專利名稱：一種制備羥基脂肪酸酯均聚物的方法及其專用菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種制備羥基脂肪酸酯均聚物的方法及其專用菌。
背景技術：
聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，簡稱PHA)是一種能由許多微生物合 成的胞內(nèi)聚酯，在微生物胞內(nèi)以顆粒狀的內(nèi)含物形式存在，是細菌胞內(nèi)的一種碳源和能源 的儲備物。由于其與塑料相近的物理材料性能及生物可降解性能，被稱為生物可降解塑料。 聚羥基脂肪酸酯具有如下的結構其中，m = 1，2，3或4，通常m = 1 ;n表示聚合度；R為高 度可變側鏈，可以是飽和或不飽和、直鏈或支鏈、脂肪族或芳香族的基團。當R =乙基或以 下時，為短鏈PHA ；當R =庚基或以上時，為長鏈PHA ；當在兩者中間時，為中鏈PHA。 近年來組織工程領域的研究結果表明PHA還具有良好的生物相容性，是非常有潛 力的生物醫(yī)用材料。PHA按照其單體結構的不同，可以分為三類短鏈ΡΗΑ，其單體的碳原子 數(shù)小于6，如聚3-羥基丁酸酯ΡΗΒ，3-羥基丁酸戊酸共聚酯PHBV ；短鏈中長鏈共聚ΡΗΑ，既 含有短鏈PHA單體，又含有中長鏈PHA單體，如聚3-羥基丁酸己酸酯；中長鏈ΡΗΑ，含有碳 原子數(shù)不小于6的單體。不同單體組成的PHA具有不同的物理性質(zhì)，例如強度、延展性、結 晶速率等。隨著長鏈3-羥基脂肪酸單體含量的升高，中長鏈PHA性能發(fā)生了質(zhì)的變化，從 柔軟甚至粘性變?yōu)榫哂袕椥浴⒔Y晶度以及剛性。一般來說，微生物只能合成聚3-羥基丁酸 酯PHB的均聚物，其它PHA的單體只能以共聚物的形式存在。目前還未發(fā)現(xiàn)有能合成非PHB 均聚物的微生物野生菌株。由于均聚物特有的一些性能，加上從均聚物可以方便地得到手 性羥基脂肪酸單體，所以進行均聚物的微生物合成顯得十分必要。惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)可以以脂肪酸或其鹽為碳源，生物合成得到 聚羥基脂肪酸酯。惡臭假單胞菌Pseudomonas putida KT2442是一株研究中長鏈PHA合成 的模式菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種重組惡臭假單胞菌。本發(fā)明所提供的重組惡臭假單胞菌，如下述1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的使出發(fā)惡臭假單 胞菌中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶編碼基因和3-酮酰輔酶A硫解酶編碼基因的編碼功能 喪失，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌I ；2)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的使所述重組惡臭 假單胞菌I中的3-羥基脂酰載脂蛋白輔酶A轉移酶編碼基因的編碼功能喪失，得到重組惡 臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌II ；
3)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的向所述重組惡臭假單胞菌II中導入聚-β -羥基丁酸合成酶編碼基因和4-羥基丁酰輔酶A轉移酶編碼基 因，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌III ；4)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的向所述重組惡臭 假單胞菌II中導入PHA顆粒結合蛋白的編碼基因、烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因和PHA 合成酶編碼基因，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌IV ；5)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的使所述重組惡臭 假單胞菌II中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因和脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因的 編碼功能喪失，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌V。上述1)所示重組惡臭假單胞菌中，所述使出發(fā)惡臭假單胞菌中的3-羥基脂酰輔 酶A脫氫酶編碼基因和3-酮酰輔酶A硫解酶編碼基因的編碼功能喪失是通過同源重組實 現(xiàn)的；所述同源重組的方法包括如下步驟向所述出發(fā)惡臭假單胞菌中導入序列表中序列 1所示DNA和序列表中序列2所示DNA，所述序列表中序列1所示DNA與所述出發(fā)惡臭假單 胞菌中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因發(fā)生同源重組，所述序列表中序列2所示 DNA與所述出發(fā)惡臭假單胞菌中的3-酮酰輔酶A硫解酶的編碼基因發(fā)生同源重組，得到所 述重組惡臭假單胞菌I ；上述2)所示重組惡臭假單胞菌中，所述使所述重組惡臭假單胞菌I中的3-羥基 脂酰載脂蛋白輔酶A轉移酶編碼基因的編碼功能喪失是通過同源重組實現(xiàn)的；所述同源重 組的方法包括如下步驟向所述重組惡臭假單胞菌I中導入序列表中序列3所示DNA，所述 序列表中序列3所示DNA與所述重組惡臭假單胞菌I中的3-羥基脂酰載脂蛋白輔酶A轉 移酶的編碼基因發(fā)生同源重組，得到所述重組惡臭假單胞菌II ；上述3)所示重組惡臭假單胞菌中，所述聚_ β _羥基丁酸合成酶編碼基因和4-羥 基丁酰輔酶A轉移酶編碼基因是通過重組載體導入的；所述重組載體是按照如下方法制備得到的將質(zhì)粒PKSSE5.3用限制性內(nèi)切酶 BamHI和EcoRI進行酶切，回收大片段，記作大片段I ；將載體pBBRl_MCS2用限制性內(nèi)切酶 BamHI和EcoRI進行酶切，回收載體大片段，記作大片段II ；將所述大片段I和所述大片段 II連接，得到所述重組載體；上述4)所示重組惡臭假單胞菌中，所述PHA顆粒結合蛋白的編碼基因、烯脂酰輔 酶A水合酶的編碼基因和PHA合成酶編碼基因是通過重組載體導入的；所述重組載體是將 所述PHA顆粒結合蛋白的編碼基因、PHA合成酶編碼基因和烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基 因構成的融合基因插入載體PBBR1-MCS2的KpnI和EcoRI位點得到的；所述PHA顆粒結合 蛋白的編碼基因位于所述融合基因的上游，所述PHA合成酶編碼基因位于所述融合基因的 中游，所述烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因位于所述融合基因的下游；上述5)所示重組惡臭假單胞菌中，所述使所述重組惡臭假單胞菌II中的3-羥基 脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因和脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因的編碼功能喪失是通過同源 重組實現(xiàn)的；所述同源重組的方法包括如下步驟向所述重組惡臭假單胞菌II中導入序列 表中序列9所示DNA和序列表中序列10所示DNA，所述序列表中序列9所示DNA與所述重 組惡臭假單胞菌II中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因發(fā)生同源重組，所述序列表 中序列10所示DNA與所述重組惡臭假單胞菌II中的脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因發(fā)生同源重組，得到所述重組惡臭假單胞菌V。