一種過表達ciapin1蛋白的細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用；該細(xì)胞系名稱為BHK-21CIAPIN1+，保藏編號為CCTCCC2014149，其表達CIAPIN1蛋白的量是正常BHK-21細(xì)胞的10倍；該細(xì)胞系的制備方法為將CIAPIN1的cDNA序列插入真核表達質(zhì)粒pIRESneo中，再轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞；經(jīng)含G418培養(yǎng)液篩選后細(xì)胞經(jīng)極限稀釋法獲得陽性單克隆細(xì)胞，即為永生化過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系。本發(fā)明細(xì)胞系培養(yǎng)狂犬病病毒可顯著影響病毒增值滴度，對該病毒的高效培養(yǎng)及其滅活疫苗的生產(chǎn)意義重大，本發(fā)明細(xì)胞系在狂犬病病毒的培養(yǎng)中具有很好的應(yīng)用前景。
CCTCC NO:C2014149
20140730
【專利說明】—種過表達CIAPI NI蛋白的細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]CIAPIN I (cytokine induced apoptosis inhibitor I)又稱 anamorsin,是一個新近發(fā)現(xiàn)與凋亡相關(guān)的分子。CIAPIN I在人類基因定位于16號染色體長臂。由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成，相對分子質(zhì)量為39000。在其N端60-99氨基酸位點發(fā)現(xiàn)genericmethyl transferase profile結(jié)構(gòu)域，C端部分序列與保守的基因C0G5636同源,246-277氨基酸有Cx2Cx24Cx2C鋅帶結(jié)構(gòu)域。CIAPIN I在小鼠基因定位于8號染色體，成熟mRNA長度為 1515bp, CDS 長度為 929bp。
[0003]Shibayama等2004年第一次報道了該分子為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的抗凋亡分子。研究還表明CIAPIN I是RAS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個新調(diào)節(jié)分子，Ras信號途徑是與許多細(xì)胞增殖有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路獨立于凋亡調(diào)節(jié)分子caspase家族、Bcl_2家族等。Kanakura等發(fā)現(xiàn)CIAPIN I可調(diào)節(jié)造血功能，CIAPIN I基因在小鼠胚胎期IL-3誘導(dǎo)紅系定向干細(xì)胞分化過程中起至關(guān)重要的作用，CIAPIN I基因敲除小鼠由于于貧血而于胚胎期死亡。新近研究在成功制備了 CIAPIN I的單克隆抗體工作基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)CIAPIN I廣泛分布于胎兒和成人的正常組織中，特別是在分化型組織和活性代謝組織中具有高表達。Hao等確定了CIAPIN I的亞細(xì)胞定位為胞質(zhì)、胞核，濃集于核仁。Li等通過腺病毒載體表達CIAPIN I蛋白，以及通過SiRNA等技術(shù)證明了，CIAPIN I蛋白的表達變化與肝細(xì)胞癌、胃癌密切相關(guān)。Hao等研究發(fā)現(xiàn)CIAPIN I蛋白與腎癌、胃癌相關(guān)。Wang等人發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中CIAPIN I基因表達下調(diào)可能與肺癌發(fā)生密切相關(guān)，CIAPIN I基因可能通過下調(diào)CyclinD 1、上調(diào)P27干預(yù)了細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤的生長。上述研究結(jié)果揭示，CIAPIN I對細(xì)胞的增殖及分化具有重要的調(diào)控作用，在某些癌癥發(fā)生時表達異常，提示CIAPIN I基因的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。
