用于高密度葡萄糖漿的淀粉液化和糖化的單pH工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的實(shí)施例涉及在所述糖化步驟之前，在不進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的情況下由含淀粉的底物制備下游產(chǎn)品的工藝，所述下游產(chǎn)品為例如高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發(fā)酵原料。所述糖化由葡糖淀粉酶在5.2至5.6范圍內(nèi)的pH下有效地催化。
【專利說明】用于高密度葡萄糖漿的淀粉液化和糖化的單pH工藝
[0001]優(yōu)先權(quán)
[0002]本專利申請要求提交于2011年4月29日的美國臨時(shí)申請序列號61/481，084的優(yōu)先權(quán)，該臨時(shí)申請據(jù)此全文以引用方式并入本文。
[0003]序列表
[0004]附件是包括SEQ ID NO:1_3的序列表，其以引用方式整體并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005]一種用于由含淀粉材料(如谷物)制備下游產(chǎn)品(例如高密度葡萄糖漿和發(fā)酵原料)的方法，該方法無需在液化和糖化之間進(jìn)行PH調(diào)節(jié)。
[0006]發(fā)明背景
[0007]通常，葡萄糖可以是淀粉加工的產(chǎn)物，淀粉加工可以是催化淀粉降解的、涉及液化和糖化的兩步酶促過程。在液化過程中，不溶性顆粒淀粉通常在水中調(diào)成漿液，經(jīng)加熱糊化，并被熱穩(wěn)定性α-淀粉酶水解。目前在大多數(shù)商業(yè)液化過程中使用的α-淀粉酶在ρΗ4.8至ρΗ5.2的酸性水平下不穩(wěn)定，因此使用合適的堿(如，氫氧化鈉或氫氧化鈣、碳酸鈉或氨水)將漿料的PH調(diào)節(jié)至約 pH5.6至6.0。因此，通常在約5.6至6.0的pH下進(jìn)行液化。
[0008]在糖化期間，進(jìn)一步通過葡糖淀粉酶水解液化過程中制備的可溶性糊精以生成糖。葡糖淀粉酶為外切作用糖酶，能夠水解淀粉(如直鏈淀粉和支鏈淀粉)的直鏈和支鏈糖苷鍵。市售的葡糖淀粉酶通常具有在酸性PH范圍內(nèi)(低于5.0)的最適pH。因此，通常使用例如稀酸(如，硫酸)將液化物的pH調(diào)節(jié)至在約4.2-4.5范圍內(nèi)的酸性pH，以執(zhí)行糖化。因此，目前用于獲得所需終產(chǎn)物(例如高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發(fā)酵原料)的液化和糖化過程在不同的pH水平下執(zhí)行?？砂l(fā)酵糖，例如低分子糖如葡萄糖，然后可通過其他酶(如葡萄糖異構(gòu)酶)轉(zhuǎn)化為果糖；可進(jìn)行結(jié)晶；或者可用于發(fā)酵以生產(chǎn)多種終產(chǎn)物(如醇、谷氨酸一鈉、琥珀酸、維生素、氨基酸、1，3-丙二醇和乳酸)。
[0009]由于在液化之后和糖化之前必須調(diào)節(jié)pH水平，因此，目前可用的處理含淀粉材料的方法需要使用額外的化學(xué)品，這增加了生產(chǎn)成本。在液化步驟之后需要的用于為糖化提供合適條件的PH調(diào)節(jié)也可導(dǎo)致反應(yīng)介質(zhì)中出現(xiàn)高鹽積聚和高硫含量，從而產(chǎn)生環(huán)境處理問題。因此，存在對這樣一種制備終產(chǎn)物(例如高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發(fā)酵原料)的方法的需要，所述方法在商業(yè)上不必以不同的PH水平執(zhí)行液化和糖化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]提供了一種通過單pH工藝來制備高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發(fā)酵原料的方法，其不必在液化之后和糖化之前調(diào)節(jié)pH。該方法利用了某些葡糖淀粉酶的區(qū)分性質(zhì)。葡糖淀粉酶例如灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)及其變體具有高于已知葡糖淀粉酶(GA)的最適pH,所述已知葡糖淀粉酶(GA)為例如得自黑曲霉(Aspergillus niger)的GA(AnGA)和得自埃默森籃狀菌(Talaromyces emersonii)的GA(TeGA)。因此,本發(fā)明方法所用的葡糖淀粉酶能夠有效地在5.2-5.6范圍內(nèi)的pH和約58°C至約62°C范圍內(nèi)的溫度下糖化淀粉底物以制備高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發(fā)酵原料。HgGA葡糖淀粉酶的該性質(zhì)使其可用于淀粉液化和糖化的單PH工藝以制備高密度葡萄糖漿和高葡萄糖發(fā)酵原料。本發(fā)明所公開的方法還可將葡糖淀粉酶與支鏈淀粉酶結(jié)合以提高過程效率。
[0011]在一個(gè)方面，葡糖淀粉酶選自包含SEQ ID NO:3的親本灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶(HgGA)及其變體，其中所述變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%同一性。在另一方面，與親本葡糖淀粉酶相比，葡糖淀粉酶具有一個(gè)氨基酸修飾。在又一方面，葡糖淀粉酶為具有SEQ ID NO:3氨基酸序列的HgGA。任選地,葡糖淀粉酶在里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。
[0012]在一個(gè)實(shí)施例中，葡糖淀粉酶以至少約0.15GAU/克干物質(zhì)淀粉或至少約0.20GAU/克干物質(zhì)淀粉的劑量添加。
[0013]在一個(gè)方面，糖化在pH5.35至5.5下執(zhí)行。在另一方面,糖化所用的淀粉底物為液化淀粉。在又一方面，糖化在約70小時(shí)獲得至少95%的DPl濃度。
[0014]在一個(gè)實(shí)施例中，淀粉底物為約30%至約50%、或約30%至約35%干固體(DS)。
[0015]在另一方面，淀粉底物為顆粒淀粉，糖化在約28小時(shí)獲得至少95%的DPl濃度，并且淀粉底物的淀粉溶解度為至少90%。
[0016]在一個(gè)實(shí)施例中，糖化在約50小時(shí)獲得至少96%的DPl濃度，并且淀粉底物的淀粉溶解度為至少97%。
[0017]另外，高級糖 的含量可低于I %。此外，淀粉底物可為約28%干固體(DS)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]將附圖并入本說明書中，提供多個(gè)實(shí)施例的非限制性例證。在附圖中:
[0019]圖1示出了糖化期間累積的葡萄糖(DPI)濃度的時(shí)間進(jìn)程。使用以0.18葡糖淀粉酶單位(GAU) /克干物質(zhì)淀粉的劑量添加的HgGA執(zhí)行單pH糖化，如實(shí)例I和表1中所述。
[0020]圖2示出了單ρΗ(α-活性)糖化過程期間累積的DPl濃度的時(shí)間進(jìn)程。使用如實(shí)例2和表2 (燒瓶1-4)中所述的酶濃度并在其描述的條件下，使用HgGA或在存在支鏈淀粉酶的情況下使用HgGA執(zhí)行所述糖化。
[0021]圖3示出了糖化過程期間累積的DPl濃度的時(shí)間進(jìn)程，其中α -淀粉酶通過在糖化之前將液化物pH降至低于4.0而失活(α -滅活)。使用實(shí)例2和表2 (燒瓶5-8)中所述的酶濃度并在其描述的條件下，使用HgGA或在存在支鏈淀粉酶的情況下使用HgGA執(zhí)行所述糖化。
【具體實(shí)施方式】
[0022]本發(fā)明涉及葡糖淀粉酶，該葡糖淀粉酶能夠在介于約5.2-5.6之間的pH下有效地使淀粉底物糖化，而不必在液化步驟之后調(diào)節(jié)pH。