上述1)所示重組惡臭假單胞菌中，所述序列表中序列1所示DNA和序列表中序列 2所示DNA是通過重組載體導入的；所述重組載體是將所述序列表中序列1所示DNA和表 中序列2所示DNA構成的融合基因插入出發(fā)載體pK18mobSacB的XbaI和HindIII位點得 到的；所述序列表中序列1所示DNA位于融合基因的上游，所述表中序列2所示DNA位于融 合基因的下游；

上述2)所示重組惡臭假單胞菌中，所述序列表中序列3所示DNA是通過重組載 體導入的；所述重組載體是將所述序列表中序列3所示DNA插入出發(fā)載體pKlSmobSacB的 HindIII和XmaI位點得到的；上述3)所示重組惡臭假單胞菌中，所述聚_羥基丁酸合成酶編碼基因的核苷 酸序列如序列表中序列4所示，所述4-羥基丁酰輔酶A轉移酶編碼基因的核苷酸序列如序 列表中序列5所示；所述聚- β -羥基丁酸合成酶編碼基因位于所述融合基因的上游，所述 4-羥基丁酰輔酶A轉移酶編碼基因位于所述融合基因的下游；上述4)所示重組惡臭假單胞菌中，所述PHA顆粒結合蛋白的編碼基因的核苷酸序 列如序列表中序列6所示，所述烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因的核苷酸序列如序列表中 序列7所示；所述PHA合成酶編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示；所述重組載體是按照如下方法得到的以Aeromonas hydrophila 4AK4的基因 組DNA為模板，用如下引物對進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI 對所述PCR擴增產(chǎn)物進行雙酶切，回收基因片段；用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI對載體 PBBR1-MCS2進行雙酶切，回收酶切大片段；將所述基因片段與所述酶切大片段連接，得到 所述重組載體；上述5)所示重組惡臭假單胞菌中，所述序列表中序列9所示DNA和序列表中序列 10所示DNA是通過重組載體導入的；所述重組載體是將所述序列表中序列9所示DNA和序 列表中序列10所示DNA構成的融合基因插入出發(fā)載體pK18mobSacB的HindIII和BamHI位 點得到的；所述序列表中序列9所示DNA位于所述融合基因的上游，所述序列表中序列10 所示DNA位于所述融合基因的下游。上述任一所述的重組惡臭假單胞菌中，所述出發(fā)載體為pK18mobSaCB或 PBBR1-MCS2 ；所述出發(fā)惡臭假單胞菌為菌株Pseudomonas putida KT0Y06。上述任一所述的重組惡臭假單胞菌在制備聚羥基脂肪酸酯中的應用也屬于本發(fā) 明的保護范圍。本發(fā)明的最后一個目的是提供一種制備聚羥基脂肪酸酯的方法。本發(fā)明所提供的制備聚羥基脂肪酸酯的方法，包括如下步驟以脂肪酸、可溶性脂 肪酸鹽或Y-丁內(nèi)酯為碳源，用上述任一所述重組惡臭假單胞菌進行生物合成，得到聚羥 基脂肪酸酯。上述方法中，所述生物合成的方法包括如下步驟發(fā)酵上述任一所述重組惡臭假 單胞菌，得到含有所述重組惡臭假單胞菌的發(fā)酵液；向所述含有重組惡臭假單胞菌的發(fā)酵 液中加入所述脂肪酸或所述可溶性脂肪酸鹽或所述Y-丁內(nèi)酯，在溫度為30°C的條件下繼 續(xù)培養(yǎng)39h，得到聚羥基脂肪酸酯。上述方法中，所述脂肪酸為戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、月桂酸或豆蔻酸，所述可溶性脂肪酸鹽為戊酸鈉、己酸鈉、庚酸鈉、辛酸鈉、壬酸鈉或癸酸鈉。上述方法中，所述聚羥基脂肪酸酯為羥基脂肪酸酯均聚物或羥基脂肪酸酯共聚 物；所述生物合成的方法為如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌I，所述可溶性脂肪酸鹽為庚 酸鈉，所述聚羥基脂肪酸酯的化學式如式I所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為 252X IO3Da,所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為455X IO3Da ；所述庚酸鈉在所述含有惡 臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃度為5g/L ；
(式 I )2)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌II，所述可溶性脂肪酸鹽為己酸 鈉，所述聚羥基脂肪酸酯的化學式如式II-I所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為 206X IO3Da,所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為272X IO3Da ；所述己酸鈉在所述含有惡 臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃度為10g/L ；
(式 II-1)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌II，所述可溶性脂肪酸鹽為辛酸 鈉，所述聚羥基脂肪酸酯的化學式如式II-2所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為 148X IO3Da,所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為ISOXlO3Da ；所述己酸鈉在所述含有惡 臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃度為10g/L ； 3)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌III，所述碳源為Y-丁內(nèi)酯，所述 聚羥基脂肪酸酯的化學式如式III所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為487X IO3Da, 所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為854X IO3Da ；所述γ - 丁內(nèi)酯在所述含有惡臭假單胞 菌的發(fā)酵液中的濃度為5g/L;