[0004]目前，關(guān)于CIAPIN1研究的報道還非常有限，主要集中在腫瘤相關(guān)性方面，然而這些結(jié)果業(yè)已證明CIAPIN I對細(xì)胞的增殖及分化具有重要的調(diào)控作用，在細(xì)胞凋亡與抗凋亡中發(fā)揮重要作用。在前期的研究中，我們也發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染N2a細(xì)胞時可引起CIAPIN1蛋白上調(diào)表達，并且細(xì)胞適應(yīng)性好的RV毒株感染時誘導(dǎo)的CIAPIN1蛋白上調(diào)表達量更高。這提示我們，不同細(xì)胞適應(yīng)性的RV毒株，感染細(xì)胞時在細(xì)胞內(nèi)增殖和代謝的速度不同，因而引起了不同的應(yīng)答結(jié)果，導(dǎo)致CIAPIN1等蛋白的差異表達，這說明RV感染時CIAPIN1發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系的制備方法。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供一種過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種過表達CIAPIN1蛋白細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟:
O構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒=RT-PCR擴增CIAPIN1蛋白的cDNA序列，并將其插入真核表達質(zhì)粒PlRESneo中，獲得重組真核表達質(zhì)粒pIRES_CI ；
2)轉(zhuǎn)染:將上述重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞；
3)篩選:將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以含G418的培養(yǎng)液進篩選培養(yǎng)；
4)獲得永生化過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系:將經(jīng)篩選培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)極限稀釋法獲得陽性單克隆細(xì)胞，其中能過表達CIAPIN1蛋白的即為永生化過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系。
[0009]進一步的，步驟I)中編碼CIAPIN1蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0010]進一步的，上述CIAPIN1蛋白cDNA的RT-PCR擴增引物為:
CIAPIN1-F: GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC (SEQ ID NO:2)；
CIAPIN1-R: GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT (SEQ ID NO:3)。
[0011]進一步的，步驟2)中的轉(zhuǎn)染為:用FuGENE轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)重組真核表達質(zhì)粒PlRES-CI傳染匯合度為70-80%的單層BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用含5?10%(V/V)小牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
[0012]進一步的，步驟3)中G418的濃度為500μ g/ml。
[0013]一種過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系，其名稱為BHK-21 CIAPIN1+，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC C2014149。
[0014]進一步的，上述細(xì)胞系表達CIAPIN1蛋白的量是BHK-21細(xì)胞的8倍。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
I)本發(fā)明的細(xì)胞系可永久化的高量表達CIAPIN1蛋白，且易培養(yǎng)，增殖速度快，可無限擴大，性質(zhì)穩(wěn)定，易保存，方法技術(shù)成熟，重復(fù)性強，一般研究人員即可完成，具有遺傳穩(wěn)定性。
[0016]2)本發(fā)明過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系及其制備方法具有深遠(yuǎn)的研究性和廣泛的應(yīng)用性，包括研究宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)具有穩(wěn)定性以及可表達所需蛋白的哺乳動物細(xì)胞的永生化，以及細(xì)胞和CIAPIN1蛋白對狂犬病病毒增殖滴度的影響。