[0023]在一些方面，本發(fā)明的實(shí)施例依賴于遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域中使用的常規(guī)技術(shù)和方法。以下資料包括對可根據(jù)本發(fā)明使用的一般方法學(xué)的描述=SambiOOk等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)(第 2 版，1989 年)；Kreigler,《基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)指南》(GENE TRANSFER AND EXPRES SION ；A LABORATORYMANUAL)，1990年；以及Ausubel等人編輯，《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊》(CURRENT PROTOCOLSIN MOLE⑶LAR BIOLOGY) (1994年)。除非本文另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。以下文獻(xiàn)向技術(shù)人員提供本發(fā)明所使用的許多術(shù)語的通用詞典:Singleton等人，《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典》(DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)，第 2 版，約翰威立父子出版公司，紐約(John Wiley and Sons, New York), 1994 年；以及 Hale & Markham,《哈普克林生物學(xué)詞典》(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY), Harper Perennial 出版社，紐約(Harper Perennial,N.Y.), 1991年。本文描述了代表性的方法和材料，但任何與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于實(shí)施或測試本發(fā)明。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)值。本文提供的標(biāo)題并非對各個(gè)方面或?qū)嵤├南拗?，這些方面或?qū)嵤├梢酝ㄟ^參閱本說明書全文而獲得。
[0024]1.定義和縮寫
[0025]根據(jù)此詳細(xì)描述，應(yīng)用下面的縮寫和定義。應(yīng)該指出的是，如本文所使用，除非上下文另有明確指明，否則單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括多個(gè)指代物。因此，例如，提及“一種酶”則包括多個(gè)這種酶。
[0026]1.1.定義
[0027]本文所用的“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白質(zhì)”同義。在一些情況中，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義；在一些情況中，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“酶”同義。
[0028]本文所用的“核苷酸序列”或“核酸序列”指基因組來源、合成來源或重組來源的序列，且不論代表正義鏈還 是反義鏈都可以是雙鏈的或單鏈的。如本文所用，術(shù)語“核酸”可以指基因組DNA、cDNA、合成DNA或RNA。核酸的殘基可含有本領(lǐng)域中通常已知和使用的任何化學(xué)修飾。
[0029]“分離的”意指該材料至少基本上不含有至少一種與其天然相關(guān)且天然存在的其他組分。
[0030]“純化的”意指該材料處于相對純的狀態(tài)，例如至少約90%純的、至少約95%純的或至少約98%純的。
[0031]“寡糖”意指由3-20個(gè)單糖構(gòu)成的碳水化合物分子。
[0032]如本文所用，“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括已通過使用重組DNA技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。通常通過向細(xì)胞插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列而進(jìn)行轉(zhuǎn)化。所插入的核苷酸序列可以是異源核苷酸序列，即這樣的序列，其對于待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞而言可以是并非天然的，例如融合蛋白。
[0033]如本文所用，“淀粉”指由植物的復(fù)雜多糖碳水化合物構(gòu)成的任何材料，由具有式(C6HltlO5)x(其中“X”可以是任何數(shù)字)的直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成。具體地講，該術(shù)語指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、塊莖和根，更具體地講，指小麥、大麥、玉米、黑麥、稻米、高粱、糠、木薯、小米、馬鈴薯、甘薯和木薯粉。
[0034]如本文所用，“顆粒淀粉”指未經(jīng)過糊化的未蒸煮過(生)的淀粉。
[0035]如本文所用，“淀粉糊化”意指使淀粉分子增溶形成粘性懸浮液。
[0036]如本文所用，“糊化溫度”指淀粉底物發(fā)生糊化時(shí)的最低溫度。確切溫度取決于具體的淀粉底物，還可取決于淀粉得自的植物物種的特定品種和生長條件。[0037]“DE”或“葡萄糖當(dāng)量”為用于度量總還原糖的濃度的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算為已轉(zhuǎn)化為還原糖的總固形物的百分?jǐn)?shù)。尚未被水解的顆粒淀粉的DE為約零(O)，而D-葡萄糖的DE為約 100。
[0038]如本文所用，“淀粉底物”指使用精制淀粉、全磨谷?；蚍旨壍墓攘５念w粒淀粉或液化淀粉。
[0039]如本文所用，“液化淀粉”指已經(jīng)歷過增溶處理，例如常規(guī)的淀粉液化處理的淀粉。
[0040]“聚合度(DP) ”是指給定糖中脫水吡喃葡萄糖單位的數(shù)目(η)。DPl的實(shí)例是單糖，如葡萄糖和果糖。DP2的實(shí)例是二糖，如麥芽糖和蔗糖。DP4+( > DP4)表示聚合度大于4的聚合物。
[0041]本文所用的“可發(fā)酵糖”指能夠在發(fā)酵條件下被代謝的糖類。這些糖類通常指葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖(DP1、DP2和DP3)。
[0042]如本文所用，“總糖含量”是指淀粉組合物中存在的總糖含量。
[0043]如本文所用，“ds”是指溶液中溶解的固形物。
[0044]如本文所用，“淀粉液化酶”是指催化顆粒淀粉的水解或分解的酶。示例性的淀粉液化酶包括α -淀粉酶(EC3.2.1.1)。
[0045]除了其他方面，“淀粉酶”意指能夠催化淀粉降解的酶。
[0046]“ α -淀粉 酶(EC3.2.1.1) ”是指以隨機(jī)方式裂解淀粉分子內(nèi)部的a-D-(l — 4)0-糖苷鍵的內(nèi)切作用酶。相反，外切作用淀粉分解酶如淀粉酶(EC3.2.1.2 ；a -D-(I — 4)-葡聚糖麥芽糖水解酶)和一些產(chǎn)物特異性淀粉酶如產(chǎn)麥芽糖α -淀粉酶(EC3.2.1.133)從底物的非還原端切割淀粉分子。這些酶也被描述成在含有1，4-α-連接的D-葡萄糖單位的多糖中實(shí)現(xiàn)1，4-α -D-糖苷鍵的外切水解或內(nèi)切水解的酶。用于描述這些酶的另一術(shù)語是糖原酶。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。
[0047]如本文所用，“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡糖苷酶類的酶(EC3.2.1.3，葡糖淀粉酶，a -1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。這些酶是從直鏈淀粉和/或支鏈淀粉分子的非還原端釋放葡萄糖殘基的外切作用酶。這些酶也能夠水解α-1，6和α-1，3鍵，但是水解速率要比α-1，4鍵的水解慢得多。
[0048]本文所用的“最高活性”指在最有利的條件下例如在最佳pH下測量的酶活性。本文所用的“最佳pH”指在其他條件相等的情況下酶表現(xiàn)出最高活性時(shí)的pH值。
[0049]詞語蛋白質(zhì)或多肽的“成熟形式”指該蛋白質(zhì)或多肽的最終功能形式。葡糖淀粉酶的成熟形式可例如缺乏信號肽和/或起始甲硫氨酸。葡糖淀粉酶的成熟形式可從其天然宿主例如通過內(nèi)源表達(dá)來產(chǎn)生?；蛘?葡糖淀粉酶的成熟形式可從其非天然宿主例如通過外源表達(dá)來產(chǎn)生。外源表達(dá)的葡糖淀粉酶與內(nèi)源表達(dá)的對等物相比可具有改變的糖基化模式。
[0050]術(shù)語“親本”或“親本序列”指天然的或自然存在的序列。
[0051]本文所用的術(shù)語“變體”用來指與親本葡糖淀粉酶序列具有一定程度的氨基酸序列同一性的葡糖淀粉酶。變體與親本序列相似，但在其氨基酸序列中具有至少一個(gè)使其在序列上與親本葡糖淀粉酶不同的置換、缺失或插入。在一些情況中，變體經(jīng)過了操縱和/或工程改造以在其氨基酸序列中包括至少一個(gè)使其在序列上與親本不同的置換、缺失或插入。另外，葡糖淀粉酶變體可保留親本葡糖淀粉酶的功能特性，例如保持的葡糖淀粉酶活性達(dá)親本葡糖淀粉酶活性的至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、98 %或99 %。
[0052]如本文所用，“淀粉的水解”是指加入水分子時(shí)糖苷鍵裂解。
[0053]本文所用的“終產(chǎn)品”或“期望的終產(chǎn)品”指酶和/或微生物將淀粉底物轉(zhuǎn)化成的分子或化合物。