(式 III)4)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌IV 所述可溶性脂肪酸鹽為戊 酸鈉，所述聚羥基脂肪酸酯的化學式如式IV所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為 815X103Da，所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為1056X 103Da ；所述戊酸鈉在所述含有惡 臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃度為5g/L ；
(式 IV)5)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌V 所述可溶性脂肪酸鹽為癸酸 鈉，所述聚羥基脂肪酸酯的化學式如式V-I所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為 248. 6X IO3Da,所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為361. 4X IO3Da ；所述癸酸鈉在所述含
有惡臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃度為2g/L ； 所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌V:所述脂肪酸為月桂酸，所述聚羥 基脂肪酸酯的化學式如式V-2所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為119. 4 X IO3Da,所 述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為155. 5X IO3Da ；所述月桂酸在所述含有惡臭假單胞菌的 發(fā)酵液中的濃度為6g/L;
(式 V-2)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌V 所述脂肪酸為豆蔻酸，所述聚羥 基脂肪酸酯的化學式如式V-3所示；所述豆蔻酸在所述含有惡臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃 度為4g/L ；
(式 V-3)上述方法中，所述含有重組惡臭假單胞菌的發(fā)酵液是按照包括如下步驟的方法得 到的將所述重組惡臭假單胞菌接種于LB-Km液體培養(yǎng)基中，在溫度為30°C的條件下培養(yǎng)， 得到所述發(fā)酵液；所述LB-Km液體培養(yǎng)基由酵母提取物、蛋白胨、NaCl、硫酸卡那霉素和水 組成，酵母提取物在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，蛋白胨在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃 度為10g/L，NaCl在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃度為10g/L，硫酸卡那霉素在LB-Km液體培養(yǎng) 基中的濃度為50μ g/mL。本發(fā)明的重組惡臭假單胞菌中，有的通過敲除脂肪酸的β氧化途徑中某些基因 (如ΡΡ2047)，使其喪失編碼功能，從而使該菌中的脂肪酸的β氧化途徑被遏制；有的是在 脂肪酸的β氧化途徑被遏制的基礎上，進一步將脂肪酸的從頭合成途徑中的某些基因(如 PhaG)敲除，從而使該菌中的脂肪酸的從頭合成途徑被遏制，實現(xiàn)了脂肪酸的從頭合成途徑 和脂肪酸的β氧化途徑同時被遏制；有的是在脂肪酸的β氧化途徑和脂肪酸的從頭合成 途徑同時被遏制的基礎上，進一步向菌中導入聚羥基脂肪酸酯合成的相關基因(如orfZ)。由于本發(fā)明的重組惡臭假單胞菌中脂肪酸的β氧化途徑和脂肪酸的從頭合成途 徑均被削弱，使脂肪酸或可溶性脂肪酸鹽底物既不進入β氧化途徑也不進入脂肪酸的從 頭合成途徑，從而使底物的碳鏈既不被切除也不被增加，保證底物碳鏈長度的均一性，使碳 鏈長度均一的底物進入聚羥基脂肪酸酯合成途徑，合成得到羥基脂肪酸酯均聚物。實驗證明，無論用上述任何一種重組菌生物合成聚羥基脂肪酸酯，均可得到羥基 脂肪酸酯均聚物，尤其是中長鏈羥基脂肪酸酯均聚物(C4-C14)。得到的聚羥基脂肪酸酯均聚 物純度高、產(chǎn)量高。本發(fā)明方法可以合成任意長度的中長鏈聚羥基脂肪酸酯均聚物，克服了 現(xiàn)有技術中生物合成只能得到3-羥基丁酸酯(HB)的均聚物的缺陷。因此，本發(fā)明方法在 羥基脂肪酸酯的均聚物的生物合成領域將有廣闊的應用前景。


圖1為質(zhì)粒pK18mobSacB的圖譜。圖2為聚4羥基丁酸酯核磁共振圖譜。圖3為聚羥基戊酸酯核磁共振圖譜。 圖4為聚羥基己酸酯核磁共振圖譜。圖5為聚羥基庚酸酯核磁共振圖譜。圖6為聚羥基癸酸酯核磁共振圖譜。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。酵母提取物購自英國OXOID公司，產(chǎn)品目錄號為LP-0042 ；蛋白胨購自英國OXOID 公司，產(chǎn)品目錄號為LP-0021 ；LB液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，其余 為水。LB-Km液體培養(yǎng)基由酵母提取物、蛋白胨、NaCl、硫酸卡那霉素和水組成，酵母提 取物在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃度為5g/L，蛋白胨在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃度為10g/L， NaCl在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃度為10g/L，硫酸卡那霉素在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃度 為 50 μ g/mL0LB-Km固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨， 10g/L NaCl和50 μ g/mL硫酸卡那霉素，其余為水。LBS-Amp固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨， 10g/L NaCl和100 μ g/mL氨芐青霉素，其余為水。LB-Km-Amp固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白 胨，10g/L NaClJOyg/mL硫酸卡那霉素和100 μ g/mL氨芐青霉素，其余為水。菌 株 Pseudomonas putida strain KT2442 (van der Meer, J R, van Neerven, A R, deVries, E J, et al. Cloning and characterization of plasmid—encoded genes for thedegradation of 1, 2-dichloro-,1,4-dichloro-, and 1, 2,4-trichlorobenzene ofPseudomonas sp. strain P51. J Bacteriol 173(1) :6_15 Jan 1991)(由i青華大學提供)。