[0017]3)在制備過表達CIAPIN1蛋白細(xì)胞系的具體操作中，細(xì)胞攝取、整合、表達外源基因往往都是小概率事件，只有在特定的操作條件下才能提高這些小概率事件的發(fā)生；另外，外源基因整合到基因組中的概率小，而且是隨機整合到基因組中的，故轉(zhuǎn)染后的不同細(xì)胞表達的目的蛋白的量存在很大差異，且隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達目的基因的細(xì)胞會占據(jù)優(yōu)勢，強表達目的蛋白的細(xì)胞會越來越少；本發(fā)明方法通過優(yōu)化每一步的操作，明顯提高了基因重組細(xì)胞系的發(fā)生率，可獲得許多高表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系；并且經(jīng)過篩選和驗證，本發(fā)明獲得一株超高表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系(表達量是BHK-21細(xì)胞的8倍)，其分類命名為敘利亞倉鼠腎細(xì)胞系BHK-21 CIAPIN1+,已于2014年7月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏單位地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC N0:C2014149，經(jīng)過多代的代培養(yǎng)仍具有走超高效的過表達CIAPIN1蛋白能力，且穩(wěn)定性很好，是一株永久化過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是G418壓力篩選出的單克隆細(xì)胞株圖；
圖2 Western Blot檢測驗證細(xì)胞系過表達CIAPIN1蛋白的情況。

【具體實施方式】
[0019]一種過表達CIAPIN1蛋白細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟:
O構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒=RT-PCR擴增CIAPIN1蛋白的cDNA序列，并將其插入真核表達質(zhì)粒PlRESneo中，獲得重組真核表達質(zhì)粒pIRES_CI ；
2)轉(zhuǎn)染:將上述重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞；
3)篩選:將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以含G418的培養(yǎng)液進篩選培養(yǎng)；
4)獲得永生化過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系:將經(jīng)篩選培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)極限稀釋法獲得陽性單克隆細(xì)胞，其中能過表達CIAPIN1蛋白的即為永生化過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系。
[0020]優(yōu)選的，步驟I)中編碼CIAPIN1蛋白的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0021]優(yōu)選的，CIAPIN1蛋白cDNA的RT-PCR擴增引物為:
CIAPIN1-F: GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC (SEQ ID NO:2)；
CIAPIN1-R: GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT (SEQ ID NO:3)。
[0022]優(yōu)選的，步驟2)中的轉(zhuǎn)染為:用FuGENE轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)重組真核表達質(zhì)粒pIRES-CI傳染匯合度為70-80%的單層BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用含5_10%(v/v)小牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行恢復(fù)培養(yǎng)。
[0023]優(yōu)選的，步驟2)轉(zhuǎn)染時的具體操作為:選用0D26(i/0D28(i為1.8?2.0的重組真核表達質(zhì)粒pIRES-CI，先將pIRES-CI與FuGENE按質(zhì)量體積比10 μ g:24 μ L混勻孵育30min后，再加入至匯合度為75%的單層BHK-21細(xì)胞中，輕晃搖勻，37°C，5% CO2飽和濕度轉(zhuǎn)染培養(yǎng)5?12h后，換成含5% (v/v)血清的DMEM培養(yǎng)基進行恢復(fù)培養(yǎng)40?50小時使細(xì)胞貼壁，每隔24h換一次培養(yǎng)基。
[0024]優(yōu)選的，步驟3)中G418的濃度為500 μ g/ml。
[0025]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0026]實施例1重組pMD-CI克隆載體的構(gòu)建和測序 1、寡核苷酸引物的設(shè)計與合成
根據(jù)GenBank中CIAPIN1核苷酸序列設(shè)計并合成克隆CIAPIN1 cDNA的引物: CIAPIN1-F: 5，-GATATCATGGAGGAGTTTGGGATCTCC』，(下劃線部分為 EcoR V 酶切位點)； CIAPIN1-R: 5，-GAATTCCTAGGCATCCTGGAGATTGCTAT-3，(下劃線部分為 EcoR I 酶切位點)。
[0027]2、BHK-21細(xì)胞總RNA的提取
50ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶的BHK-21細(xì)胞(乳倉鼠腎細(xì)胞,Baby Hamster Syrian Kindey)直接加ImL Trizol,室溫放置5min,使其充分裂解，12 000r/min離心5min,取上清,按200 μ L氯仿/mL Trizol加入氯仿,振蕩混勻室溫放置15min,4°C 12 000r/min離心15min,吸上清,至另一離心管中，按0.5mL異丙醇/mL Trizol加入異丙醇混勻，室溫放置5?1min, 4°C 12000r/min離心1min,棄上清,RNA沉于管底。按ImL 75%乙醇/mT, Trizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，4°C 12 OOOr/min離心1min,棄上清，室溫干燥后,加20μ L RNase-free的水溶解，一 80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0028]3、CIAPIN1基因片段全長cDNA合成
總 RNA 5μ L，70°C加熱 lOmin，冰浴 5min，加 200U 反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，25pmol/μ L 引物 F、25pmol/y L 引物 R 以及 10mmol/L dNTPs 各 I μ L，42°C反應(yīng) 60min，即得到 cDNA。70°C水浴1min,滅活反轉(zhuǎn)錄酶。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 10 μ L, 1XPCR buffer 4 μ L>25mmol/L MgCL24 μ L>引物 CIAPIN1-F (25pmol/y L)、CIAPIN1-R (25pmol/μ L)及 lOmmol/L dNTPs 各 0.5 μ L，加水30 μ L，煮沸變性1min,冰浴5min,加Taqplus DNA聚合酶0.25 μ L (5U/ μ L)混勻，具體反應(yīng)條件為94°C變性30sec，57°C退火40sec、72°C延伸90sec，25個循環(huán)后72°C再延伸1min,以1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴增效果。
[0029]4、重組pMD-CI載體的構(gòu)建和驗證
將獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后直接克隆至pMD18-T載體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。通過氨芐青霉素抗性篩選，獲得重組質(zhì)粒命名為pMD-CI。經(jīng)酶切和PCR初步鑒定后，陽性重組質(zhì)粒送交大連寶生物工程公司進行序列測定。
[0030]實施例2重組真核表達載體pIRES-CI的構(gòu)建 1、目的片段回收
稱取Ig瓊脂糖于10mL IXTAE中加熱溶解；冷卻至40_50°C時加入終濃度(V/V)為
0.1%的EB，混勻后倒膠；插入膠回收齒梳，室溫冷卻備用；將上樣混合物(90 μ L CIAPIN1cDNA的PCR產(chǎn)物+1yL 1XLoading Buffer)加于上樣孔中。以5V/cm的電壓，電泳至所需時間后，取出凝膠，在透射紫外燈上觀察，或拍照。在紫外燈下切下目的條帶，反復(fù)凍融3次，碾碎，分別用酚、氯仿抽提，無水乙醇沉淀，75%乙醇洗漆，溶于適量的水中，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0031]2、目的片段與真核表達載體pIRESneo的連接反應(yīng)
取約20ng用限制性內(nèi)切酶水解的載體，加5?10倍量的目的DNA片段、10 X連接緩沖液I μ L，加蒸餾水至10 μ L，最后加入0.1?0.2weiss單位的T4DNA連接酶，置16°C水浴過夜，取0.5-1 μ L連接反應(yīng)液熱激轉(zhuǎn)化疋coli感受態(tài)細(xì)胞。粘端連接，載體與片段的摩爾比約為1:5 ;平端連接，載體與片段的摩爾比約為1:8 ;PCR產(chǎn)物與pIRESneo載體的連接，載體與片段的摩爾比約為1:8。
[0032]3、重組真核表達載體pIRES-CI的驗證
將上述轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞進行篩選培養(yǎng)，挑取陽性菌落擴大培養(yǎng)，然進行酶切、PCR和測序驗證，驗證正確的陽性重組質(zhì)粒即為重組真核表達載體pIRES-CI。
[0033]實施例3過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系的建立
1、FuGENE介導(dǎo)pIRE-CI真核表達載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞
I)準(zhǔn)備質(zhì)粒:重組質(zhì)粒PlRE-CI經(jīng)苯酚/氯仿反復(fù)抽提純化，紫外分光光度計測其OD26tZOD28tl為1.8?2.0，質(zhì)粒用前需過濾除菌。
[0034]2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的準(zhǔn)備:在370C >5% CO2條件下培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞18_24h，待細(xì)胞匯合度為75%時，開始轉(zhuǎn)染。
