一種糖化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種糖化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，屬于微生物發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為每1L水中含葡萄糖80～100g、有機(jī)氮與無機(jī)氮混合氮源61～63g，pH為5.3～5.5；所述有機(jī)氮為玉米漿與黃豆餅粉，無機(jī)氮為硝酸鹽，所述玉米漿、黃豆餅粉與硝酸鹽的質(zhì)量比為30∶30∶1～3，本發(fā)明有益效果為有效提高糖化酶發(fā)酵中糖化酶的產(chǎn)率。
【專利說明】一種糖化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種糖化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法，屬于微生物發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖淀粉酶因其常作為淀粉糖化劑而得名糖化酶。該酶從淀粉分子的非還原性末端開始依次水解α -1, 4糖苷鍵，釋放β -D-葡萄糖，也能緩慢水解α -1，6、a -1, 3糖苷鍵。廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵和制糖等行業(yè)，產(chǎn)量大、應(yīng)用廣。
[0003]葡萄糖淀粉酶多來源于微生物，廣泛存在于細(xì)菌(含古細(xì)菌)、酵母菌和真菌中。國內(nèi)外多采用曲霉、根霉為糖化酶生產(chǎn)菌，因為其產(chǎn)糖苷轉(zhuǎn)移酶的活性較低，糖化酶催化活性較高，而且在接近中性環(huán)境下，糖化酶的催化活性和熱穩(wěn)定性較強(qiáng)。我國糖化酶工業(yè)生產(chǎn)菌以黑曲霉、根霉為主，也曾使用過特有的紅曲霉，國外主要為黑曲霉、泡盛曲霉和臭曲霉等。
[0004]氮源是細(xì)胞進(jìn)行生長和代謝不可缺少的營養(yǎng)元素，也是酶分子的重要組成部分。工業(yè)生產(chǎn)中常用的有機(jī)氮源有玉米漿、蛋白胨、黃豆粉、花生餅粉等，常用的無機(jī)氮源有銨鹽、硝酸鹽和尿素。在以米糠為基質(zhì)的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵糖化酶培養(yǎng)中，添加適量玉米漿、蛋白胨和銨鹽都能提高糖化酶產(chǎn)量。向含玉米粉、玉米漿、麩皮和豆柏粉的培養(yǎng)基中添加硫酸銨，提高了黑曲霉AS3.4309液態(tài)產(chǎn)糖化酶活力。
[0005]參考文獻(xiàn):
[0006][1]Pandey A,Selvakumar P,Ashakumary L.Glucoamylase production byAspergillus niger on rice bran is improved by adding nitrogen sources[J].WorldJournal of Microbiology and Biotechnology,1994, 10:348-349 ；
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明通過改進(jìn)糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，使糖化酶產(chǎn)率提高。
[0011]本發(fā)明提供了一種糖化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為每IL水中含葡萄糖80~100g、有機(jī)氮與無機(jī)氮混合氮源61~63g, pH為5.3~5.5 ;
[0012]所述有機(jī)氮為玉米漿與黃豆餅粉，無機(jī)氮為硝酸鹽，所述玉米漿、黃豆餅粉與硝酸鹽的質(zhì)量比為30:30:1~3。
[0013]本發(fā)明所述玉米漿優(yōu)選為工業(yè)級玉米漿，玉米漿濃度為36~40%，玉米漿蛋白質(zhì)含量為38~42%。[0014]本發(fā)明所述黃豆餅粉優(yōu)選為冷榨黃豆餅粉，黃豆餅粉粒度為80~100目，黃豆餅粉蛋白質(zhì)含量為42~46%，黃豆餅粉水分為8~12%，黃豆餅粉酸價小于4 (KOH)/ (mg/g)。
[0015]本發(fā)明所述黃豆餅粉粒度進(jìn)一步優(yōu)選為80目。
[0016]現(xiàn)有糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源僅為有機(jī)氮，而本發(fā)明不僅糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為有機(jī)氮和無機(jī)氮結(jié)合還控制有機(jī)氮的粒度，使糖化酶發(fā)酵周期不變但產(chǎn)率提高15 ~25%。
[0017]本發(fā)明的另一目的是提供一種糖化酶的發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法包括菌種活化步驟、種子培養(yǎng)步驟、糖化酶發(fā)酵步驟，所述糖化酶發(fā)酵步驟為將糖化酶生產(chǎn)菌的種子培養(yǎng)液接入上述發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵65~75h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)料或不補(bǔ)料，發(fā)酵周期為7 ~8d ;
[0018]所述補(bǔ)料為補(bǔ)加的葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖質(zhì)量的1/10、補(bǔ)加的無機(jī)氮為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始有機(jī)氮質(zhì)量的1/60。
[0019]本發(fā)明通過控制無機(jī)氮補(bǔ)加時間和補(bǔ)加量，也使糖化酶產(chǎn)率提高。
[0020]本發(fā)明所述方法優(yōu)選為包括如下步驟:
[0021]①菌種活化:將糖化酶生產(chǎn)菌菌落接種于活化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2.5~3.5d得到活化培養(yǎng)液；