質(zhì)粒 pK18mobSacB ( Schafer A, Tauch A, Jager W, et al. Small mobiIizblemulti-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 andpK19 !selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene 1994，145 :69_73)(由清華大學提供)。質(zhì)粒 pK18mobSacB的圖譜如圖1所示。大腸桿菌E. coli S17-1 ATCC No. 47055 購自 ATCC0^^ Pseudomonas putida KTOYO6 (SP 0uyang,RC Luo,Q Liu,et al. Production ofpolyhydroxyalkanoates with high 3-hydroxydodecanoate monomer content by fadB andfadA knockout mutant of Pseudomonas putida KT2442. Biomacromolecules 2007,8: 2504-2511)(由清華大學提供)。
^ Pseudomonas putida KT0Y06 ^ I^J M M :Pseudomonas putida KT2442 3_羥基脂酰輔酶A脫氫酶基因(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, fadB)及3_酮酰輔 酶A硫解酶基因(3-ketoacyl-CoA thiolase，fadA)缺失突變株的構建1、用于缺失突變Pseudomonas putida KT2442中fadB及fadA基因的大腸桿菌克 隆載體的構建1)以 Pseudomonas putida strain KT2442 的基因組 DNA 為模板，在引物 Pl ATTTCTAGAGCAGATGATGGCCTTC 和 P2 CTGAAGCTTTGTAATGCCGGTATAC 的引導下，PCR 擴增相連 的兩個基因，包括3-酮酰輔酶A硫解酶基因fadA片段(序列表中序列11自5'末端起第 1498-2674位核苷酸)和3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶基因fadB片段(序列表中序列11自 5'末端起第1-1467位核苷酸)，用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII對PCR擴增產(chǎn)物進行雙 酶切，回收大小約為2. Skb的酶切片段； 2)用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII對質(zhì)粒pK18mobSacB進行雙酶切，回收酶切片 段；3)將步驟1)和步驟2)的回收片段用T4DNA連接酶進行連接，連接反應完成后， 將連接產(chǎn)物用電轉化的方法導入到E. coli S17-1(ATCC編號47055)中，將轉化子涂布于 LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；4)挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中， 在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII對質(zhì)粒進行 酶切鑒定，結果獲得大小為5. 699kb及2. 783kb的DNA片段，進一步將質(zhì)粒進行測序驗證， 結果得到的序列正確，表明構建的質(zhì)粒正確，將構建正確的含有fadA及fadBPCR片段的大 腸桿菌克隆載體命名為PSPK10。5)用限制性內(nèi)切酶SalI對質(zhì)粒pSPKlO進行酶切，回收6. 648kb的酶切片段；6)將步驟5)的回收片段用T4DNA連接酶進行自連，連接反應完成后，將連接產(chǎn)物 用電轉化的方法導入到E. coli S17-1(ATCC編號47055)中，將轉化子涂布于LB-Km固體 培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；7)挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中， 在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII對質(zhì)粒進行 酶切鑒定，結果產(chǎn)生大小為5. 699kb及0. 949kb的DNA片段，進一步測序驗證，測得的序列 如序列表中序列11所示，表明構建的質(zhì)粒正確，將構建正確的自殺質(zhì)粒命名為pSPKll。2、通過構建好的自殺質(zhì)粒pSPKll敲除Pseudomonas putida KT2442中fadB及 fadA基因，獲得突變株Pseudomonas putida KT0Y06基因工程菌株1)挑取步驟1中獲得的含有質(zhì)粒pSPKll的重組菌E. coli S17-1 (pSPKll)，將 其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37 °C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，同時將Pseudomonas putidaKT2442菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，然后各取 0. 5mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液混合至同一無菌小管中，SOOOrpm離心2分鐘，棄去上清液，再 加入ImL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，置于30°C培養(yǎng)箱中1小時，用無菌接種環(huán)通過劃 線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Amp液體培養(yǎng) 基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h ；
3)用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)2)中所獲菌液涂布于LBS-Amp固體培養(yǎng)平板 上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;4)在3)中的LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上挑取20個單菌落，編號，并按次序將各單菌 落分別接種在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板和LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。5)挑取上一步驟中只能在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上生長而不能同時在LB-Km固體 培養(yǎng)平板上生長的單菌落，分別接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng) 24h ；