[0054]本文所用的“接觸”或“混合”指將相應(yīng)的酶設(shè)置成與相應(yīng)的底物充分靠近，使得該酶能夠?qū)⒃摰孜镛D(zhuǎn)化為終產(chǎn)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到將酶溶液與相應(yīng)底物混合可實(shí)現(xiàn)接觸或混合。
[0055]1.2.縮寫
[0056]除非另有指明，否則應(yīng)用下述縮寫:
[0057]AAα -淀粉酶
[0058]AmyE枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis) α -淀粉酶
[0059]AnGA黑曲霉葡糖淀粉酶
[0060]cDNA互補(bǔ) DNA
[0061]DE葡萄糖當(dāng)量
[0062]DNA脫氧 核糖核酸
[0063]DP3具有三個(gè)亞單位的聚合度
[0064]DPn具有η個(gè)亞單位的聚合度
[0065]DS或ds干固體
[0066]dss干固體淀粉
[0067]EC進(jìn)行酶分類的酶學(xué)委員會(huì)
[0068]g克
[0069]GAU葡糖淀粉酶單位
[0070]H-GA灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶
[0071]HgGA灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶
[0072]HPLC高壓液相色譜法
[0073]MOPS3- (N-嗎啉代)丙磺酸
[0074]PEG聚乙二醇
[0075]RNA核糖核酸
[0076]RO反滲透
[0077]TeGA埃默森籃狀菌葡糖淀粉酶
[0078]TrGA里氏木霉葡糖淀粉酶
[0079]μ m微米
[0080]2.淀粉加工中的酶
[0081]2.1.葡糖淀粉酶
[0082]2.1.1.具有期望的PH譜的葡糖淀粉酶
[0083]葡糖淀粉酶由細(xì)菌、真菌、酵母和植物的許多菌株(株系)產(chǎn)生。許多真菌葡糖淀粉酶是胞外產(chǎn)生的真菌酶，例如來自以下各屬的菌株:曲霉屬(Aspergillus) (Svensson等人，《嘉士伯研究通訊》(Carlsberg Res.Commun.)，第 48 卷，第 529-544 頁，1983 年；Boel等人，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBO J.)，第3卷，第1097-1102頁，1984年；Hayashida等人，《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》(Agric.Biol.Chem.)，第53卷，第923-929頁，1989年；美國專利 N0.5，024，941 ;美國專利 N0.4，794，175 和 W088/09795);籃狀菌屬(Talaromyces)(美國專利N0.4，247，637 ;美國專利N0.6，255，084 ;和美國專利N0.6，620，924)；根霉屬(Rhizopus) (Ashikari 等人,《農(nóng)業(yè)生物化學(xué)》(Agric.Biol.Chem.)，第 50 卷，第 957-964 頁，1986年；Ashikari等人，《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》(App.Microbi0.Biotech.),第32卷，第 129-133 頁，1989 年;和美國專利 N0.4，863，864);腐質(zhì)霉屬(Humicola) (W005/052148 和美國專利N0.4, 618, 579)；以及毛霉屬(Mucor) (Houghton-Larsen等人，《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》(App1.Microbiol.Biotechnol.)，第 62 卷，第 210-217 頁，2003 年)。許多編碼這些酶的基因已被克隆并在酵母、真菌和/或者細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)。
[0084]在商業(yè)上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，已被用于許多需要水解淀粉(例如用于從淀粉產(chǎn)生葡萄糖和其他單糖)的應(yīng)用中。葡糖淀粉酶被用來生產(chǎn)高果糖玉米甜味劑，其占美國甜味劑市場的50%以上。一般而言，葡糖淀粉酶可以并且通常與α-淀粉酶一起在淀粉水解過程中使用，以將淀粉水解成糊精，然后水解成葡萄糖。然后葡萄糖可通過其他酶(如，葡萄糖異構(gòu)酶)轉(zhuǎn)化為果糖；可進(jìn)行結(jié)晶；或者可用于發(fā)酵以生產(chǎn)各種各樣的終產(chǎn)物(如乙醇、檸檬酸、琥珀酸、抗壞血酸中間體、谷氨酸、甘油、1，3-丙二醇和乳酸)。
[0085]本發(fā)明的實(shí)施例采用了能夠在某pH下(例如在5.2和5.6之間)有效糖化淀粉底物的葡糖淀粉酶。具有所需PH譜的葡糖淀粉酶包括(但不限于)灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶(HgGA)。
[0086]HgGA可以是包含SEQ ID NO:3氨基酸序列的葡糖淀粉酶，其在美國專利N0.4，618，579和N0.7，262，041中進(jìn)行了詳細(xì)描述。這個(gè)HgGA還被描述為顆粒淀粉水解酶(GSHE)，因?yàn)樗軌蛩忸w粒形式的淀粉。編碼來自灰腐質(zhì)霉高溫變種(Humicola griseavar.thermoidea)的HgGA的基因組序列以SEQ ID NO:1示出，其含有三個(gè)推定的內(nèi)含子(位置233-307、752-81 7和950-1006)。來自灰腐質(zhì)霉高溫變種的天然HgGA具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其包括含有30個(gè)氨基酸殘基的信號肽(SEQ ID NO:2的位置I至30)。切割信號肽即得到具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的成熟HgGA。本發(fā)明的實(shí)施例還包括從木霉屬(Trichoderma)宿主細(xì)胞例如里氏木霉細(xì)胞產(chǎn)生的HgGA。參見美國專利N0.7，262，041。
[0087]2.1.2.結(jié)構(gòu)和功能
[0088]本發(fā)明實(shí)施例的葡糖淀粉酶也可以是HgGA的變體。變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%序列同一性。任選地，該變體與親本葡糖淀粉酶的成熟形式相比具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)氨基酸修飾。在一個(gè)實(shí)施例中，葡糖淀粉酶是包含SEQ ID NO:3的親本HgGA的變體，其中所述變體與親本葡糖淀粉酶具有至少99%的同一性。該變體在
5.2-5.6范圍內(nèi)的pH下具有期望的pH譜和糖化淀粉底物的能力。在一些實(shí)施例中，該變體可具有其他改進(jìn)的性質(zhì)，例如改進(jìn)的熱穩(wěn)定性和改進(jìn)的特異性。
[0089]葡糖淀粉酶由多達(dá)三個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成:一個(gè)是在所有葡糖淀粉酶中結(jié)構(gòu)上保守的、大約450個(gè)殘基的催化域，通常接著是一個(gè)由30-80個(gè)殘基組成的接頭區(qū)域，該接頭區(qū)域連接到一個(gè)大約100個(gè)殘基的淀粉結(jié)合域。所有三個(gè)區(qū)域均完整的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的結(jié)構(gòu)被測定至1.8埃分辨率。參見W02009/048488和W02009/048487。采用測得的坐標(biāo)，將結(jié)構(gòu)與來自之前測定的泡盛曲霉(Aspergillus awamori)菌株XlOO的葡糖淀粉酶的催化域的坐標(biāo)(Aleshin, A.E.，Hoffman, C.，F(xiàn)irsov, L.M.和 Honzatko R.B.，“來自泡盛曲霉XlOO變種的葡糖淀粉酶的精修晶體結(jié)構(gòu)”(Refined crystal structuresof glucoamylase from Aspergillus awamori var.X100.),《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)，第238卷，第575-591頁，1994年)進(jìn)行比對。參見同上文獻(xiàn)。TrGA和泡盛曲霉葡糖淀粉酶的催化域的結(jié)構(gòu)重疊得非常緊密，可以基于這個(gè)結(jié)構(gòu)重合來鑒定對等的殘基。參見同上文獻(xiàn)。還認(rèn)為所有的葡糖淀粉酶都具有基本的結(jié)構(gòu)。參見同上文獻(xiàn)。