[0035]3)脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的制備:在500yL無菌Eppendorf管中配液。A液:將10 ygDNA稀釋于250 μ L無血清無雙抗的MEM培養(yǎng)其中。B液:將24 μ L FuGENE稀釋于250 μ L無雙抗無血清的MEM培養(yǎng)基中?；旌螦B兩液，輕微震蕩，充分混勻后，室溫放置30min,獲得脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，此時如果溶液渾濁，不影響轉(zhuǎn)染。如果出現(xiàn)沉淀，則停止轉(zhuǎn)染。
[0036]4)在DNA和FuGENE作用過程中，將匯合度為75%的細(xì)胞用無血清無雙抗的MEM培養(yǎng)基清洗三次，加入2mL無血清無雙抗的MEM培養(yǎng)基，然后將作用完畢的DNA/FuGENE混合物，加入到細(xì)胞上清中，輕晃搖勻，37°C，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)5?12h后，換入含5% (v/v)血清的DMEM培養(yǎng)基。
[0037]2、G418抗性細(xì)胞的篩選
轉(zhuǎn)染后的BHK-21細(xì)胞在37°C，5% CO2培養(yǎng)36小時，再傳入6孔板中(轉(zhuǎn)入6孔板前，細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng))，12h后，待細(xì)胞貼壁后，加入G418濃度為500 μ g/ml的MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每三天換一次液，直至出現(xiàn)細(xì)胞克隆。
[0038]3、獲得永生化過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系:
將6孔板中每孔加入含5%血清的MEM培養(yǎng)基，把長出細(xì)胞克隆的6孔板，在燈光下觀察，可見單個細(xì)胞克隆(如圖1所示)，呈明顯的不透明狀，用記號筆畫圈標(biāo)記克隆的位置，在超凈工作臺上用無菌槍頭挑取細(xì)胞克隆，打入96孔板，進行極限稀釋法，依次傳入24孔板，6孔板，30mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶，逐步擴大培養(yǎng)，擴大培養(yǎng)時，保持G418的濃度，血清添加量為5% (v/v)。
[0039]實施例4過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系的RT-PCR鑒定
提取過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系總RNA，方法同實施例1，并對總RNA進行定量，選取同樣模板數(shù)量RNA進行RT-PCR。RT-PCR步驟同實施例1，對擴增結(jié)果進行半定量比較，選取PCR條帶結(jié)果明顯高于正常對照的組別為過表達細(xì)胞系。
[0040]在實驗探索過程中，參考了許多真核細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法，尤其是有關(guān)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化BHK-21細(xì)胞過表達目的蛋白的實驗方法，不僅獲得陽性單克隆細(xì)胞的概率低，而且假陽性高，即獲得正確的含目的基因的重組BHK-21細(xì)胞，但RT-PCR檢測顯示細(xì)胞內(nèi)目的基因RNA表達量與正常的BHK-21細(xì)胞相比，并沒有明顯的增加，不具有后續(xù)的利用價值。
[0041]本發(fā)明方法，在現(xiàn)在技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用特定的引物、特定的轉(zhuǎn)染方法(尤其是轉(zhuǎn)染時各細(xì)節(jié)的控制)、特定的G418篩選濃度等特定條件參數(shù)，才能最有利于cDNA插入宿主細(xì)胞基因組中，提高了轉(zhuǎn)染率，顯著促進了出現(xiàn)具有高表達效果重組細(xì)胞系的概率。
[0042]實施例5過表達單克隆細(xì)胞系的Western Blot鑒定
1、蛋白質(zhì)樣品的制備
棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS漂洗兩次；空干細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的所有液體，槍抽；加入RIPA細(xì)胞裂解液(華特生H10200 107細(xì)胞/mL) ；4°C放置，間斷顛倒，至細(xì)胞完全脫落；每隔5?6分鐘振蕩器輕柔振蕩一次，共4次；10，000Xg，4°C離心5分鐘，取上清；分裝，標(biāo)記，-80 V凍存?zhèn)溆谩?br> [0043]2、蛋白質(zhì)樣品的定量