6)將5)中獲得的培養(yǎng)液各取1ml，離心，去上清，用200 μ 1無菌水重 懸。將重懸的菌液置于沸水浴中10分鐘。冷卻后，以該菌液為模板，在引物Pl: ATTTCTAGAGCAGATGATGGCCTTC 和 Ρ2 CTGAAGCTTTGTAATGCCGGTATAC 的引導下，進行 PCR 擴增 鑒定，再將質(zhì)粒進行測序。結果PCR擴增獲得949bp大小片段，測得序列也正確，證明構建 的質(zhì)粒結構正確，也證明重組菌正確，將此突變株命名為Pseudomonas putida KT0Y06。實施例1、突變菌株Pseudomonas putida KT0Y08的構建及生物合成一、突變菌株 Pseudomonas putida KT0Y08 的構建(一)自殺質(zhì)粒pSPKO9的構建1)以 Pseudomonas putida strain KT2442 的基因組 DNA 為模板，在引物 Pl ATTTCTAGAGCTGAACCCGGATGGC 和 P2 :AATAAGCTTGCCGAAGCGCAGGATC 的弓丨導下，PCR 擴增 相連的兩個基因，3-酮酰輔酶A硫解酶基因(fadAx)和3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶基因 (fadB2x)，用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII對PCR擴增產(chǎn)物進行雙酶切，回收大小約為 2. 7kb的酶切片段。2)用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII對質(zhì)粒pK18mobSacB進行雙酶切，回收大小約 為5. 699kb的酶切片段；3)將步驟1)和步驟2)的回收片段用T4DNA連接酶進行連接，連接反應完成后， 將連接產(chǎn)物用電轉化的方法導入到E. coli S17-1(ATCC編號47055)中，將轉化子涂布于 LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；4)挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中， 在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII對質(zhì)粒進 行酶切鑒定，結果產(chǎn)生大小為5. 699kb及2. 692kb的DNA片段，將構建正確的含有fadAx及 fadB2x完整基因的大腸桿菌克隆載體命名為pSPK08。5)用限制性內(nèi)切酶SalI對質(zhì)粒pSPK08進行酶切，回收6. 775kb的酶切片段；此 步驟中fadAx完整基因及fadB2x完整基因中的部分片段被切除，剩余的fadAx非完整片段 如序列表中序列2所示，剩余的fadB2x非完整片段如序列表中序列1所示。6)將步驟5)的回收片段用T4 DNA連接酶進行自連，連接反應完成后，將連接產(chǎn)物 用電轉化的方法導入到E. coli S17-1(ATCC編號47055)中，將轉化子涂布于LB-Km固體 培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆。7)驗證將步驟6)得到的單克隆接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下 搖床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII對質(zhì)粒進行酶切鑒定，結果得 到大小為5. 699kb及1. 066kb的DNA片段，說明質(zhì)粒構建正確；再將質(zhì)粒進行測序，結果表 明，插入的fadB2x上游片段和fadAx下游片段的融合片段序列為序列1和序列2構成的融合序列，融合片段位于出發(fā)載體pK18mobSacB的XbaI和HindIII位點間，進一步證明構建 的質(zhì)粒結構正確；將構建正確的質(zhì)粒命名為PSPK09。將含有質(zhì)粒pSPK09 的 E. coli S17-1 記作重組菌 E. coli S17-1 (pSPK09)。(二)質(zhì)粒 pSPKO9 轉化菌株 Pseudomonas putida KT0Y06,得到突變菌株 Pseudomonasputida KT0Y08菌株Pseudomonas putida KT0Y06中含有Amp抗性基因；質(zhì)粒pSPK09中含有Km
抗性基因；1)挑取步驟(一)中獲得的含有質(zhì)粒PSPK09的重組菌E. coli S17-1 (pSPK09)， 將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h ；同時將Pseudomonas putidaKT0Y06菌株接種到LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h ；然后各 取0. 5mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液混合至同一無菌小管中，SOOOrpm離心2分鐘，棄去上清液， 再加入ImL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，置于30°C培養(yǎng)箱中1小時，用無菌接種環(huán)通過 劃線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Amp液體培養(yǎng) 基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h ；3)用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)2)中所獲菌液涂布于LBS-Amp固體培養(yǎng)平板 上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;4)在3)中的LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上挑取20個單菌落，編號，并按次序將各單菌 落分別接種在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板和LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。5)挑取步驟4)中只能在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上生長而不能同時在LB-Km固體 培養(yǎng)平板上生長的單菌落。6)驗證將步驟(5)獲得的單菌落分別接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在 30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h ；獲得的培養(yǎng)液各取1ml，離心，去上清，用200 μ 1無菌 水重懸。將重懸的菌液置于沸水浴中10分鐘。