[0090]鑒于各種葡糖淀粉酶的公知的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，已成功產(chǎn)生和表征了具有改變的性質(zhì)的葡糖淀粉酶變體。所述變體與親本葡糖淀粉酶相比可表現(xiàn)出改善的性質(zhì)。改善的性質(zhì)可包括(但不限于)提高的熱穩(wěn)定性和提高的比活性。例如，W02009/067218中描述了制備和表征具有改變的性質(zhì)的TrGA變體的方法。已發(fā)現(xiàn)功能性TrGA變體具有一個(gè)或多個(gè)具體的序列修飾。例如，一些TrGA變體具有多個(gè)序列修飾。例如，W02009/067218公開了具有六個(gè)或更多個(gè)氨基酸修飾的TrGA變體。這些TrGA變體顯示了至少與親本TrGA —樣多的活性，并且在許多情況下，顯示了改善的性質(zhì)。預(yù)期HgGA中對應(yīng)殘基的改變將產(chǎn)生具有葡糖淀粉酶活性的變體。本發(fā)明方法中可用的葡糖淀粉酶變體可以在5.2至5.6范圍內(nèi)的PH下有效地水解淀粉。
[0091]2.1.3.葡糖淀粉酶的產(chǎn)生
[0092]適合于本發(fā)明的實(shí)施例的葡糖淀粉酶可用重組DNA技術(shù)在各種宿主細(xì)胞中產(chǎn)生。
[0093]在一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞和酵母細(xì)胞。術(shù)語宿主細(xì)胞包括用來產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的變體葡糖淀粉酶的細(xì)胞、所述細(xì)胞的子代和從所述細(xì)胞產(chǎn)生的原生質(zhì)體。在一些實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞，通常是絲狀真菌宿主細(xì)胞。術(shù)語“絲狀真菌”指真菌亞門的所有絲狀形式(參見Alexopoulos，C.J.，1962年，《真菌學(xué)概論》(INTRODUCTORY MYCOLOGY)，威利出版社，紐約(Wiley，New York))。這些真菌的特征是其營養(yǎng)菌絲體 的細(xì)胞壁由幾丁質(zhì)、纖維素和其他復(fù)合多糖構(gòu)成。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)上、生理學(xué)上和遺傳學(xué)上與酵母不同。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是通過菌絲伸長來進(jìn)行，并且碳分解代謝是專性好氧的。在本發(fā)明的實(shí)施例中，絲狀真菌親本細(xì)胞可以是以下各屬(但不限于以下各屬)的物種的細(xì)胞:木霉屬(例如里氏木霉(其為之前歸類為長梗木霉(T.1ongibrachiatum)的紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的無性形式)、綠色木霉(Trichoderma viride)、康寧木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)) (Sheir-Neirs等人，1984年，《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》(Appl.Microbiol.Biotechnol)，第 20 卷，第 46-53 頁；ATCC N0.56765 和 ATCC N0.26921)；青霉屬(Penicillium sp.);腐質(zhì)霉屬(例如e.g特異腐質(zhì)霉(H.1nsolens)、柔毛腐質(zhì)霉(H.lanuginosa)和灰腐質(zhì)霉(H.grisea);金孢子菌屬(Chrysosporium sp.)(如C.1ucknowense);粘帚霉屬(Gliocladiurm sp.);曲霉屬(Aspergillus sp.)(例如米曲霉(A.0ryzae)、黑曲霉(A.niger)、醬油曲霉(Asojae)、日本曲霉(A.japonicus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)和泡盛曲霉(A.awamori) (Ward等人，1993年，《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)第 39 卷，第 738-743 頁；以及 Goedegebuur 等人，2002 年，《遺傳學(xué)》(Genet),第41卷,第89-98頁);鐮刀菌屬(Fusarium sp.)(例如粉紅色鐮刀菌(F.roseum)、禾谷鐮刀菌(F.graminum)、F.cerealis、尖孢鐮刀菌(F.0xysporuim)和腐皮鐮刀菌(F.venenatum));脈胞菌屬(Neurospora sp.)(粗糙脈胞菌(N.crassa));肉座菌屬(Hypocrea sp.);毛霉屬 Mucor sp.)(米黑毛霉(M.miehei));根霉屬(Rhizopus sp.)和裸孢殼屬(Emericella sp.)(另參見Innis等人，1985年，《科學(xué)》(Sc1.),第228卷,第21-26 頁)ο 術(shù)語木霉屬(“Trichoderma”或“Trichoderma sp.”或“Trichoderma spp.，，)指之前或目前被歸類為木霉的任何真菌屬。在其他實(shí)施例中，宿主細(xì)胞將是經(jīng)遺傳工程改造的宿主細(xì)胞，其中天然基因已例如通過在真菌細(xì)胞中進(jìn)行缺失而被失活。在期望獲得具有一個(gè)或多個(gè)失活的基因的真菌宿主細(xì)胞的情況中，可使用已知的方法(例如美國專利N0.5，246，853和N0.5，475，101以及W092/06209中公開的方法)。可通過完全或部分缺失、通過插入失活或者通過任何其他能使基因?qū)ζ漕A(yù)定目的而言無功能的手段(使得防止該基因表達(dá)功能蛋白)，來實(shí)現(xiàn)基因失活。在一些實(shí)施例中，當(dāng)宿主細(xì)胞是木霉屬細(xì)胞尤其是里氏木霉宿主細(xì)胞時(shí)，cbhl基因、cbh2基因、egll基因和egl2基因?qū)⒈皇Щ詈?或通常被缺失。代表性地，具有quad缺失蛋白的里氏木霉宿主細(xì)胞在美國專利N0.5，847，276和W005/001036中給出并描述。在其他實(shí)施例中，宿主細(xì)胞是蛋白酶缺陷株或蛋白酶欠缺株。
[0094]為用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的實(shí)施例的葡糖淀粉酶，可構(gòu)建包含編碼該指定葡糖淀粉酶的氨基酸序列的核酸的DNA構(gòu)建體，并轉(zhuǎn)移到例如里氏木霉宿主細(xì)胞中。載體可以是任何當(dāng)被引入到里氏木霉宿主細(xì)胞中時(shí)能整合到宿主細(xì)胞基因組中并能被復(fù)制的載體。有關(guān)載體名單可參見真菌遺傳學(xué)原種中心(Fungal Genetics Stock Center,FGSC,〈www.fgsc.net>)菌株目錄。合適的表達(dá)和/或整合載體的另外的例子在以下文獻(xiàn)和專利中提供:Sambrook等人，1989年，出處同上；Ausubel, 1987年，出處同上；van denHondel等人，1991年，載于Bennett和Lasure編輯，“真菌中的更多基因操縱”(MORE GENEMANIPULATIONS IN FUNGI)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，第 396-428 頁；以及美國專利N0.5，874，276?？蓪⒕幋a葡糖淀粉酶的核酸有效連接到在里氏木霉宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的合適啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子可衍自編碼該宿主細(xì)胞的同源或異源蛋白質(zhì)的基因。啟動(dòng)子的合適的非限制性例子包括cbhl、cbh2、egll、egl2。在一個(gè)實(shí)施例中，啟動(dòng)子可以是天然的里氏木霉啟動(dòng)子。通常，啟動(dòng)子可以是里氏木霉cbhl，其是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子并已寄存在GenBank中，登記號為D86235?！罢T導(dǎo)型啟動(dòng)子”可指在環(huán)境調(diào)節(jié)或發(fā)育調(diào)節(jié)下有活性的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施例中，啟動(dòng)子可以是里氏木霉宿主細(xì)胞的異源啟動(dòng)子。有用的啟動(dòng)子的其他例子包括來自泡盛曲霉和黑曲`霉葡糖淀粉酶基因的啟動(dòng)子(參見例如Nunberg等人，1984年，《分子與細(xì)胞生物學(xué)》(Mol.Cell Biol.)，第4卷，第2306-2315頁;和Boel等人，1984年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBO J.)，第3卷，第1581-1585頁)。另外，里氏木霉xlnl基因和纖維二糖水解酶I基因的啟動(dòng)子也可能是有用的。
