專利名稱：一種可以降解生淀粉的糖化酶glad3及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了ー種可以降解生淀粉的糖化酶GLAD3及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖化酶，即葡萄糖淀粉酶(glucoamylase, E. C. 3. 2. I. 3),是淀粉水解過程中的重要酶。其功能在于從淀粉、糊精或糖原等碳水化合物的非還原性末端釋放β-D-葡萄糖，是世界上生產(chǎn)量最大、應(yīng)用范圍最廣的酶制劑。在釀造、食品和紡織等エ業(yè)中得以廣泛的應(yīng)用(Bui DM et al. , 1996, Applied Microbiology and Biotechnology, 44:610-619)。微生物是糖化酶的重要來源(Marin-NavarroJ et al. , 2011, Appl MicrobiolBiotechnol 89:1267 - 1273;Pardeep K and Satyanarayana T, 2009, Crit RevBiotechnol 29:225 - 255)。エ業(yè)中應(yīng)用的糖化酶主要是從曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)等絲狀真菌和酵母屬(Saccharmyces)中獲得的(Svensson B et al. , 1986, EurJ Biocheml54:497-502;Liu YN et al. , 2007, Biochem J 403:21-30;Adam AC et al.,2004, Yeast21:379-388;Pardeep K and Satyanarayana T, 2009, Crit Rev Biotechnol29:225-255)。隨著基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，很多糖化酶基因已被克隆并進行了異源表達(Pardeep K and Satyanarayana T, 2009, Crit Rev Biotechnol 29:225-255)。報道的糖化酶多屬于糖苷水解酶15家族(Henrissat B et al. 1991, Biochem J)。糖化酶多為糖蛋白，一般由催化域(catalytic domain,CD)、淀粉結(jié)合域(starch-binding domain,SBD)以及連接⑶與SBD的O-糖基化連接域(0-glycosylated linker domain)組成。大多數(shù)真菌糖化酶的最適反應(yīng)pH值為4. 0-5. 0，在酸性條件下穩(wěn)定。最適反應(yīng)溫度為 40-60で(Norouzian D et al. 2006, Biotechnol Adv 24:80_85)。淀粉液化 pH—般在5. 5-6. 2，液化后加糖化酶進行糖化作用，所以開發(fā)在pH5. 5-6. 5之間有高活性的糖化酶更適合エ業(yè)應(yīng)用。糖化酶可以水解88. 5-100%的可溶性淀粉，但并不是所有的糖化酶都可水解生淀粉。具有生淀粉水解能力的糖化酶在淀粉加工エ業(yè)中具有明顯的應(yīng)用優(yōu)勢。篩選耐熱、在ρΗ5· 5-6. 5之間有高活性、有生淀粉水解能力的糖化酶，會使淀粉糖化過程有效完成，從而降低能源消耗及生產(chǎn)成本，將給糖化酶在エ業(yè)中的應(yīng)用開辟更為廣闊的前景，具有重要的商業(yè)價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種耐熱、在ρΗ5· 5-6. 5之間有高活性、有生淀粉水解能力的
糖化酶。本發(fā)明的再一目的是提供上述編碼上述糖化酶的基因。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述糖化酶編碼基因的重組載體。本發(fā)明的再一目的是提供包含上述糖化酶基因的重組菌株。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備糖化酶的方法。
本發(fā)明的再一目的是提供上述糖化酶的應(yīng)用。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種耐酸堿、作用PH在酸中性范圍、有生淀粉水解能力的性質(zhì)優(yōu)良的新酶。它所產(chǎn)生的糖化酶適合于在酒類和燃料酒精的生產(chǎn)、葡萄糖、果糖漿、有機酸、味精等食品エ業(yè)的等多個行業(yè)中使用。