[0022]所述活化培養(yǎng)基為每IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HPO4Ig, MgSO4.7H200.5g、KC10.5g、FeSO40.01 g、瓊脂 0.5g，pH 為 5.4 ;
[0023]②種子培養(yǎng):將步驟①所得活化培養(yǎng)液接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2.5~3d得到種子培養(yǎng)液；
[0024]所述種子培養(yǎng)基為每IL水中含淀粉120g、黃豆粉20g、玉米漿20g，pH為5.1~
5.4，淀粉液化后DE值為18~25 ;
[0025]③糖化酶發(fā)酵:將步驟②所得種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵65~75h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)料或不補(bǔ)料，發(fā)酵周期為7~8d ;
[0026]所述補(bǔ)料為補(bǔ)加的葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖質(zhì)量的1/10、補(bǔ)加的無機(jī)氮為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始有機(jī)氮質(zhì)量的1/60。
[0027]本發(fā)明所述方法優(yōu)選為包括如下步驟:
[0028]①菌種活化:將糖化酶生產(chǎn)菌菌落接種于活化培養(yǎng)基中，30~32°C培養(yǎng)2.5~
3.5d，間歇搖動3~4次/d，每次搖動10~20轉(zhuǎn)，得到活化培養(yǎng)液；
[0029]所述活化培養(yǎng)基為每IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HPO4Ig, MgSO4.7H200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、瓊脂 0.5g，pH 為 5.4 ;
[0030]②種子培養(yǎng):將步驟①所得活化培養(yǎng)液接入種子培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)液與種子培養(yǎng)基的體積比為1:10，在30~32°C下190~210r/min培養(yǎng)2.5~3d，得到種子培養(yǎng)液；
[0031]所述種子培養(yǎng)基為每IL水中含淀粉120g、黃豆粉20g、玉米漿20g，pH為5.1~
5.4，淀粉液化后DE值為18~25 ;
[0032]③糖化酶發(fā)酵:將步驟②所得種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:10，在30~32°C下190~210r/min發(fā)酵，在發(fā)酵65~75h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)料或不補(bǔ)料，發(fā)酵周期為7~8d ;
[0033]所述補(bǔ)料為補(bǔ)加的葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖質(zhì)量的1/10、補(bǔ)加的無機(jī)氮為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始有機(jī)氮質(zhì)量的1/60。
[0034]本發(fā)明有益效果為:
[0035]①有效提高糖化酶發(fā)酵中糖化酶的產(chǎn)率；
[0036]②降低發(fā)酵液中的殘?zhí)橇?，提高原料利用率，減少殘?zhí)菍γ钢苿┨崛〉母蓴_；
[0037]③提高發(fā)酵液的pH值，減少發(fā)酵液對生產(chǎn)設(shè)備的腐蝕。
【具體實施方式】
[0038]下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0039]下述發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米漿為工業(yè)級玉米漿，玉米漿濃度為38%，玉米漿蛋白質(zhì)含量為40%。
[0040]下述發(fā)酵培養(yǎng)基中的黃豆餅粉為冷榨黃豆餅粉，黃豆餅粉粒度為80目，黃豆餅粉蛋白質(zhì)含量為44%，黃豆餅粉水分為10%，黃豆餅粉酸價小于4 (KOH)/ (mg/g)。
[0041]下述糖化酶活力測定方法為:將發(fā)酵液除去菌體得到粗酶液，按照GB8276-2006測定糖化酶活力。
[0042]實施例1
[0043]一種糖化酶的發(fā) 酵方法，所述方法包括如下步驟:
[0044]①菌種活化:取4°C保存的斜面黑曲霉菌種，挑取健壯的黑曲霉菌落接種于50mL的活化培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)3d，間歇搖動4次/d，每次搖動10轉(zhuǎn)，得到活化培養(yǎng)液；
[0045]所述活化培養(yǎng)基為IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HPO4Ig, MgSO4.7H200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、瓊脂 0.5g, pH 為 5.4，121°C滅菌 20min ；
[0046]②種子培養(yǎng):從步驟①所得活化培養(yǎng)液中取5mL接入50mL的種子培養(yǎng)基中，在32°C下200r/min培養(yǎng)60h，得到種子培養(yǎng)液；
[0047]所述種子培養(yǎng)基為IL水中含淀粉120g、黃豆粉20g、玉米漿20g，pH為5.3，淀粉液化后DE值為21，121。。滅菌20min ；
[0048]③糖化酶發(fā)酵:從步驟②所得種子培養(yǎng)液中取2mL接入20mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32°C下200r/min發(fā)酵，在發(fā)酵72h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)料，發(fā)酵周期為7d ；
