專(zhuān)利名稱(chēng)：適應(yīng)全懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的mdck細(xì)胞系及其在培養(yǎng)流感病毒、生產(chǎn)流感病毒疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種MDCK細(xì)胞系及其應(yīng)用，特別涉及一種適應(yīng)全懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系及其在培養(yǎng)流感病毒、生產(chǎn)流感疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流感病毒疫苗的制備經(jīng)過(guò)了從動(dòng)物組織器官到細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)?；l(fā)展過(guò)程，動(dòng)物流感病毒的培養(yǎng)也經(jīng)歷了從雞胚向哺乳細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，從哺乳動(dòng)物細(xì)胞的微載體懸浮培養(yǎng)到全懸浮培養(yǎng)，從動(dòng)物源血清的培養(yǎng)到無(wú)動(dòng)物源血清或成分的培養(yǎng)的發(fā)展過(guò)程，并結(jié)合 離心純化以及柱層析純化，使動(dòng)物流感病毒或抗原生產(chǎn)方法的可控性提高，也減少了疫苗注射引起的應(yīng)急反應(yīng)。從采用的培養(yǎng)基上看，無(wú)動(dòng)物源血清或成分的培養(yǎng)基使得在病毒培養(yǎng)或疫苗生產(chǎn)中遭受外源污染的風(fēng)險(xiǎn)降低。盡管這樣，常用的用于培養(yǎng)流感病毒的細(xì)胞系仍存在各種缺點(diǎn)，因此仍無(wú)法滿(mǎn)足目前生產(chǎn)流感病毒疫苗的需求，例如MDCK具有致癌性，Vero, PER-C6的病毒產(chǎn)量較低。因此研究一種安全，高產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)將是現(xiàn)行流感疫苗工藝研究的重要問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株適應(yīng)全懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系，還提供了利用所述的細(xì)胞系培養(yǎng)流感病毒的方法。具體的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段本發(fā)明的一株適應(yīng)全懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系，命名為MDCK-ZL2012，分類(lèi)命名為狗腎細(xì)胞，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC No. 6210，保藏日期為2012年6月14日。本發(fā)明還提供了所述的MDCK細(xì)胞系在培養(yǎng)流感病毒和生產(chǎn)流感病毒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的一種培養(yǎng)流感病毒的方法，其特征在于包括以下步驟(I)將所述的MDCK細(xì)胞系接種于無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，得到MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液；(2)當(dāng)MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中的細(xì)胞密度達(dá)到I. OX IO6 7. OX IO7個(gè)/ml時(shí)，按照MOI O. 01-0. I接種流感病毒；(3)病毒液在32°C培養(yǎng)3-4天收獲病毒上清液，即得流感病毒液。在本發(fā)明中的一種培養(yǎng)流感病毒的方法中，其特征在于所述的流感病毒為人流感病毒、馬流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒或犬流感病毒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益之處在于I、本發(fā)明的一種適應(yīng)全懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞系能夠在無(wú)其它任何載體的情況下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，因此實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)密度的最大化，也減少了細(xì)胞培養(yǎng)的體積，減少了后續(xù)處理的勞動(dòng)強(qiáng)度，使得各個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)能等同或高出一般的貼壁培養(yǎng)，故而使生產(chǎn)流感病毒的效率提聞，減少了時(shí)間和成本。2、本發(fā)明的一種細(xì)胞系能夠在無(wú)動(dòng)物源性的血清或成分的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因而降低了培養(yǎng)動(dòng)物流感病毒時(shí)的外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)和在疫苗使用引起的應(yīng)急反應(yīng)，也使后續(xù)病毒處理如澄清、微濾、超濾、純化等步驟更加簡(jiǎn)單易行，減少了工作量，更易純化。


圖I為MDCK-ZL2012的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖；圖2為不同感染復(fù)數(shù)接種流感病毒后流感病毒復(fù)制的情況。