冷卻后，以該菌液為模板，在引物Pl ATTTCTAGAGCTGAACCCGGATGGC 和 Ρ2 :AATAAGCTTGCCGAAGC GCAGGATC 的引導下，進行 PCR 擴 增。將PCR擴增產(chǎn)物進行測序。將測得的序列與序列1所示DNA(即fadB2x的上游片段) 和序列2所示DNA (即fadAx的下游片段)進行比對，，比對結果完全匹配，說明序列1所示 DNA與Pseudomonas putida KT0Y06基因組中的fadB2x基因發(fā)生了同源重組，序列2所示 DNA 與 Pseudomonas putida KT0Y06 基因組中的 fadAx 基因發(fā)生了同源重組，Pseudomonas putida KT0Y06基因組中的fadB2x基因和fadAx基因的大部分片段被敲除。將fadB2x基 因和fadAx基因大部分片段被敲除后的Pseudomonas putida KT0Y06命名為Pseudomonas putida KT0Y08。二、用突變菌株 Pseudomonas putida KT0Y08 生物合成得到 PHA庚酸鈉購自上海國藥集團；用Pseudomonas putida KT0Y08轉化脂肪酸生產(chǎn)中長鏈PHA的搖瓶實驗。(一)生物合成1)將 Pseudomonas putida KT0Y08 接種于 LB-Km 液體培養(yǎng)基中，在 30°C、200rpm 下?lián)u床培養(yǎng)12h，再按5% (V/V)的比例將菌液接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm 下?lián)u床培養(yǎng)9h，得到含有Pseudomonas putida KT0Y08的發(fā)酵液；
2)將庚酸鈉加入到步驟1)中含有Pseudomonas putida KT0Y08的發(fā)酵液中，使發(fā) 酵液中庚酸鈉的濃度為5g/L，然后在30°C、200rpm下繼續(xù)搖床培養(yǎng)39h，得到生物合成后的 發(fā)酵液；3)得到的生物合成發(fā)酵液在SOOOrpm離心5分鐘，收集菌體。4)收集的菌體用去離子水重懸，然后SOOOrpm離心5分鐘，收集菌體。5)將收集的菌體用70%乙醇水溶液重懸，然后SOOOrpm離心5分鐘，收集菌體。
6)收集得到的菌體在冷凍條件下進行真空抽干過夜，得到干菌體，用于氣相色譜 分析。7)將干菌體稱重放入反應釜中，以1 10的比例(體積比)加入氯仿，100°C下反
應4小時。8)將反應釜中溶有PHA的氯仿用濾紙過濾，得到母液按照1 10的比例(體積 比)加入冰乙醇沉淀。9)收集沉淀，進行常溫真空抽干，得到的產(chǎn)物即為最后的PHA均聚物，用于核磁共 振法分析。(二)產(chǎn)物驗證檢測生物合成后的發(fā)酵液中菌體細胞干重(CDW，g/L)以及PHA含量)、組 成。培養(yǎng)結束后按照文獻(0uyang，S.P·；Liu, Q. ；Fang, L. ；Chen, G.Q. Constructionof pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and theirApplications in Poly (hydroxyalkanoate)Production. Macromol. Biosci. 2007，7，227-233)所述的方法1)取干菌體約30mg于干燥的酯化管中，加入2ml氯仿，2ml酯化液(3%濃硫酸的 甲醇溶液)，于100°c反應4h ；2)加入Iml去離子水，混勻，靜置過夜；3)取下層液體0. 5 μ 1進行氣象色譜分析。1、均聚物結構驗證PHA組成的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；均聚物的分子結構式
(式 I )數(shù)均分子量為252 X IO3Da (或重均分子量為455 X IO3Da)；均聚物PHHp的核磁共 振圖譜如圖5所示(a 聚羥基己酸酯核磁共振氫譜；b 聚羥基己酸酯核磁共振碳譜)。2、PHA含量的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；PHA含量的計算公式
PHA含量=各單體含量之和
標準曲線斜率X單體峰面粉內(nèi)標峰面積

單體含量=標準曲線斜率X單體峰面積/內(nèi)標峰面積；結果突變菌株ΚΤ0Υ08在以庚酸鈉為單一碳源的培養(yǎng)條件下，可以合成單體組成 只含有3-羥基庚酸(3Ηρ)的均聚物(表1)。表1、P. putida ΚΤ0Υ08轉化脂肪酸生物合成PHA 實施例2、菌株Pseudomonas putida KT0Y08-G的構建及生物合成一、工程菌株 Pseudomonas putida KT0Y08-G 的構建(一 )重組載體pKQQOl的構建1)以 Pseudomonas putida KT2442 的基因組 DNA 為模板，用引物 phaG-up-l 和phaG-up-2進行PCR擴增，得到3-羥基脂酰載脂蛋白輔酶A轉移酶編碼基因 (3-hydroxyacyl-acylcarrier protein-coenzyme A transferase 或口H PhaG)的上游片段 (序列表中序列3自5'末端起第1-448位核苷酸所示)；用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII 對PCR擴增產(chǎn)物進行雙酶切，回收大小約為400bp的酶切片段；以 Pseudomonas putida KT2442 的基因組 DNA 為模板，用引物 phaG-down-l 和phaG-down-2進行PCR擴增，得到3-羥基脂酰載脂蛋白輔酶A轉移酶編碼基因 (3-hydroxyacyl-acylcarrier protein-coenzyme A transferase 或口H PhaG)的下游片段 (序列表中序列3自5'末端起第449-913位核苷酸所示)；用限制性內(nèi)切酶XbaI和XmaI 對PCR擴增產(chǎn)物進行雙酶切，回收大小約為400bp的酶切片段；phaG-up-l =ATAGAT AAGCTT TATCGTGAACTGACGGCCAATGAGAphaG-up-2 :GC TCTAGA GCGATAGAACTCCGTGTAAACCCGAphaG-down-1 :GC TCTAGA GCAAGCATGTGGGCAGAAGCCAGTTCAphaG-down-2 :AT CCCGGG CATGGGCCAGGTCAAGGCAGGA2)用限制性內(nèi)切酶XbaI和Hindi 11對質(zhì)粒pK18mobSacB進行雙酶切，回收酶切大 片段；3)將步驟1)的PhaG上游片段酶切產(chǎn)物和步驟2)的回收大片段用T4 DNA連 接酶進行連接，連接反應完成后，將連接產(chǎn)物用化學轉化的方法導入到大腸桿菌E. coli S17-1 (ATCC編號47055)中，將轉化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng) 12h;4)挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中， 在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶XbaI和HindIII對質(zhì)粒進行 酶切鑒定，陽性質(zhì)粒經(jīng)酶切后可產(chǎn)生大小為448bp及5696bp的DNA片段，將構建正確的含有phaG上游PCR片段的大腸桿菌克隆載體命名為pKQQOl-1。