本發(fā)明從上述菌株中獲得了一種耐熱糖化酶GLAD3，其氨基酸序列如SEQ IDN0. I所示I MYFGSSAFLL GSFALQSVLG RPAFDERSLV QERQSSVDSF IKSETPIALN51 NLLCNVGPDG CRAFGTSSGA VIASPSRTDP DYYYMWTRDS ALVFKLVIDR101 FTNQYNSGLQ RRIEQYITAQ ARLQGISNPS GSLADGAGLG EPKFELDMSQ 151 FTGAffGRPQR DGPPLRAIAL ITYAKffLIAN GYSSTASDIV WPIVRNDLSY201 AAQYffNQTGF DLffEEVNGSS FFTTGSQYRA LIEGAALAKK LGKS⑶NYSN251 IAPQVLCFQQ SFffISSGKYI DSNINVNEGR SGKDVNSVLT SIHNFDPALS301 CDSATFQPCS DKALSNHKVV VDSFRSffNVN KGISQGSAVA IGRYAEDVYY351 NGNPffYLATM AAAEQLYDAI YVffKKQGSIT VSDVSLSFFK DLVSSISTGT401 YASDSATFTS LINAVSKYAD GFVAIVAKYA GTDGHLAEQF DRNNGHPLSA451 TDLTffSYSAF PTATARRAGI VPPSffAGGVA AVPNQCATNS VVGSYSSATA501 TSLPASQTPK GGVPTPTGTQ TSTSSSSTST SCPIATSVLV TFEEVVSTNF551 GQTIKIVGNA AALGNWSTSA AVALDASNYT SSNPLffIATV SLTAGQSIEY601 KYINVGSDGS VTffERDPNRS TLFPQPHYTV PKTCASTATL DDTWQS*其中，該酶蛋白全長646氨基酸和ー個終止密碼子，N端20個氨基酸為其預(yù)測的信號肽序列 “MYFGSSAFLL GSFALQSVLG”。因此，成熟的糖化酶GLAD3的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 I RPAFDERSLV QERQSSVDSF IKSETPIALN NLLCNVGPDG CRAFGTSSGA51 VIASPSRTDP DYYYMWTRDS ALVFKLVIDR FTNQYNSGLQ RRIEQYITAQ101 ARLQGISNPS GSLADGAGLG EPKFELDMSQ FTGAffGRPQR DGPPLRAIAL151 ITYAKffLIAN GYSSTASDIV WPIVRNDLSY AAQYffNQTGF DLffEEVNGSS201 FFTTGSQYRA LIEGAALAKK LGKS⑶NYSN IAPQVLCFQQ SFffISSGKYI251 DSNINVNEGR SGKDVNSVLT SIHNFDPALS CDSATFQPCS DKALSNHKVV301 VDSFRSffNVN KGISQGSAVA IGRYAEDVYY NGNPffYLATM AAAEQLYDAI351 YVffKKQGSIT VSDVSLSFFK DLVSSISTGT YASDSATFTS LINAVSKYAD401 GFVAIVAKYA GTDGHLAEQF DRNNGHPLSA TDLTffSYSAF PTATARRAGI451 VPPSffAGGVA AVPNQCATNS VVGSYSSATA TSLPASQTPK GGVPTPTGTQ501 TSTSSSSTST SCPIATSVLV TFEEVVSTNF GQTIKIVGNA AALGNWSTSA551 AVALDASNYT SSNPLffIATV SLTAGQSIEY KYINVGSDGS VTffERDPNRS601 TLFPQPHYTV PKTCASTATL DDTWQS*成熟蛋白由626個氨基酸和ー個終止密碼子組成，理論分子量為67. 3kDa，該酶屬于糖基水解酶第15家族。將推導(dǎo)出的糖化酶氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)，該基因與來源于Gibberella moniliformis的假定的糖化酶序列一致性最高為78%。說明GLAD3是ー種新的糖化酶。
本發(fā)明提供了編碼上述糖化酶的基因。該酶基因全長2103bp，序列如SEQ ID NO. 3所示IATGTACTTTG GGTCTTCTGC CTTTCTTCTC GGCTCATTCG CTCTTCAAAG CGTCTTGGGC61CGACCAGCCT TCGATGAGAG GAGTCTCGTA CAAGAGAGAC AATCTTCGGT CGACTCCTTT121ATCAAGTCTG AGACACCAAT TGCTCTTAAC AACCTCCTCT GCAATGTCGG CCCTGATGGC181TGCCGCGCCT TCGGCACATC CAGCGGTGCT GTCATCGCTT CACCATCCCG CACGGATCCT241GACTGTMGT CGACGAGATA GACAACCAGG ACTAAGMCA TTTACTGACA CACGCTAGAC301TATTACATGT GGACTCGAGA TTCCGCTCTA GTCTTCAAGC TGGTCATCGA TAGGTTCACC 361AACCAGTATA ACTCTGGCTT GCAGAGGCGC ATCGAGCAAT ATATCACCGC CCAAGCCCGC421CTCCAGGGTA TTTCCAACCC TTCTGGGTCG CTTGCTGATG GCGCCGGTCT AGGAGAGCCC481AAGTTCGAAC TTGATATGAG CCAGTTCACT GGCGCTTGGG GTGAGTATTC ATGTTTTGGC541GCCCCTGAAT GAGAACCGTT GACTAMGGT TGTCAAGGTC GACCCCMCG AGATGGTCCA601CCTCTGCGTG CGATCGCTCT