使用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒對各個所篩選的細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品進行定量，依照說明書進行。
[0044]3、過表達單克隆細(xì)胞系的Western Blot鑒定
配制15%的SDS-PAGE分離膠，迅速在兩玻璃板的間隙中灌注，留出灌注積層膠所需空間，并在分離膠溶液上覆蓋一層0.1% SDS，待分離膠完全聚合后傾出覆蓋層液體，用去離子水洗滌數(shù)次以除去未聚合的丙烯酰胺，之后用濾紙將殘留液體吸凈，同時將配制好的5%的積層膠灌注并立即插入干凈的TefLon梳子，積層膠聚合后小心拔出梳子，用電泳緩沖液小心沖洗電泳孔道。將制備的適量體積的質(zhì)粒和等體積2X上樣緩沖液混合后在100°C加熱5min以使混雜在質(zhì)粒中的細(xì)菌蛋白質(zhì)變性，用微量進樣器上樣，3(^g樣品和低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ;對稱依次再加相同的樣品，然后用IX上樣緩沖液補齊后按8V/cm進行電泳，待染料前沿進入分離膠時將電壓提高到15V/cm，直至染料到達分離膠底部，關(guān)閉電源，小心取出凝膠并切除積層膠，然后在中間將凝膠切開，標(biāo)記后分別用考馬思亮藍和銀鹽進行染色。
[0045](I)將真核過表達CIAPIN1的細(xì)胞經(jīng)SDS-PAGE電泳，方法同上。
[0046](2)電轉(zhuǎn)移切出含待轉(zhuǎn)移的凝膠，包括寬分子量預(yù)染蛋白Marker，剪6張同樣大小的濾紙和I張硝酸纖維素膜，將它們浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，在塑料支架上依次疊放濕潤的海綿、3層濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜、3層濾紙和海綿，使其相互對齊，且各層之間無氣泡存在，將支架加緊插入電泳槽中，硝酸纖維素膜一側(cè)接陽極，凝膠一側(cè)接陰極，32V電壓4°C轉(zhuǎn)移14?16h。
[0047](3)封閉電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，加封閉液浸泡硝酸纖維素膜，室溫封閉2小時或4°C過夜，同時對凝膠染色，檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全。封閉后用洗滌緩沖液漂洗硝酸纖維素膜3次，每次5min。
[0048](4)與一抗結(jié)合根據(jù)上樣孔位置將硝酸纖維素膜切割成條，蛋白Marker纖維素膜條置于不含吐溫的洗滌液中，留存?zhèn)溆谩Ｆ渌D(zhuǎn)印陰性對照(BHK-21細(xì)胞)，然后與1:200倍稀釋的CIAPIN1抗體(Santa Clusz)于室溫平緩搖動反應(yīng)2?4h，回收抗體，將纖維素膜浸泡于大量洗滌緩沖液中，平緩搖動洗滌3次，每次lOmin。
[0049](5)與二抗結(jié)合以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為第二抗體，分別與相應(yīng)纖維素膜條反應(yīng)。用洗滌緩沖液1:5 OOO稀釋酶標(biāo)二抗，將膜浸泡在二抗反應(yīng)液中，室溫平緩搖動反應(yīng)2?4小時或4°C過夜，回收二抗，洗膜，方法同(4)。
[0050](6 )顯色TMB顯色液至適當(dāng)，拍照。
[0051]Western Blot結(jié)果如圖2所示，圖2A為2株(I號和2號)正常BHK-21細(xì)胞以及6株(3?8號)不同的G418抗性壓力篩選的BHK-21細(xì)胞系GAPDH內(nèi)參蛋白Western Blot結(jié)果；圖2B為Western Blot檢測2株(I號和2號)正常BHK-21細(xì)胞對照以及G418抗性壓力篩選出的6株(3?8號)不同細(xì)胞系中CIAPIN1蛋白的表達情況；M為蛋白質(zhì)Marker，綜合比較圖A和B，與對照組相比(I號和2號)可知，只有3、4、5號細(xì)胞系中CIAPIN1蛋白具有較明顯的過表達現(xiàn)象，其中5號的過表達效果最明顯，通過定量分析5號的CIAPIN1蛋白表達量是對照組的8倍，該細(xì)胞系命名為BHK-21 CIAPINi+,已于2014年7月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC C2014149。
[0052]從上述結(jié)果可以看出，要獲得超高表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系的概率是非常低的；因為①外源基因進入細(xì)胞后，部分能夠通過細(xì)胞質(zhì)進入細(xì)胞核內(nèi)，根據(jù)細(xì)胞類型，至多80%的進入核內(nèi)的外源DNA得到瞬時表達極少數(shù)情況下，進入細(xì)胞的外源DNA通過系列非同源性分子間重組核連接，最終整合進細(xì)胞染色體，細(xì)胞基因組自由部分表達，所以整合并不一定意味著表達，只有整合到表達區(qū)的基因才會表達，而且整合到不同的染色體區(qū)段的外源基因的表達的量也是不同的，③而且隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，那些丟失了外源基因的細(xì)胞和很少表達目的基因的細(xì)胞會占據(jù)優(yōu)勢，強表達目的蛋白的細(xì)胞會越來越少。由于攝取、整合、表達外源基因都是小概率事件，所以獲得高表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系更是小概率事件，只有通過優(yōu)化每一步的操作，才能促進這種小小概率事件發(fā)生。