5)用限制性內(nèi)切酶XbaI和XmaI對質(zhì)粒pKQQ01_l進行酶切，回收6145bp的酶切 片段；6)將步驟1)的phaG下游片段和步驟5)的回收片段用T4 DNA連接酶進行連接， 連接反應完成后，將連接產(chǎn)物用化學轉化的方法導入到E. coli S17-1(ATCC編號47055) 中，將轉化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；挑取在LB-Km固體 培養(yǎng)平板上長出的單克隆。7)驗證將步驟6)得到的單克隆接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下 搖床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶XbaI和XmaI對質(zhì)粒進行酶切鑒定。結果得到 大小為467bp及6145bp的DNA片段；再將質(zhì)粒進行測序，結果表明，測得的序列如序列表中 序列3所示，并且序列表中序列3所示的基因(即PhaG基因的上游片段與下游片段的融合 基因，但不是完整的PhaG基因)位于出發(fā)載體pK18mobSacB的HindIII和XmaI位點間，證 實構建的質(zhì)粒結構正確，將構建正確的含有PhaG上游和下游兩段PCR片段的大腸桿菌克隆 載體命名為pKQQOl。

將含有質(zhì)粒pKQQOl 的 E. coli S17-1 命名為重組菌 E. coli S17-1 (pKQQOl)。( 二)工程菌株 Pseudomonas putida KT0Y08-G 的構建1)挑取步驟(一)中獲得的含有質(zhì)粒pKQQOl的重組菌E. coli S17-1 (pKQQOl)， 將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h ；同時將Pseudomonas putidaKT0Y08菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h ；然后各取 0. 5mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液混合至同一無菌小管中，SOOOrpm離心2分鐘，棄去上清液，再 加入ImL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，置于30°C培養(yǎng)箱中1小時，用無菌接種環(huán)通過劃 線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Amp液體培養(yǎng) 基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h ；3)用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)2)中所獲菌液涂布于LBS-Amp固體培養(yǎng)平板 上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;4)在3)中的LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上挑取20個單菌落，編號，并按次序將各單菌 落分別接種在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板和LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。5)挑取上一步驟中只能在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上生長而不能同時在LB-Km固體 培養(yǎng)平板上生長的單菌落。6)驗證將步驟5)得到的單菌落分別接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在 30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h ；獲得的培養(yǎng)液各取1ml，離心，去上清，用200 μ 1無菌 水重懸。將重懸的菌液置于沸水浴中10分鐘。冷卻后，以該菌液為模板，在引物Pl ATTTCTAGAGCAGATGATGGCCTTC 和 Ρ4 :ATACCCGGGCCGGAGTAGATGC GGAACGACAACG 的引導下， 進行PCR擴增。將擴增片段大小約為SOObp的PCR擴增產(chǎn)物進行測序。將測得的序列與 序列3所示DNA(即PhaG基因的上游片段與下游片段的融合片段，但不是完整的PhaG基 因)進行比對，比對結果完全匹配，說明序列3所示DNA與Pseudomonas putida KT0Y08 基因組中的phaG基因發(fā)生了同源重組，Pseudomonas putida KT0Y08基因組中的phaG 基因的大部分片段被敲除。將PhaG基因的大部分片段被敲除后的Pseudomonas putidaKT0Y08命名為Pseudomonas putida KT0Y08-G。判斷發(fā)生同源重組的原理首先擴增的序 列大小要在913bp左右，然后測序的結果要和上述的phaG基因的上游片段與下游片段的 融合基因，但不是完整的PhaG基因相匹配。就是說如果在沒有敲除的情況下用phaG-up-1 和phaG-down-2這兩條引物以基因組為模板進行PCR，那么得到的序列將會是1552bp，這 1552bp包括上述的phaG基因的上游片段與下游片段的融合基因，但同時還包括phaG基因 的大部分片段，而重組成功的則把PhaG基因的大部分片段重組掉了，只留下了 phaG基因的 上游片段與下游片段的融合基因。二、用工程菌株 Pseudomonas putida KT0Y08-G 生物合成，得到 PHA用Pseudomonas putida KT0Y08-G轉化脂肪酸生產(chǎn)中長鏈PHA的搖瓶實驗。

(一)生物合成己酸鈉購自上海國藥集團；辛酸鈉購自上海國藥集團；IMfPseudomonas putida KT0Y08-G接種于LB-Km液體培養(yǎng)基中，在 30°C、200rpm 下?lián)u床培養(yǎng)12h，再按5% (V/V)的比例將菌液接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm 下?lián)u床培養(yǎng)9h，得到含有Pseudomonas putida KT0Y08-G的發(fā)酵液；2)分別將己酸鈉和辛酸鈉加入到步驟1)中含有Pseudomonas putida KT0Y08-G 的發(fā)酵液中，使得發(fā)酵液中己酸鈉、辛酸鈉的濃度均為10g/L，然后在30°C、200rpm下繼續(xù) 搖床培養(yǎng)39h，得到生物合成后的發(fā)酵液。3)獲得菌體的方法與實施例1中所述一致。(二)產(chǎn)物驗證檢測生物合成后的發(fā)酵液中菌體細胞干重(CDW，g/L)以及PHA含量)、組 成。培養(yǎng)結束后按照文獻(Ouyang，S.P.；Liu, Q. ；Fang, L. ；Chen, G.Q. Constructionof pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and theirApplications in Poly (hydroxyalkanoate)Production. Macromol. Biosci. 2007，7，227-233)所述的方法菌體的前處理方法與實施例1中所述一致。1、以己酸鈉為底物時的產(chǎn)物驗證(I)PHA組成的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；結果均聚物的分子結構式