GATCACGTAC GCCAAGTGGC TGATTGCCAA CGGCTACTCA661TCCACGGCCA GCGACATTGT GTGGCCTATT GTTCGCAACG ATCTTAGCTA CGCGGCTCM721TATTGGMCC MACCGGATT TGACTTATGG GAAGAGGTCA ACGGCAGTTC GTTCTTTACA781ACTGGCTCCC AGTATCGAGG TTAGTTTGCT GGGTGGTTCA CGAGTAAGAT GATGTATTCA841CATTTTMAG CTCTCATTGA AGGTGCCGCT CTGGCCAAGA AGCTCGGCAA GTCAGGAGAC901AACTACTCCA ACATCGCTCC TCAGGTTCTC TGCTTCCAGC AGTCTTTCTG GATCTCTTCC961GGCAAATACA TCGACTCAAA CATCAATGTC AACGAGGGCC GCAGCGGCAA GGACGTCAAC1021AGTGTCCTGA CATCCATCCA CAATTTTGAC CCTGCTCTGA GCTGTGATTC CGCCACATTC1081CAGCCATGCA GCGACAAGGC CCTCTCCAAC CACAAGGTTG TTGTCGACTC TTTCCGCTCA1141TGGAACGTCA ACAAGGGTAT CTCTCMGGC TCAGCTGTCG CCATTGGACG ATACGCTGAA1201GATGTCTACT ACAATGGCAA CCCCTGGTAC CTCGCTACGA TGGCCGCGGC AGAGCAACTC1261TACGATGCCA TTTACGTCTG GAAGAAGCAG GGATCCATCA CTGTGTCGGA CGTCTCTCTT1321TCGTTTTTCA AGGACCTCGT CTCTTCAATC TCTACCGGAA CCTACGCCAG CGATTCCGCC1381ACCTTCACCA GCCTCATTAA CGCCGTCTCC AAGTACGCTG ATGGGTTTGT TGCTATCGTT1441GCAAAGTATG CCGGCACAGA TGGCCACCTC GCAGAGCAAT TTGACCGCAA CAACGGCCAT1501CCTCTTTCTG CTACAGACTT GACTTGGTCA TATTCCGCAT TCCCCACCGC TACTGCTCGT1561CGAGCTGGTA TTGTTCCTCC TTCTTGGGCT GGTGGCGTGG CTGCTGTTCC CAACCAATGC1621GCTACCMTT CTGTTGTTGG TTCGTACTCA TCGGCCACTG CAACTTCGCT CCCGGCATCG1681CMACACCCA AGGGTGGTGT GCCCACTCCA ACTGGCACCC AGACTTCCAC TTCCAGCTCG1741TCCACTAGCA CCAGTTGCCC TATTGCAACT TCTGTGCTCG TCACTTTCGA AGAGGTTGTC1801TCCACCMCT TTGGTCAMC CATCAAGATC GTTGGCAACG CCGCTGCTCT CGGTMCTGG1861TCGACATCCG CCGCTGTTGC CCTGGACGCC TCAAACTATA CCTCCTCGAA CCCTCTGTGG1921ATCGCTACCG TTTCCCTAAC TGCAGGACAG TCTATTGAGT ATAAGTACAT TAACGTCGGG1981TCCGACGGCT CTGTGACCTG GGAGAGAGAC CCCAACCGCT CTACACTGTT CCCCCAACCG2041CACTACACTG TTCCCAAGAC ATGCGCCAGT ACTGCTACCC TCGATGACAC CTGGCAGTCT2101TGA本發(fā)明提供了編碼上述糖化酶的cDNA序列，全長1941bp，如SEQ ID NO. 4所示。
I ATGTACTTTG GGTCTTCTGC CTTTCTTCTC GGCTCATTCG CTCTTCAAAG CGTCTTGGGC61 CGACCAGCCT TCGATGAGAG GAGTCTCGTA CAAGAGAGAC AATCTTCGGT CGACTCCTTT121 ATCAAGTCTG AGACACCAAT TGCTCTTAAC AACCTCCTCT GCAATGTCGG CCCTGATGGC181 TGCCGCGCCT TCGGCACATC CAGCGGTGCT GTCATCGCTT CACCATCCCG CACGGATCCT241 GACTACTATT ACATGTGGAC TCGAGATTCC GCTCTAGTCT TCAAGCTGGT CATCGATAGG301 TTCACCAACC AGTATAACTC TGGCTTGCAG AGGCGCATCG AGCAATATAT CACCGCCCM361 GCCCGCCTCC AGGGTATTTC CAACCCTTCT GGGTCGCTTG CTGATGGCGC CGGTCTAGGA421 GAGCCCMGT TCGAACTTGA TATGAGCCAG TTCACTGGCG CTTGGGGTCG ACCCCAACGA