[0053] 應(yīng)用
目前，關(guān)于CIAPIN1研究的報道還非常有限，主要集中在腫瘤相關(guān)性方面，然而這些結(jié)果業(yè)已證明CIAPIN I對細(xì)胞的增殖及分化具有重要的調(diào)控作用，在細(xì)胞凋亡與抗凋亡中發(fā)揮重要作用。在前期的研究中，我們也發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染N2a細(xì)胞時可引起CIAPIN1蛋白上調(diào)表達，并且細(xì)胞適應(yīng)性好的RV毒株感染時誘導(dǎo)的CIAPIN1蛋白上調(diào)表達量更高。這提示我們，不同細(xì)胞適應(yīng)性的RV毒株，感染細(xì)胞時在細(xì)胞內(nèi)增殖和代謝的速度不同，因而引起了不同的應(yīng)答結(jié)果，導(dǎo)致CIAPIN1等蛋白的差異表達，這說明RV感染時CIAPIN1發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。那么過表達CIAPIN1蛋白的細(xì)胞系在狂犬病病毒的培養(yǎng)中具有很好的應(yīng)用前景，使用本發(fā)明過表達CIAPIN1蛋白的BHK-21細(xì)胞系培養(yǎng)狂犬病病毒可顯著影響病毒增值滴度，這可能對狂犬病病毒的高效培養(yǎng)及其滅活疫苗的生產(chǎn)意義重大。
【權(quán)利要求】
1.一種過表達(:1八?1附蛋白細(xì)胞系的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒:奶-？0？擴增八?I附蛋白的⑶嫩序列，并將其插入真核表達質(zhì)粒？1即31160中，獲得重組真核表達質(zhì)粒⑷卩四-口 ； 2)轉(zhuǎn)染:將上述重組真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染8^-21細(xì)胞； 3)篩選:將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以含6418的培養(yǎng)液進篩選培養(yǎng)； 4)獲得永生化過表達八?I附蛋白的細(xì)胞系:將經(jīng)篩選培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)極限稀釋法獲得陽性單克隆細(xì)胞，其中能過表達八?爪1蛋白的即為永生化過表達八?I附蛋白的細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟1)中編碼八?1附蛋白的⑶嫩序列如820 10勵:1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于八?1附蛋白⑶嫩的奶-？0？擴增引物為:
?:1八？1X1-？: 6^1^X0^X66^66^6X1X666^X0X00 (820 10 勵:2)；
?:1 八？爪1-尺:6^11001^660^100166^11601^1 (820 10 ^0:3?0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟2)中的轉(zhuǎn)染為:用而⑶肥轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)重組真核表達質(zhì)粒傳染匯合度為70-80%的單層8皿-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用含5109()(7/4小牛血清的0121培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟3)中6418的濃度為500^邑/1111。
6.權(quán)利要求1所述的一種過表達八?I[蛋白的細(xì)胞系，其名稱為8皿-21已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏編號為⑶!!!: 02014149。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種過表達八?I附蛋白的細(xì)胞系，其特征在于:該細(xì)胞系表達仙I附蛋白的量是8皿-21細(xì)胞的8倍。
8.權(quán)利要求1?7任一所述的過表達八?I附蛋白的細(xì)胞系在狂犬病病毒培養(yǎng)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/85GK104450781SQ201410547146
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】王曉虎, 向華, 黃元, 陳晶, 陳遠(yuǎn)媚 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所