[0095]在一些實(shí)施例中，可將葡糖淀粉酶編碼序列有效連接到信號序列。信號序列可以是葡糖淀粉酶的天然信號肽(例如，對于HgGA而言為SEQ ID NO:2的殘基1_20)。或者，信號序列可與天然信號序列具有至少90%或至少95%序列同一性。在另外的實(shí)施例中，構(gòu)成待引入到里氏木霉宿主細(xì)胞中的DNA構(gòu)建體或載體的信號序列和啟動(dòng)子序列衍生自相同的來源。例如，在一些實(shí)施例中，信號序列可以是有效連接到cdhl啟動(dòng)子的cdhl信號序列。
[0096]在一些實(shí)施例中，表達(dá)載體也可包括終止序列。在一個(gè)實(shí)施例中，終止序列和啟動(dòng)子序列可衍自相同來源。在另一個(gè)實(shí)施例中，終止序列可以對宿主細(xì)胞而言是同源的。特別合適的終止子序列可以是衍生自里氏木霉的cbhl。其他示例性的真菌終止子包括來自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的終止子。[0097]在一些實(shí)施例中，表達(dá)載體可包括選擇性標(biāo)記。代表性的選擇性標(biāo)記的例子包括賦予抗微生物抗性(例如潮霉素和腐草霉素)的選擇性標(biāo)記。營養(yǎng)選擇性標(biāo)記也可用于本發(fā)明，包括本領(lǐng)域已知的amdS、argB和pyr4標(biāo)記。在用于木霉屬的轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)中有用的標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的(參見例如Finkelstein，《絲狀真菌的生物技術(shù)》(BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI)第 6 章，F(xiàn)inkelstein 等人編輯，美國馬薩諸塞州波士頓的 Butterworth-Heinemann 出版社(Butterworth-Heinemann,Boston,Mass.), 1992年，第6章；和Kinghorn等人，1992年，《絲狀真菌的應(yīng)用分子遺傳學(xué)》(APPLIED MOLE⑶LARGENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI)，倫敦查普曼 & 霍爾公司的 Blackie Academic andProfessional 出版 社(Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall,London)。在一個(gè)代表性的實(shí)施例中，選擇性標(biāo)記可以是編碼乙酰胺酶的amdS基因，從而使轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能以乙酰胺作為氮源生長。使用構(gòu)巢曲霉amdS基因作為選擇性標(biāo)記在例如以下文獻(xiàn)中有描述=Kelley等人，1985年，《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBO J.)，第4卷，第475-479 頁；和 Penttila 等人，1987 年，《基因》(Gene)，第 61 卷，第 155-164 頁。
[0098]包含具有編碼葡糖淀粉酶的多核苷酸的DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體，可以是任何能夠在給定的真菌宿主生物中自主復(fù)制或能夠整合到宿主的DNA中的載體。在一些實(shí)施例中，表達(dá)載體可以是質(zhì)粒。在典型的實(shí)施例中，設(shè)想到兩種類型的用于獲得基因的表達(dá)的表達(dá)載體。
[0099]第一個(gè)表達(dá)載體可包含這樣的DNA序列，其中啟動(dòng)子、葡糖淀粉酶編碼區(qū)和終止子均來源于待表達(dá)的基因。在一些實(shí)施例中，可通過缺失掉不需要的DNA序列(例如編碼不想要的結(jié)構(gòu)域的DNA)以留下待在其自身的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列控制下表達(dá)的結(jié)構(gòu)域，來獲得基因截短。[0100]第二種類型的表達(dá)載體可以是預(yù)先裝配的，含有高水平轉(zhuǎn)錄所需的序列并含有選擇性標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，可將葡糖淀粉酶基因的編碼區(qū)或其部分插入到這個(gè)通用表達(dá)載體中，使得它處于表達(dá)構(gòu)建體啟動(dòng)子和終止子序列的轉(zhuǎn)錄控制下。在一些實(shí)施例中，可將基因或其部分插入在強(qiáng)啟動(dòng)子如強(qiáng)Cbhl啟動(dòng)子的下游。
[0101]用于連接包含編碼葡糖淀粉酶的多核苷酸、啟動(dòng)子、終止子和其他序列的DNA構(gòu)建體并將它們插入到合適的載體中的方法是本領(lǐng)域公知的。連接通?？赏ㄟ^在便利的限制位點(diǎn)處的連接來完成。如果不存在此類位點(diǎn)，那么根據(jù)常規(guī)做法使用合成的寡核苷酸接頭。(參見Sambrook, 1989年，出處同上；以及Bennett和Lasure,《真菌中的更多基因操縱》(MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI)，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥(Academic Press, SanDiego), 1991年,第70-76頁)。另外,可用已知的重組技術(shù)構(gòu)建載體(如，英杰生命技術(shù)公司，Gateway 技術(shù)(Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology))。
[0102]將DNA構(gòu)建體或載體引入到宿主細(xì)胞中包括諸如以下的技術(shù):轉(zhuǎn)化；電穿孔；核顯微注射；轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)染(例如脂轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的和DEAE-Dextrin介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)；與磷酸鈣DNA沉淀一起溫育；用包被DNA的微粒高速轟擊；及原生質(zhì)體融合。一般的轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見例如Ausubel等人，1987年，出處同上,第9章；Sambrook, 1989年,出處同上；以及Campbell等人，1989年，《當(dāng)代遺傳學(xué)》(Curr.Genet.),第16卷,第53-56頁)。異源蛋白在木霉屬中的表達(dá)在以下專利和文獻(xiàn)中有描述:美國專利N0.6,022, 725 ；N0.6，268，328 ；Harkki 等人，1991 年，《酶微生物技術(shù)》(Enzyme Microb.Technol.),第 13 卷，第 227-233頁；Harkki 等人，1989 年，《生物技術(shù)》(Bio Technol.)，第 7 卷，第 596-603 頁；EP244, 234 ；EP215, 594 ；以及Nevalainen等人，“木霉屬的分子生物學(xué)及其在表達(dá)同源和異源基因中的應(yīng)用，，(“The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to theExpression of Both Homologous and Heterologous Genes，，)，載于《分子工業(yè)真菌學(xué)》(MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY)，Leong和Berka編輯，馬塞爾.德克爾有限公司，紐約(Marcel Dekker Inc.，NY)，1992 年，第 129-148 頁)。
[0103]在一些實(shí)施例中，可用可據(jù)以將編碼葡糖淀粉酶的核酸穩(wěn)定整合到宿主菌株染色體中的載體系統(tǒng)來構(gòu)建遺傳上穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化株。然后可通過已知的技術(shù)純化轉(zhuǎn)化株。