[0049]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為IL水中含葡萄糖100g、玉米漿30g、黃豆餅粉30g、硝酸鹽2g，pH為5.4,葡萄糖115°C滅菌30min,其他121°C滅菌20min ；
[0050]所述補(bǔ)料為補(bǔ)加0.2g的葡萄糖和補(bǔ)加0.02g的硝酸鹽。
[0051]糖化酶發(fā)酵所得粗酶液的糖化酶活力為9878U/mL，比現(xiàn)有糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源僅為有機(jī)氮的粗酶液糖化酶活力提高21%。
[0052]實施例2
[0053]一種糖化酶的發(fā)酵方法，所述方法包括如下步驟:
[0054]①菌種活化:取4°C保存的斜面黑曲霉菌種，挑取健壯的黑曲霉菌落接種于50mL的活化培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)3d，間歇搖動3次/d，每次搖動10轉(zhuǎn)，得到活化培養(yǎng)液；
[0055]所述活化培養(yǎng)基為IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HPO4Ig, MgSO4.7H200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、瓊脂 0.5g, pH 為 5.4，121°C滅菌 20min ；
[0056]②種子培養(yǎng):從步驟①所得活化培養(yǎng)液中取5mL接入50mL的種子培養(yǎng)基中，在32°C下200r/min培養(yǎng)60h，得到種子培養(yǎng)液；
[0057]所述種子培養(yǎng)基為IL水中含淀粉120g、黃豆粉20g、玉米漿20g，pH為5.2，淀粉液化后DE值為24，121。。滅菌20min ；
[0058]③糖化酶發(fā)酵:從步驟②所得種子培養(yǎng)液中取2mL接入20mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在31°C下210r/min發(fā)酵，發(fā)酵周期為7d ；
[0059]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為IL水中含葡萄糖100g、玉米漿30g、黃豆餅粉30g、硝酸鹽3g，pH為5.4,葡萄糖115°C滅菌30min,其他121°C滅菌20min ；
[0060]糖化酶發(fā)酵所得粗酶液的糖化酶活力為8530U/mL，比現(xiàn)有糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源僅為有機(jī)氮的粗酶液糖化酶活力提高17%。
[0061]實施例3
[0062]一種糖化酶的發(fā)酵方法，所述方法包括如下步驟:
[0063]①菌種活化:取4°C保存的斜面黑曲霉菌種，挑取健壯的黑曲霉菌落接種于50mL的活化培養(yǎng)基中，32°C培養(yǎng)3d，間歇搖動4次/d，每次搖動10轉(zhuǎn)，得到活化培養(yǎng)液；
[0064]所述活化培養(yǎng)基為IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HPO4Ig, MgSO4.7H200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、瓊脂 0.5g, pH 為 5.4，121°C滅菌 20min ；
[0065]②種子培養(yǎng):從步驟①所得活化培養(yǎng)液中取5mL接入50mL的種子培養(yǎng)基中，在32°C下200r/min培養(yǎng)6 0h，得到種子培養(yǎng)液；
[0066]所述種子培養(yǎng)基為IL水中含淀粉120g、黃豆粉20g、玉米漿20g，pH為5.4，淀粉液化后DE值為18，121°C滅菌20min ；
[0067]③糖化酶發(fā)酵:從步驟②所得種子培養(yǎng)液中取2mL接入20mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C下200r/min發(fā)酵，在發(fā)酵72h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)料，發(fā)酵周期為7d ；
[0068]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為IL水中含葡萄糖100g、玉米漿30g、黃豆餅粉30g、硝酸鹽lg，pH為5.4,葡萄糖115°C滅菌30min,其他121°C滅菌20min ；
[0069]所述補(bǔ)料為補(bǔ)加0.2g的葡萄糖和補(bǔ)加0.02g的硝酸鹽。
[0070]糖化酶發(fā)酵所得粗酶液的糖化酶活力為9490U/mL，比現(xiàn)有糖化酶發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源僅為有機(jī)氮的粗酶液糖化酶活力提高16%。
【權(quán)利要求】
1.一種糖化酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為每IL水中含葡萄糖80~100g、有機(jī)氮與無機(jī)氮混合氮源61~63g, pH為5.3~5.5 ; 所述有機(jī)氮為玉米漿與黃豆餅粉，無機(jī)氮為硝酸鹽，所述玉米漿、黃豆餅粉與硝酸鹽的質(zhì)量比為30:30:1~3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于:所述玉米漿為工業(yè)級玉米漿，玉米漿濃度為36~40%，玉米漿蛋白質(zhì)含量為38~42%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于:所述黃豆餅粉為冷榨黃豆餅粉，黃豆餅粉粒度為80~100目，黃豆餅粉蛋白質(zhì)含量為42~46%，黃豆餅粉水分為8~12%，黃豆餅粉酸價小于4 (KOH)/ (mg/g)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于:所述黃豆餅粉粒度為80目。