481 GATGGTCCAC CTCTGCGTGC GATCGCTCTG ATCACGTACG CCAAGTGGCT GATTGCCAAC541 GGCTACTCAT CCACGGCCAG CGACATTGTG TGGCCTATTG TTCGCAACGA TCTTAGCTAC601 GCGGCTCAAT ATTGGAACCA AACCGGATTT GACTTATGGG MGAGGTCAA CGGCAGTTCG661 TTCTTTACAA CTGGCTCCCA GTATCGAGCT CTCATTGAAG GTGCCGCTCT GGCCAAGAAG721 CTCGGCMGT CAGGAGACAA CTACTCCAAC ATCGCTCCTC AGGTTCTCTG CTTCCAGCAG781 TCTTTCTGGA TCTCTTCCGG CAAATACATC GACTCAAACA TCAATGTCAA CGAGGGCCGC841 AGCGGCMGG ACGTCAACAG TGTCCTGACA TCCATCCACA ATTTTGACCC TGCTCTGAGC901 TGTGATTCCG CCACATTCCA GCCATGCAGC GACAAGGCCC TCTCCAACCA CAAGGTTGTT961 GTCGACTCTT TCCGCTCATG GAACGTCAAC AAGGGTATCT CTCAAGGCTC AGCTGTCGCC1021 ATTGGACGAT ACGCTGMGA TGTCTACTAC AATGGCAACC CCTGGTACCT CGCTACGATG1081 GCCGCGGCAG AGCAACTCTA CGATGCCATT TACGTCTGGA AGAAGCAGGG ATCCATCACT1141 GTGTCGGACG TCTCTCTTTC GTTTTTCAAG GACCTCGTCT CTTCMTCTC TACCGGAACC1201 TACGCCAGCG ATTCCGCCAC CTTCACCAGC CTCATTAACG CCGTCTCCAA GTACGCTGAT1261 GGGTTTGTTG CTATCGTTGC MAGTATGCC GGCACAGATG GCCACCTCGC AGAGCAATTT1321 GACCGCMCA ACGGCCATCC TCTTTCTGCT ACAGACTTGA CTTGGTCATA TTCCGCATTC1381 CCCACCGCTA CTGCTCGTCG AGCTGGTATT GTTCCTCCTT CTTGGGCTGG TGGCGTGGCT1441 GCTGTTCCCA ACCAATGCGC TACCAATTCT GTTGTTGGTT CGTACTCATC GGCCACTGCA1501 ACTTCGCTCC CGGCATCGCA MCACCCAAG GGTGGTGTGC CCACTCCAAC TGGCACCCAG1561 ACTTCCACTT CCAGCTCGTC CACTAGCACC AGTTGCCCTA TTGCMCTTC TGTGCTCGTC1621 ACTTTCGAAG AGGTTGTCTC CACCAACTTT GGTCMACCA TCAAGATCGT TGGCAACGCC1681 GCTGCTCTCG GTAACTGGTC GACATCCGCC GCTGTTGCCC TGGACGCCTC AAACTATACC1741 TCCTCGMCC CTCTGTGGAT CGCTACCGTT TCCCTAACTG CAGGACAGTC TATTGAGTAT1801 AAGTACATTA ACGTCGGGTC CGACGGCTCT GTGACCTGGG AGAGAGACCC CAACCGCTCT1861 ACACTGTTCC CCCAACCGCA CTACACTGTT CCCAAGACAT GCGCCAGTAC TGCTACCCTC1921 GATGACACCT GGCAGTCTTG A其中，信號肽的堿基序列為ATGTACTTTGGGTCTTCTGC CTTTCTTCTCGGCTCATTCGCTCTTCAAAG CGTCTTGGGCDNA序列與cDNA序列比對分析結(jié)果表明糖化酶GLAD3的結(jié)構(gòu)基因glaD3全長2，103bp，含有 3 個內(nèi)含子，其序列分別為:245 - 298bp, 521 - 576bp 和 800 - 850bp, cDNA 長1941bp。本發(fā)明還提供了包含上述糖化酶基因glaD3的重組載體。優(yōu)選為pPIC9_glaD3。將本發(fā)明的糖化酶成熟蛋白編碼基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列，及載體信號肽序列相連接。作為本發(fā)明的ー個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將去除信號肽的糖化酶基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達質(zhì)粒 pPIC9_glaD3。本發(fā)明還提供了包含上述糖化酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株GS115/glaD3。本發(fā)明還提供了一種制備糖化酶的方法，包括以下步驟I)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組糖化酶基因的表達；以及3)回收并純化所表達的糖化酶。