[0104]在一個(gè)非限制性例子中，包含amdS標(biāo)記的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株與不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株的區(qū)別在于它們生長速度較快，并且在含有乙酰胺的固體培養(yǎng)基上形成光滑輪廓而不是粗糙輪廓的圓形菌落。此外，在一些情況下，通過以下方式進(jìn)行進(jìn)一步的穩(wěn)定性測試:使轉(zhuǎn)化株在固體非選擇性培養(yǎng)基(即缺乏乙酰胺的培養(yǎng)基)上生長，從這個(gè)培養(yǎng)基收獲孢子，并測定隨后在含有乙酰胺的選擇性培養(yǎng)基上萌發(fā)和生長的這些孢子的百分比?；蛘?，可使用本領(lǐng)域知道的其他方法來選擇轉(zhuǎn)化株。
[0105]DNA向木霉屬菌株宿主中的攝取取決于鈣離子濃度。通常，在攝取溶液中可使用約IOmM CaCl2至50禮CaCl20攝取溶液中除了需要鈣離子外，其他通常包括的化合物是緩沖系統(tǒng)如TE緩沖液(IOmM Tris, pH7.4 ；lmM EDTA)或IOmM MOPS, pH6.0緩沖液(嗎啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。據(jù)認(rèn)為，聚乙二醇的作用是融化細(xì)胞膜，從而讓該介質(zhì)的內(nèi)容物得以遞送到木霉屬菌株的細(xì)胞質(zhì)中，并且質(zhì)粒DNA得以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。這個(gè)融化在很多情況下使質(zhì)粒DNA的多個(gè)拷貝整合到宿主染色體中。
[0106]通常，在轉(zhuǎn)化中使用含有密度為IO5至107/mL、通常2 X IOfVmL的經(jīng)歷過滲透性處理的木霉屬原生質(zhì)體或細(xì) 胞的懸浮液。將這些原生質(zhì)體或細(xì)胞在適當(dāng)?shù)娜芤?例如，1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)中的100 μ L體積與所需DNA混合。通常，可將高濃度的PEG加入到攝取溶液。可向原生質(zhì)體懸浮液加入0.1-1體積的25% PEG4000。還通常向原生質(zhì)體懸浮液加入約0.25體積。也可向攝取溶液加入添加劑例如二甲基亞砜、肝素、亞精胺、氯化鉀等，幫助轉(zhuǎn)化。有類似的程序可用于其他的真菌宿主細(xì)胞。參見例如，美國專利N0.6，022，725和 N0.6，268，328。
[0107]通常，然后可將混合物在大約0°C下溫育10至30分鐘的一段時(shí)間。然后可向混合物加入另外的PEG以進(jìn)一步增強(qiáng)所需的基因或DNA序列的攝取。25% PEG4000的加入體積通?？蔀檗D(zhuǎn)化混合物的體積的5-15倍；但是，更大和更小的體積都可以是適合的。25%PEG4000通?？蔀檗D(zhuǎn)化混合物的體積的約10倍。在加入PEG后，接著可將轉(zhuǎn)化混合物在室溫下或在冰上進(jìn)行溫育，然后再加入山梨糖醇/CaCl2溶液。然后可將原生質(zhì)體懸浮液進(jìn)一步加到生長培養(yǎng)基的熔化等分試樣。這個(gè)生長培養(yǎng)基僅允許轉(zhuǎn)化株的生長。
[0108]通常，在含有生理鹽和營養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(參見例如，Pourquie,J.等人，《纖維素降解的生物化學(xué)和遺傳學(xué)》(BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSEDEGRADATION), Aubert, J.P.等人編輯，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，第 71-86 頁，1988年；以及Ilmen,M.等人，1997年，《應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)》(Appl.Environ.Microbiol.),第63卷，第1298-1306頁)。常見的商業(yè)制備的培養(yǎng)基(例如酵母麥芽浸膏(YM)肉湯、LuriaBertani (LB)肉湯和Sabouraud右旋糖(SD)肉湯也可用于本發(fā)明的實(shí)施例。[0109]培養(yǎng)條件也是標(biāo)準(zhǔn)的，例如，培養(yǎng)物在搖瓶培養(yǎng)或發(fā)酵罐中在適當(dāng)培養(yǎng)基中于大約28°C下進(jìn)行溫育，直到達(dá)到所需的葡糖淀粉酶表達(dá)水平。在真菌生長建立后，使細(xì)胞暴露于能有效促使或允許葡糖淀粉酶的表達(dá)的條件。在葡糖淀粉酶編碼序列處于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下的情況中，可將誘導(dǎo)劑(例如糖、金屬鹽或抗微生物劑)以能有效誘導(dǎo)葡糖淀粉酶表達(dá)的濃度加到培養(yǎng)基。
[0110]通常，細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的葡糖淀粉酶可分泌到培養(yǎng)基中，并可例如通過將不想要的組分從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除來進(jìn)行純化或分離。在一些情況中，葡糖淀粉酶可以細(xì)胞形式產(chǎn)生，這就需要從細(xì)胞裂解物中回收在此類情況下，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常采用的技術(shù)從產(chǎn)生該酶的細(xì)胞純化該酶。這些技術(shù)的例子包括但不限于親和層析(Tilbeurgh等人，1984年，《歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)盟通訊》(FEBS Lett.),第16卷,215頁)、離子交換色譜方法(Goyal等人，1991年，《生物資源技術(shù)》(Biores.Technol.)，第36卷，第37頁；Fliess等人，1983年，《歐洲應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志》(Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.),第 17 卷，第 314 頁；Bhikhabhai 等人，1984 年，《應(yīng)用生物化學(xué)雜志》(J.Appl.Biochem.)，第6卷,第336頁；以及Ellouz等人，1987年，《色譜》(Chromatography)，第396卷,第307頁),包括使用具有高拆分能力的材料進(jìn)行的離子交換(Medve等人，1998年，《色譜雜志A)) (J.ChromatographyA)，第808卷,第153頁)、疏水相互作用色譜(參見Tomaz和Queiroz, 1999年，《色譜雜志A》(J.Chromatography A)，第865卷,第123頁；兩相分配(參見Brumbauer等人，1999年,《生物分離》(Bioseparation),第7卷，第287頁)；乙醇沉淀；反相HPLC、在二氧化硅上或在陽離子交換樹脂如DEAE上進(jìn)行的色譜、色譜聚焦、SDS-PAGE、硫酸銨沉淀和凝膠過濾(例如S印hadex G-75)。
[0111]2.2.α -淀粉酶
[0112]α -淀粉酶構(gòu)成一組存在于微生物和來自動(dòng)植物的組織中的酶。它們能夠水解糖原、淀粉、相關(guān)多糖和一些寡糖的α-1，4-糖苷鍵。盡管所有α-淀粉酶都具有相同的催化功能，但是它們的氨基酸序 列有很大差異。不同的淀粉酶之間的序列同一性可能實(shí)質(zhì)上是不存在的，例如低于25 %。盡管存在相當(dāng)大的氨基酸序列變異，但是α -淀粉酶具有共同的整體拓?fù)鋵W(xué)模式，該拓?fù)淠Ｊ绞窃跍y定了來自不同物種的α -淀粉酶的三維結(jié)構(gòu)后得到確定的。該共同的三維結(jié)構(gòu)揭示了三個(gè)結(jié)構(gòu)域:(I)稱為結(jié)構(gòu)域A的“ TIM”桶，(2)稱為結(jié)構(gòu)域B的長環(huán)區(qū)域，其插入于結(jié)構(gòu)域A中，和(3)稱為結(jié)構(gòu)域C的接近C端的區(qū)域，其含有具有Greek-key基序的特征性β _結(jié)構(gòu)。
[0113]“Termamyl樣” α -淀粉酶是指一組廣泛用于淀粉加工產(chǎn)業(yè)的α -淀粉酶。具有美國專利N0.6，440, 716的SEQ ID NO:2氨基酸序列的地衣芽孢桿菌(Bacillus
licheniformis) α -淀粉酶以商品名Termamyl*市售。τermamyI樣α -淀粉酶通常指
芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)產(chǎn)生的一組高度同源的α-淀粉酶。該組的其他成員包括來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophiIus)(之前稱為脂肪嗜熱芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus);這兩個(gè)名稱在本說明書中可互用)和解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的α -淀粉酶以及衍自芽抱桿菌屬NCIB12289、NCIB12512、NC皿2513和DSM9375的α -淀粉酶，所有這些在美國專利N0.6，440，716和W095/26397中有詳細(xì)描述。
[0114]盡管α-淀粉酶普遍含有上述的三個(gè)結(jié)構(gòu)域，但是一些α-淀粉酶(如來自枯草芽孢桿菌的AmyE)的三維結(jié)構(gòu)不同于Termamyl樣α -淀粉酶。這些酶統(tǒng)稱為非Termamyl樣α-淀粉酶。出于本發(fā)明的目的，“AmyE”意指來自枯草芽孢桿菌的天然α -淀粉酶(EC3.2.1.1 ;1，4- a -D-葡聚糖葡聚糖水解酶)。代表性的AmyE酶及其變體在2009年6月4日提交的美國專利申請12/478，266和12/478，368以及2009年6月5日提交的美國專利申請12/479,427中公開。
[0115]2.3.其他酶
[0116]在本發(fā)明的實(shí)施例中，在淀粉處理中的糖化和/或發(fā)酵過程中也可加入其他的酶作為補(bǔ)充。這些輔助性的酶可包括蛋白酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角質(zhì)酶、木聚糖酶、支鏈淀粉酶和/或α -葡萄糖苷酶。參見例如W02009/099783。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知使用以上所列的酶的方法。
[0117]3.淀粉加工
[0118]3.1.淀粉底物和原料
[0119]本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知可供用于制備在本文公開的過程中使用的淀粉底物的方法。例如，可用的淀粉底物可獲自塊莖、根、莖、豆類、谷類或全谷。更具體而言，顆粒淀粉來自能生產(chǎn)大量淀粉的植物。例如，顆粒淀粉可獲自玉米、小麥、大麥、黑麥、買羅高梁、西米、木薯(cassava)、木薯(tapioca)、高粱、大米、豌豆、豆(bean)、香蕉或馬鈴薯。玉米含有約60-68%淀粉；大麥含有約55-65%淀粉；小米含有約75-80%淀粉；小麥含有約60-65%淀粉；精白米含有約70-72%淀粉。具體設(shè)想到的淀粉底物有玉米淀粉、小麥淀粉和大麥淀粉。來自谷類的淀粉可以是磨碎的或者是完整的，包括玉米固形物，如玉米籽粒、麩皮和/或穗軸。淀粉可以是來自淀粉精制過程的高度精制的生淀粉或原料。各種淀粉也可市售獲得。例如，玉米淀粉可獲自賽力斯達(dá)公司(Cerestar)、西格瑪公司(Sigma)和日本片山化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社(Katayama `Chemical Industry C0.);小麥淀粉可獲自西格瑪公司(Sigma)；甘薯淀粉可獲自日本的和光純藥工業(yè)株式會(huì)社(Wako Pure Chemical Industry C0.);馬鈴薯淀粉可獲自日本的 Nakaari Chemical Pharmaceutical C0.。
[0120]3.2.碾磨
[0121]淀粉底物可以是來自經(jīng)碾磨的全谷的粗淀粉，全谷含有非淀粉級分例如殘胚和纖維。碾磨可包括濕磨或干磨。在濕磨中，可將全谷浸泡在水或稀酸中，以將谷粒分離為其組分，例如淀粉、蛋白質(zhì)、胚芽、油、籽粒纖維。濕磨能有效地分離胚芽和粗粉(即淀粉顆粒和蛋白質(zhì))，并可能尤其適合于生產(chǎn)糖漿。在干磨中，將全籽粒研磨成細(xì)粉并在不將谷粒分級為其組分的情況下進(jìn)行加工。干磨谷粒因此除了包含淀粉外還將包含大量的非淀粉碳水化合物。大部分的乙醇來自干磨?；蛘?，待加工的淀粉可以為高度精制的淀粉質(zhì)量，例如至少約90%、至少約95%、至少約97%或至少約99.5%純。
[0122]3.3.糊化和液化
[0123]本文所用的術(shù)語“液化”意指將淀粉轉(zhuǎn)化為粘性較小且鏈長較短的可溶性糊精的過程。該過程涉及在進(jìn)行淀粉糊化的同時(shí)添加α-淀粉酶或者隨后添加α-淀粉酶。可任選地添加另外的液化誘導(dǎo)酶，如植酸酶。
[0124]在一些實(shí)施例中，可將如上所述制備的淀粉底物用水調(diào)成漿液。淀粉漿液含有的淀粉以干物質(zhì)重量百分比計(jì)可為約10-55%、約20-45%、約30-45%、約30-40%或約30-35%。為優(yōu)化α -淀粉酶穩(wěn)定性和活性，可將漿液的pH調(diào)整至α-淀粉酶的最適pH。液化后在漿液中剩余的α -淀粉酶可通過在后一反應(yīng)步驟中降低PH或者通過從漿液移除鈣來使其失活。
[0125]可將淀粉加α -淀粉酶的漿液連續(xù)泵送經(jīng)過噴射蒸煮器，該噴射蒸煮器可被蒸汽加熱到約85°C至最高約105°C。在這些條件下糊化發(fā)生得非?？?，并且酶活性與極大的剪切力相結(jié)合開始淀粉底物的水解。在噴射蒸煮器中的停留時(shí)間可非常短暫。可使經(jīng)部分糊化的淀粉穿過維持在約85-105°C下的一系列保持管并保持約5分鐘以完成糊化過程。這些罐可具有擋板以阻止回流混合。本文所用的術(shù)語“第二液化”指跟在第一液化后面的液化步驟，此時(shí)讓漿液冷卻到室溫。這個(gè)冷卻步驟可為約30分鐘至約180分鐘，如約90分鐘至120分鐘。經(jīng)碾磨和液化的谷粒也被稱為醪液。
[0126]34 糖化
[0127]在液化后，可將醪液通過糖化進(jìn)一步水解為在下游應(yīng)用中可容易使用的高密度葡萄糖漿。本發(fā)明實(shí)施例的糖化可通過使用如上所述的葡糖淀粉酶在5.2至5.6范圍內(nèi)的pH下進(jìn)行。葡糖淀粉酶的用量可在約0.15至2.0GAU/g dss (干物質(zhì)淀粉)、約0.20至1.5GAU/g dss或1.0至1.5GAU/gdss的范圍內(nèi)。糖化可在約58°C至約62°C下進(jìn)行。
[0128]完整的糖化步驟通常可在24至96小時(shí)、24至72小時(shí)或24至48小時(shí)的范圍內(nèi)。
[0129]3.5.發(fā)酵
[0130]在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，可使可發(fā)酵糖經(jīng)歷分批或連續(xù)發(fā)酵條件。傳統(tǒng)的分批發(fā)酵是在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行，其中培養(yǎng)基的組成在發(fā)酵開始時(shí)設(shè)定，并且在發(fā)酵過程中不進(jìn)行人為改變。因此， 在發(fā)酵開始時(shí)，可用所需的生物體接種培養(yǎng)基。在這個(gè)方法中，可在不向系統(tǒng)中添加任何組分的情況下讓發(fā)酵進(jìn)行。通常，分批發(fā)酵是就添加碳源而言謂之“分批”，而常常會(huì)嘗試對諸如PH和氧濃度的因素進(jìn)行控制。直到發(fā)酵停止之時(shí)，分批系統(tǒng)的代謝物和生物量組成都不斷地變化。在分批培養(yǎng)物內(nèi)，細(xì)胞經(jīng)靜息遲滯期進(jìn)入高速對數(shù)生長期，最終到達(dá)生長速率降低或停止的穩(wěn)定期。穩(wěn)定期的細(xì)胞如果不加以處理就會(huì)最終死亡。一般而言，是對數(shù)期的細(xì)胞導(dǎo)致終產(chǎn)品的大量產(chǎn)生。
[0131]標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的一種變型是“補(bǔ)料分批發(fā)酵”系統(tǒng)，其可在本發(fā)明的一些實(shí)施例中使用。在典型的分批系統(tǒng)的這個(gè)變型中，可隨著發(fā)酵的進(jìn)行以增量的形式添加底物。在分解代謝物阻遏傾向于抑制細(xì)胞的代謝時(shí)和在需要在培養(yǎng)基中具有有限量的底物的情況下，補(bǔ)料分批系統(tǒng)特別有用。補(bǔ)料分批系統(tǒng)中實(shí)際底物濃度的測量可能是困難的，因此根據(jù)諸如pH、溶氧、廢氣(如CO2)分壓的可測量因素的變化進(jìn)行估計(jì)。分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵都是本領(lǐng)域普通且公知的。