5.一種糖化酶的發(fā)酵方法，其特征在于:所述發(fā)酵方法包括菌種活化步驟、種子培養(yǎng)步驟、糖化酶發(fā)酵步驟，所述糖化酶發(fā)酵步驟為將糖化酶生產(chǎn)菌的種子培養(yǎng)液接入權(quán)利要求1、2、3或4所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵65~75h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)料或不補(bǔ)料，發(fā)酵周期為7~8d ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為每IL水中含葡萄糖80~100g、有機(jī)氮與無機(jī)氮混合氮源61~63g，pH 為 5.3 ~5.5 ; 所述有機(jī)氮為玉米漿與黃豆餅粉，無機(jī)氮為硝酸鹽，所述玉米漿、黃豆餅粉與硝酸鹽的質(zhì)量比為30:30:1~3 ; 所述補(bǔ)料為補(bǔ)加的葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖質(zhì)量的1/10、補(bǔ)加的無機(jī)氮為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始有機(jī)氮質(zhì)量的1/60。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的發(fā)酵方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟: ①菌種活化:將糖化酶生產(chǎn)菌菌落接種于活化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2.5~3.5d得到活化培養(yǎng)液； 所述活化培養(yǎng)基為每 IL 水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HP04lg、MgS04.7Η200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、瓊脂 0.5g，pH 為 5.4 ; ②種子培養(yǎng):將步驟①所得活化培養(yǎng)液接入種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2.5~3d得到種子培養(yǎng)液； 所述種子培養(yǎng)基為每IL水中含淀粉120g、黃豆粉20g、玉米漿20g，pH為5.1~5.4，淀粉液化后DE值為18~25 ; ③糖化酶發(fā)酵:將步驟②所得種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵65~75h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)料或不補(bǔ)料，發(fā)酵周期為7~8d ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為每IL水中含葡萄糖80~100g、有機(jī)氮與無機(jī)氮混合氮源61~63g，pH 為 5.3 ~5.5 ; 所述有機(jī)氮為玉米漿與黃豆餅粉，無機(jī)氮為硝酸鹽，所述玉米漿、黃豆餅粉與硝酸鹽的質(zhì)量比為30:30:1~3 ; 所述補(bǔ)料為補(bǔ) 加的葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖質(zhì)量的1/10、補(bǔ)加的無機(jī)氮為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始有機(jī)氮質(zhì)量的1/60。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的發(fā)酵方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟: ①菌種活化:將糖化酶生產(chǎn)菌菌落接種于活化培養(yǎng)基中，30~32°C培養(yǎng)2.5~3.5d，間歇搖動3~4次/d，每次搖動10~20轉(zhuǎn)，得到活化培養(yǎng)液； 所述活化培養(yǎng)基為每 IL水中含蔗糖 30g、NaN033g、K2HP04lg、MgS04.7Η200.5g、KC10.5g、FeSO40.01g、瓊脂 0.5g，pH 為 5.4 ; ②種子培養(yǎng):將步驟①所得活化培養(yǎng)液接入種子培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)液與種子培養(yǎng)基的體積比為1:10，在30~32。。下190~210r/min培養(yǎng)2.5~3d，得到種子培養(yǎng)液； 所述種子培養(yǎng)基為每IL水中含淀粉120g、黃豆粉20g、玉米漿20g，pH為5.1~5.4，淀粉液化后DE值為18~25 ; ③糖化酶發(fā)酵:將步驟②所得種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1:10，在30~32°C下190~210r/min發(fā)酵，在發(fā)酵65~75h時向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)料或不補(bǔ)料，發(fā)酵周期為7~8d ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為每IL水中含葡萄糖80~100g、有機(jī)氮與無機(jī)氮混合氮源61~63g，pH 為 5.3 ~5.5 ; 所述有機(jī)氮為玉米漿與黃豆餅粉，無機(jī)氮為硝酸鹽，所述玉米漿、黃豆餅粉與硝酸鹽的質(zhì)量比為30:30:1~3 ; 所述補(bǔ)料為補(bǔ)加的葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖質(zhì)量的1/10、補(bǔ)加的無機(jī)氮為發(fā)酵培養(yǎng)基中初始有機(jī)氮質(zhì)`量的1/60。
【文檔編號】C12N9/34GK103865901SQ201410139281
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月8日
【發(fā)明者】李憲臻, 孫玉梅, 王偉 申請人:大連工業(yè)大學(xué)