具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本實(shí)施例涉及的材料來(lái)源I、細(xì)胞MDCK細(xì)胞購(gòu)自ATCC ；2、病毒禽流感病毒H5N2、禽流感病毒H1N1，A/鹽山/01/2012H5N1、A/唐山/02/2012，H5N1A/邢臺(tái)/03/2012購(gòu)自中國(guó)疾病控制中心病毒病控制所。培養(yǎng)基MEM HAM和F12培養(yǎng)基購(gòu)買(mǎi)自Invitogen公司，酵母或豆類(lèi)提取物購(gòu)買(mǎi)自Invitogen 公司實(shí)施例I適應(yīng)全懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系的制備I、MDCK細(xì)胞在無(wú)血清或無(wú)動(dòng)物源性的成分的培養(yǎng)基進(jìn)行適應(yīng)和馴化，培養(yǎng)基是MEM HAM和F12培養(yǎng)基的混合物，其中加入I. 5g/L Na2CO3無(wú)機(jī)鹽以及4. Og/L (O. 5_8g/L都可)的酵母或豆類(lèi)提取物。2、MDCK細(xì)胞以方瓶、轉(zhuǎn)瓶按照1:4或1:6的方式擴(kuò)大培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)5飛天，氧飽和度20%ο3、傳代2-4代，得到明顯適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞，用O. 25%胰蛋白酶+0. 02%的EDTA在室溫消化分散。4、分散后的MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)推遲，代次周期延至7_9天，傳至30_50代次細(xì)胞趨于穩(wěn)定，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖I所示。5、生物反應(yīng)器中細(xì)胞培養(yǎng)密度的測(cè)定(個(gè)/ml)。用胰酶消化細(xì)胞培養(yǎng)液并用細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞密度進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了 3次，其結(jié)果如表I所示表I全懸浮細(xì)胞培養(yǎng)密度的測(cè)定
權(quán)利要求
1.一株適應(yīng)全懸浮無(wú)血清培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系，命名為MDCK-ZL2012，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為=CGMCC No. 6210。
2.權(quán)利要求I所述的MDCK細(xì)胞系在培養(yǎng)流感病毒中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述的MDCK細(xì)胞系在生產(chǎn)流感病毒疫苗中的應(yīng)用。
4.一種培養(yǎng)流感病毒的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)將權(quán)利要求I所述的MDCK細(xì)胞系接種于無(wú)血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，得到MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液；(2)當(dāng)MDCK細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液中的細(xì)胞密度達(dá)到I.OX IO6 7. OX IO7個(gè)/ml時(shí)，按照MOIO.01-0. I接種流感病毒； (3)病毒液在32°C培養(yǎng)3-4天收獲病毒上清液，即得流感病毒液。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的流感病毒為人流感病毒、馬流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒或犬流感病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株適應(yīng)全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系及其在培養(yǎng)流感病毒、生產(chǎn)流感病毒疫苗中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的一株適應(yīng)全懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系，命名為MDCK-ZL2012，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC No.6210。本發(fā)明還提供了利用所述的細(xì)胞系培養(yǎng)流感病毒的方法。本發(fā)明所提供的MDCK細(xì)胞系實(shí)現(xiàn)了MDCK細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中的全懸浮培養(yǎng)，因而采用本發(fā)明的MDCK細(xì)胞系進(jìn)行流感病毒的培養(yǎng)，一方面增加了流感抗原病毒的產(chǎn)量，降低了流感病毒生產(chǎn)的成本，另一方面也降低了培養(yǎng)流感病毒時(shí)的外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)和在疫苗使用引起的應(yīng)急反應(yīng)，也使后續(xù)病毒處理如澄清、微濾、超濾、純化等步驟更加簡(jiǎn)單易行。
文檔編號(hào)C12N7/00GK102816732SQ20121022440
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者張澍, 呂宏亮 申請(qǐng)人:北京健翔和牧生物科技有限公司, 山西隆克爾生物制藥有限公司