4)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積5 7%的接種量接入50L的產(chǎn)酶培養(yǎng) 基中，在16 18°C培養(yǎng)96 120h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化， 制備成不同活性、純度和劑型的低溫生淀粉糖化酶制劑。實(shí)施例三(1)、培養(yǎng)基制備①菌種活化培養(yǎng)基蛋白胨10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
1.0L, pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養(yǎng)基生淀粉0. 5 5. 0g，蛋白胨0. 1 2. 0g，牛肉膏0. 1
2.0g, NH4NO3O. 5 5. 0g, K2HPO4O. 5 5. 0g, MgSO4. 7Η20 0. 1 2. 0g, FeSO4. 7Η20 0. 01 0. 5g，KCl 0. 1 2. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。其 中生淀粉在105°C下干熱滅菌2h，然后在常溫下無(wú)菌操作加入。
③液體種子培養(yǎng)基蛋白胨5. 0 20. Og,酵母膏5. 0 20. Og,葡萄糖0. 5 2. 0g, K2HPO4L 0 5. Og,自來(lái)水1. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產(chǎn)酶培養(yǎng)基玉米生淀粉30. 0 100. 0g，牛肉膏10. 0 20. 0g，NaCl 3. 0 5. 0g，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0. 01 0. 2g, K2HP043. 0 5. 0g，MgSO4 · 7Η20 0· 2 2. Og,自來(lái)水 1. 0L, pH值6. 0,121°C高壓蒸氣滅菌30min。其中生玉米淀粉在105°C下干熱滅菌池，然后在常溫 下無(wú)菌操作加入。(2)將產(chǎn)生生淀粉糖化酶的菌種，按中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC) 提供的菌株說(shuō)明進(jìn)行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(4)按常規(guī)方法將低溫馴化后的生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌在18 20°C培養(yǎng)48 72h， 按5%的接種量進(jìn)行逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(5)將(4)制備的二級(jí)種子按發(fā)酵液體積7 9%的接種量接入100L的產(chǎn)酶培養(yǎng) 基中，在18 20°C培養(yǎng)72 96h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶結(jié)束；(6)將(5)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(6)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化， 制備成不同活性、純度和劑型的低溫生淀粉糖化酶制劑。實(shí)施例四按實(shí)施例一、二和三方法生產(chǎn)的低溫生淀粉糖化酶制劑，平均酶活性為1000U/mL， 將活性為1000U/mL或1000U/g的低溫生淀粉糖化酶制劑，按原料重量0. 1%。 0. 5%。的量 添加于生料發(fā)酵、食品加工和多孔淀粉生產(chǎn)等領(lǐng)域中，在8 20°C處理0. 5 1.證，可以提 高原料的利用率、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，改善并提高產(chǎn)品質(zhì)量。低溫生淀粉糖化 酶應(yīng)用部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表。
權(quán)利要求
1.一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶的方法，其包括以下步驟(1)將產(chǎn)生生淀粉糖化酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；(2)按常規(guī)方法將低溫馴化后的生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌在14 20°C逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，制備 成液體一級(jí)種子和二級(jí)種子；(3)將液體一級(jí)種子或二級(jí)種子，按發(fā)酵液體積的3 9%接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在14 20°C培養(yǎng)72 144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶結(jié)束；(4)將(3)的發(fā)酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(5)根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將(4)得到的粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備 成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中菌種低溫馴化培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基、產(chǎn)酶培養(yǎng) 基分別為(1)菌種低溫馴化培養(yǎng)基生淀粉0.5 5.0g，蛋白胨0. 1 2. 0g，牛肉膏0. 1 2. Og, NH4NO3 0. 5 5. 0g，K2HPO4 0. 5 5. 0g，MgSO4. 7Η20 0· 1 2. 0g，F(xiàn)eSO4. 7H20 0· 01 0. 5g, KCl 0. 1 2.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。其中生 淀粉在105°C下干熱滅菌池，然后在常溫下無(wú)菌操作加入。(2)液體種子培養(yǎng)基蛋白胨5.0 20. Og,酵母膏5. 0 20. Og,葡萄糖0. 5 2. Og, K2HPO4 1.0 5.0g，自來(lái)水1.0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。(3)產(chǎn)酶培養(yǎng)基玉米生淀粉30.0 100. 0g，牛肉膏10. 0 20. 0g, NaCl 3. 0 5. Og, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 2g, K2HPO4 3. 0 5. 0g, MgSO4 · 7Η20 0. 2 2. Og,自來(lái)水 1. 0L, pH 值6. 0,121°C高壓蒸氣滅菌30min。其中生玉米淀粉在105°C下干熱滅菌池，然后在常溫下 無(wú)菌操作加入。
全文摘要
本發(fā)明所述的一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶的方法是將產(chǎn)生生淀粉糖化酶的微生物逐級(jí)低溫馴化，使其在低溫環(huán)境中生長(zhǎng)良好；將低溫馴化后的生淀粉糖化酶產(chǎn)生菌在14～20℃逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，按發(fā)酵液體積的3～9％接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在14～20℃培養(yǎng)72～144h時(shí)，即微生物發(fā)酵生產(chǎn)低溫生淀粉糖化酶結(jié)束；發(fā)酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據(jù)不同需要和使用對(duì)象不同，將粗酶液進(jìn)一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號(hào)C12N9/24GK102093989SQ201010162658
公開(kāi)日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者馮旭明, 孫子羽, 張慶芳, 遲乃玉 申請(qǐng)人:大連大學(xué)