其中，優(yōu)選所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞、大腸桿菌細胞或絲狀真菌細胞，優(yōu)選將重組酵母表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞(Pichic pastoris) GS115,得到重組菌株 GS115/glaD3。本發(fā)明還提供了上述糖化酶的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一個新的糖化酶基因，其編碼的糖化酶具有極好的耐熱性，作用pH范圍廣，耐酸堿性，可在酒類和燃料酒精的生產(chǎn)、葡萄糖、果糖漿、有機酸、味精等食品エ業(yè)的等多個行業(yè)中使用。


圖I重組糖化酶的SDS-PAGE分析，I :蛋白質(zhì)Marker ；2 :畢赤酵母表達的未純化的糖化酶GLAD3 ；3 :純化的糖化酶GLAD3 ；4 endoH脫糖基化后的糖化酶GLAD3圖2糖化酶GLAD3的最適pH曲線。圖3糖化酶GLAD3的pH穩(wěn)定性曲線。圖4糖化酶GLAD3作用的最適溫度曲線。圖5糖化酶GLAD3的熱穩(wěn)定性曲線。
具體實施例方式實驗條件I、畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株GS115購自于Invitrogen公司。內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司?？扇苄缘矸圪徸許igma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。2、培養(yǎng)基
(I)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、O. 5%酵母提取物、l%NaCl，pH7. O)。(2) MM 固體培養(yǎng)基1. 34%YNB，0. 00004%Biotin, O. 5% 甲醇，I. 5% 瓊脂糖。(3) MD 固體培養(yǎng)基1. 34%YNB,0. 00004%Biotin，2% 葡萄糖，I. 5% 瓊脂糖。(4) BMGY 培養(yǎng)基1% 酵母提取物,2% 蛋白胨，I. 34%YNB,0. 00004%Biotin, 1% 甘油(V / V)。(5) BMMY培養(yǎng)基除以O(shè). 5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同。說明本發(fā)明中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技木。在以下實施例中未作詳細介紹的技術(shù)，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關(guān)章節(jié)或部分來進行，包括Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (果 3版· 2001) ；Kriegler, GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和 Current Protocols inMolecular Biology (Ausubel 等人編,1994)。實施例I糖化酶編碼基因glaD3的克隆提取Gibberella sp.D3 基因組 DNA:將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min,然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min,姆隔IOmin混勻一次,在4°C下IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后,4で下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清,沉淀用70%的こ醇洗漆兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于_20°C備用。根據(jù)第15家族糖化酶基因的保守WGRPQRDG和YDAV(I/L)YQ(V)W序列設(shè)計合成 了簡并引物 FP (5，-TGGGGHCGTCCDCARMGNGAYGG-3’)，RP (5，-CCACTRRTARAYNGCRTCRTA-3’ )(其中Y=C/T，R=A / G, M=A / C，H=A / C/T, N=A / T/G / C)。以Gibberella sp. D3總DNA為模板利用簡并引物FP和RP進行PCR擴增，得到約SOObp的片段，回收后與pEASY-T3載體相連，送北京三博生物技術(shù)有限公司進行序列測定。根據(jù)測定序列結(jié)果，在NCBI 的 GenBank 中利用 BLASTX [http://www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST]進行序列比對，初歩判斷該基因片段是糖化酶基因片段，并進行該片段的相似性研究。該片段長780bp,與Gibberella moniliformis來源的糖化酶的序列一致性最高為80%。