[0132]另一方面，連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中限定的發(fā)酵培養(yǎng)基可連續(xù)添加到生物反應(yīng)器，并可同時(shí)移取等量的經(jīng)調(diào)理的培養(yǎng)基進(jìn)行加工。連續(xù)發(fā)酵通常以恒定的高密度維持培養(yǎng)物，其中細(xì)胞主要處于對數(shù)生長期。連續(xù)發(fā)酵使得可以調(diào)節(jié)影響細(xì)胞生長和/或終產(chǎn)品濃度的一個(gè)因素或多個(gè)因素。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，可以以固定的速率維持限制性營養(yǎng)物如碳源或氮源，同時(shí)讓所有其他參數(shù)調(diào)節(jié)。在其他系統(tǒng)中，可連續(xù)地改變多個(gè)影響生長的因素，同時(shí)可保持細(xì)胞濃度(通過培養(yǎng)基濁度測量)恒定。連續(xù)系統(tǒng)旨在維持穩(wěn)態(tài)生長條件。因此，必須使由于移取培養(yǎng)基導(dǎo)致的細(xì)胞損失與發(fā)酵中的細(xì)胞生長速率保持平衡。調(diào)節(jié)連續(xù)發(fā)酵過程的營養(yǎng)物和生長因子的方法以及使產(chǎn)物形成速率最大化的技術(shù)是工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域公知的。
[0133]在另外的實(shí)施例中，通過使用本領(lǐng)域知道的適當(dāng)發(fā)酵微生物，發(fā)酵終產(chǎn)品可包括但不限于酒精、1，3_丙二醇、琥珀酸、乳酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、功能性寡糖以及它們的衍生物。參見例如W02008/086811(甲醇、乙醇、丙醇和丁醇發(fā)酵)；W02003/066816、美國專利N0.5，254，467 和 N0.6，303，352 (1,3-丙二醇發(fā)酵);美國專利 N0.RE37, 393,N0.6，265，190和 N0.6，596，521 (琥珀酸發(fā)酵);美國專利 N0.5，464，760、W02003/095659 ；Mercier 等人，《化工技術(shù)與生物技術(shù)雜志》(J.Chem.Tech.Biotechnol)，第55卷，第111-121頁；Zhang和 Cheryan,《生物技術(shù)通訊》(Biotechnol.Lett.),第 13 卷，第 733-738 頁，1991 年；Linko和 Javanainen,《酶微生物技術(shù)》(Enzyme Microb.Technol.),第 19 卷，第 118-123 頁，1996年；以及Tsai和Moon,《應(yīng)用生物化學(xué)與生物技術(shù)》(Appl.Biochem.Biotechnol.)，第 70-72 卷，第 417-428 頁，1998 年(乳酸發(fā)酵);美國專利 N0.7，320，882,N0.7，332，309、N0.7, 666, 634 ；以及Zhang等人，《應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)，第77卷，第355-366頁，2007年(各種氨基酸的發(fā)酵)。
[0134]以上列舉的列表僅為例子，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)知道多種可適當(dāng)?shù)赜糜讷@得所需終產(chǎn)物的發(fā)酵微生物。
[0135]實(shí)M
[0136]實(shí)例1:使用灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶的單PH液化和糖化
[0137]評估灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶(HgGA)在5.6的pH下不進(jìn)行pH調(diào)節(jié)時(shí)水解淀粉底物(液化物)的能力。使用CLEARFLCTW?AA(美國丹尼斯克有限公司杰能科子公司(Danisco US Inc., Genencor Division))按照常規(guī)的工作臺(tái)烹飪過程液化玉米淀粉,獲得具有DElO的液化物。將 液化物(35% DS) “按原樣”放置在50ml玻璃燒瓶中，在不進(jìn)行PH調(diào)節(jié)的情況下使存在于液化物(即α-活性液化物)中的α-淀粉酶失活。在存在OPTIMAX? L-1000支鏈淀粉酶(I 129ASPU/g)的情況下，使用HgGA，通過使玻璃燒瓶在水浴中在60°C下溫育69.5小時(shí)而執(zhí)行液化物的糖化。按以下劑量使用HgGA:0.18GAU/g ds、0.16GAU/g ds和0.14GAU/g ds。在不同的時(shí)間間隔提取0.5ml糖化反應(yīng)混合物的樣品，將其與4.5ml的RO水混合，并通過0.2 μ m Whatman過濾器過濾。然后將樣品放入樣品瓶中并使其經(jīng)受HPLC分析。使用配有Bio-Rad?脫灰保護(hù)柱的Rezex RCM-單糖色譜柱進(jìn)行HPLC分析。糖化反應(yīng)混合物中多種糖的組成在表1中呈現(xiàn)。
[0138]表1:糖化期間糖的組成。
[0139]
【權(quán)利要求】
1.一種在存在葡糖淀粉酶且不進(jìn)行PH調(diào)節(jié)的情況下處理淀粉的方法，所述方法包括將淀粉底物糖化為葡萄糖，其中糖化在PH5.2至5.6以及約58°C至約62°C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行，其中所述葡糖淀粉酶選自包含SEQ ID NO:3的親本灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)葡糖淀粉酶(HgGA)及其變體，其中所述變體與所述親本葡糖淀粉酶具有至少99%的同一性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中糖化在存在支鏈淀粉酶的情況下進(jìn)行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中與所述親本葡糖淀粉酶相比，所述變體葡糖淀粉酶具有至少一個(gè)氨基酸修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶為具有SEQID NO:3的氨基酸序列的HgGA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶在里氏木霉(Trichoderma reesei)宿主細(xì)胞中制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶以至少約0.15GAU/克干物質(zhì)淀粉的劑量添加。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述葡糖淀粉酶以至少約0.20GAU/克干物質(zhì)淀粉的劑量添加。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中糖化在pH5.35至5.5下進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述淀粉底物為液化淀粉。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中糖化在約70小時(shí)達(dá)到至少95%的DPl濃度。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述淀粉底物為約30%至約50%干固體(DS) ο
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述淀粉底物為約30%至約35%干固體(DS) ο
13.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述淀粉底物為顆粒淀粉。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中糖化在約28小時(shí)達(dá)到至少95%的DPl濃度。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述淀粉底物的淀粉溶解度為至少90%。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中糖化在約50小時(shí)達(dá)到至少96%的DPl濃度。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述淀粉底物的淀粉溶解度為至少97%。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的方法，其中所述高級糖的含量低于I%。
19.根據(jù)權(quán)利要求13至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述淀粉底物為約28%干固體(DS)。
【文檔編號】C12N9/24GK103732756SQ201280020947
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年4月27日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月29日
【發(fā)明者】S·H·李, J·K·謝提, P·J·M·特尼森 申請人:丹尼斯科美國公司