根據(jù)測序得到的核甘酸序列，利用TAIL-PCR的方法，得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴增得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術(shù)有限公司測序。將簡并引物得到的核心片段與經(jīng)TAIL-PCR得到的側(cè)翼序列進行拼接得到glaD3全長基因。經(jīng)序列分析表明，該基因DNA為一個全長2103bp (SEQIN No. 3)的基因片段。實施例2糖化酶基因的RT-PCR分析提取Gibberella sp. D3的總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA的一條鏈，然后設(shè)計恰當(dāng)?shù)囊?GLAD3 F :5’-ATGTACTTTGGGTCTTCTGCCTTTCTTCTCGGC-3’ ,GLAD3 R :5’-TCMGACTGCCAGGTGTCATCGAGGGTAG-3')擴增該單鏈 cDNA,獲得糖化酶的 cDNA序列(SEQ IN No. 4),擴增得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術(shù)有限公司測序。糖化酶的基因組DNA序列和cDNA序列分析結(jié)果表明，糖化酶GLAD3的結(jié)構(gòu)基因全長2，103bp, cDNA長l，941bp。含有3個內(nèi)含子，其序列分別為245298bp, 521_576bp和800-850bp。N端20個氨基酸為其預(yù)測的信號肽序列。glaD3 cDNA序列編碼蛋白與GeneBank上的糖化酶序列進行同源比較，同Gibberella moniliformis的假定的糖化酶序列一致性最高，為78%。與Hypocrea Jecorina來源的糖化酶的一致性為72%。實施例3重組糖化酶的制備。將表達載體pPIC9進行雙酶切(EcoRI+Notl)，同時將編碼糖化酶的基因glaD3通過PCR去掉信號肽序列并加入酶切位點EcoRI和Notl，所用引物為(D3 F-s :5’ -CAAGAATI￡CGACCAGCCTTCGATGAGAGGAGTCTCGTAC-3’ ；D3 R:5’-CAAGCGGCCGCTCAAGACTGCCAGGTGTCATCGAGG-3’)，產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切，得到編碼成熟糖化酶的基因片段，并與表達載體PPIC9連接，獲得含有糖化酶基因glaD3的重組質(zhì)粒pPIC_GLAD3并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，涂布MD平板，3天后待菌落長出，用滅過菌的牙簽從長有轉(zhuǎn)化子的MD板上挑取單菌落，按照編號先點到麗上，再點到相應(yīng)編號的MD平板上30°C培養(yǎng)1 2天，至菌落長出。MD平板上能正常生長轉(zhuǎn)化子接種于裝有5mL BMGY培養(yǎng)基的離心管中，30°C、260rpm搖床培養(yǎng)48h后離心去上清，離心管中再加入ImL含有O. 5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基，在30°C、260rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后，離心取上清用于酶活性檢測，從中篩選出具有糖化酶活性的轉(zhuǎn)化子。獲得重組畢赤酵母菌株GS115/GLAD3。將酶活高的菌株重新接種于裝有400mL BMGY培養(yǎng)液中，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)48h后，離心收集菌體。然后于200mL BMMY培養(yǎng)基重懸，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)。誘導(dǎo)48h后，每隔24小時測定上清中糖化酶的活力并補加甲醇。SDS-PAGE結(jié)果(圖I)表明，重組糖化酶在畢赤酵母中得到了表達。按照上述過程構(gòu)建含未去除信號肽的序列的表達載體，重組畢赤酵母菌株，檢測到的重組糖化酶表達量較低。實施例4重組糖化酶的活性分析
在pH5.0，60°C條件下，ImL的反應(yīng)體系包括100 μ L適當(dāng)?shù)南♂屆敢海?00 μ L 1%可溶性淀粉，反應(yīng)IOmin,沸水煮3min。至冰上冷卻。釋放的葡萄糖的量用葡萄糖氧化酶的方法測定。I個酶活単位(U)定義為在給定的條件下毎分鐘釋放出Iymol葡萄糖的酶量。實施例5重組糖化酶GLAD3的性質(zhì)測定經(jīng)純化的糖化酶GLAD3在不同的pH下進行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。所用緩沖液為 pH 2. 0 8· O 的 O. lmol/L 的 McIlvaine 緩沖液，pH 8. 0-9. O 的 O. lmol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 9. 0-12. O的O. IM glycine-NaOH緩沖液。純化的糖化酶GLAD3在不同pH的緩沖體系，60°C下測定的pH適性結(jié)果(圖2)表明GLAD3的最適作用pH為5. 0，在pH4. 0-7. O能保持60%以上的酶活。將酶液在不同pH值的緩沖液中于37°C下處理lh，再測定酶活性以研究酶的pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明(圖3)，GLAD3在pH范圍為2. 0-12. O間都很穩(wěn)定。最適溫度的測定在ρΗ5· O的O. Imol / L的McIlvaine緩沖液體系及不同的溫度(3(T80°C)下進行酶促反應(yīng)。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果(圖4)表明，GLAD3的最適作用溫度60。。。測定糖化酶在60°C和70°C條件下分別保溫不同時間測定相對酶活力，繪制酶的熱穩(wěn)定性曲線。在60°C下，GLAD3熱穩(wěn)定性很好，處理60min后仍能保留近80%的酶活。70°C下處理lOmin，保留50%的酶活(圖5)。實施例6重組糖化酶GLAD3的水解生淀粉能力測定將生淀粉(紅薯，玉米，土豆)，分別配置成1%(終濃度，pH 5.0)的底物.。同時，分別以底物(紅薯，玉米，土豆)進行熟化處理，配置成1%(終濃度，PH 5.0)底物。4.5mL底物中加入500uL酶液，在40°C的水浴搖床反應(yīng)4h，將反應(yīng)產(chǎn)物進行12000rpm，5min離心處理。將其上清液進行100°C滅活，處理5min。通過葡萄糖試劑盒對其進行葡萄糖含量的檢測。測定生淀粉的轉(zhuǎn)化率。生淀粉轉(zhuǎn)化率(RDA) =A / B%A:降解生淀粉的活力B:降解熟淀粉的活力GLAD3對玉米和紅薯生淀粉的轉(zhuǎn)化率為11. 23%和7. 56，對土豆生淀粉的轉(zhuǎn)化率為5.64。具有很強的生淀粉水解能力。本發(fā)明通過PCR首先獲得了該糖化酶的DNA序列，然后根據(jù)DNA序列設(shè)計引物，通過反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA序列，DNA和cDNA序列經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)除3個內(nèi)含子區(qū)外完全一致。根 據(jù)本領(lǐng)域的公知常識，真核生物蛋白的編碼基因在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過修飾(即內(nèi)含子的剪切和外顯子的拼接)才能夠編碼蛋白。而DNA序列不能在異源宿主中直接表達。所以本發(fā)明獲得的cDNA序列及DNA在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過剪切加工后形成的。
權(quán)利要求
1.ー種可以降解生淀粉的糖化酶GLAD3，其特征在于，其具有如SEQ ID NO. I或SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列。
2.ー種糖化酶基因glaD3，其特征在干，編碼權(quán)利要求I所述的糖化酶。
3.如權(quán)利要求2所述的糖化酶基因glaD3，其特征在于，其基因序列如SEQIDNO. 3或SEQ ID NO. 4 所示。
4.包含有權(quán)利要求2所述糖化酶基因序列的重組表達載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為pPIC9-glaD3。
6.包含權(quán)利要求2所述糖化酶基因的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、釀酒酵母細胞、大腸桿菌、曲霉或木霉細胞，優(yōu)選為畢赤酵母細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求I酶GLAD3的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述糖化酶基因glaD3的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述糖化酶基因glaD3在エ業(yè)化生產(chǎn)糖化酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的可以降解生淀粉的糖化酶及其應(yīng)用。具體的，其具有如SEQID NO.1或2所示的氨基酸序列，提供了編碼上述糖化酶的基因，其具有如SEQ IDNO.3或4所示的核苷酸序列，以及包含該基因的重組載體、重組菌株和重組酶及其應(yīng)用。本發(fā)明的糖化酶具有以下性質(zhì):GLAD3的最適作用pH為5.0，在pH4.0-7.0能保持60%以上的酶活；在pH范圍為2.0-12.0間都很穩(wěn)定；最適作用溫度60℃；熱穩(wěn)定性好。
文檔編號C12N9/34GK102719419SQ20121022467
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月2日
發(fā)明者詹志春, 陶純長 申請人:武漢新華揚生物股份有限公司