(式 II-1)數(shù)均分子量為206 X IO3Da (或重均分子量為272 X IO3Da)；均聚物HHx的核磁共振 圖譜如圖4所示(a 聚羥基己酸酯核磁共振氫譜；b 聚羥基己酸酯核磁共振碳譜)。(2) PHA含量的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；PHA含量的計算公式 與實施例1中所述一致。
結果突變菌株KT0Y08在以己酸鈉為單一碳源的培養(yǎng)條件下，可以合成單體組成 只含有3-羥基己酸(3HHx)的均聚物，(表2)。2、以辛酸鈉為底物時的產(chǎn)物驗證(I)PHA組成的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；結果共聚物的分子結構式
(式 II-2)共聚物的數(shù)均分子量為148 X IO3Da (或重均分子量為180 X IO3Da)；(2) PHA含量的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；PHA含量的計算公式PHA含量=各單體含量之和 單體含量=標準曲線斜率X單體峰面積/內(nèi)標峰面積；結果突變菌株KT0Y08在以辛酸鈉為單一碳源的培養(yǎng)條件下，可以合成單體組成 含有3-羥基己酸(3HHx)和3-羥基辛酸(3H0)的共聚物，(表2)。表2. P. putida KT0Y08-G轉化脂肪酸生物合成PHA。 實施例3、菌株Pseudomonas putida KTHH06的構建及生物合成PHA載體 pKSSE5. 3(Hein S, Sohling B, Gottschalk G, Steinbuchel A. Biosynthesis ofpoly(4-hydroxybutyric acid)by recombinant strains of Escherichia coli. FEMSMicrobiol. Lett. 1997 ；153 :411-418.)(由清華大學提供)；載體pKSSE5. 3中含有來自于羅氏真養(yǎng)菌(Ralstonia eutropha)基因組的 聚-β-羥基丁酸合成酶編碼基因(phbC基因)；來自于羅氏真養(yǎng)菌(Ralstonia eutropha) 基因組的聚-β-羥基丁酸合成酶編碼基因(phbC基因)的核苷酸序列如序列表中序列4 所示，為1767bp。載體pBBRl-MCS2(Michael Ε.Kovach, Philip H. Elzer, D. Steven Hill etal· Fournew derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS，carrying differentantibiotic-resistance cassettes. Gene. 1995 ； 166 :175_176·)(由清華大學 提供)；載體pBBRl-MCS2中含有來自于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)基因組的4-羥 基丁酰輔酶A轉移酶編碼基因(orfZ基因)；來自于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)基 因組的4-羥基丁酰輔酶A轉移酶編碼基因(orfZ基因)的核苷酸序列如序列表中序列5 所示，為1290bp。一、菌株 Pseudomonas putida KTHH06 的構建(一)載體pBHHOl的構建 1)將質(zhì)粒pKSSE5. 3用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI進行酶切，得到4520bp禾口 2943bp的2個DNA片段，回收大小為5420bp DNA片段。將載體pBBRl-MCS2用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI進行酶切，得到18bp和5126bp 的2個DNA片段，回收大小為5126bp DNA片段。2)將步驟1)的5420bp bp和5126bp兩個DNA片段用T4 DNA連接酶進行連接，連 接反應完成后，將連接產(chǎn)物用化學轉化的方法導入到E. coli S17-1(ATCC編號47055)中， 將轉化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；3)挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中， 在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI對質(zhì)粒進行 酶切鑒定。結果得到酶切后產(chǎn)生大小5420bp和5126bp兩個DNA片段的質(zhì)粒，為陽性質(zhì)粒， 將得到的正確的含有PhbC and orfZ(Ralstonia eutropha)基因的大腸桿菌克隆載體命名 為 pBHHOl。將pBHHOl進一步測序驗證，結果表明，序列4所示基因(phbC基因)與序列5所 示基因(orfZ基因)構成融合基因(融合基因序列為序列4和序列5融合后的序列)，phbC 基因位于融合基因的上游，orfZ基因位于融合基因的下游。將含有pBHHOl 的 E. coli S17-1 記作重組菌 E. coli S17-1 (pBHHOl)。( 二 )質(zhì)粒 pBHHOl 轉化 Pseudomonas putida KT0Y08-G1)挑取步驟(一)中獲得的含有質(zhì)粒pBHHOl的重組菌E. coli S17-1 (pBHHOl)， 將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h ；同時將Pseudomonas putidaKT0Y08-G菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h ；然后各取 0. 5mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液混合至同一無菌小管中，SOOOrpm離心2分鐘，棄去上清液，再 加入ImL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，置于30°C培養(yǎng)箱中1小時，用無菌接種環(huán)通過劃 線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆。3)驗證從步驟(2)獲得的單克隆中提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI 對質(zhì)粒進行酶切鑒定，結果，獲得大小為5420bp和5126bp兩個DNA片段，證實單克隆中導 入的質(zhì)粒為pBHHOl。將含有質(zhì)粒pBHHOl的突變株KT0Y08-G命名為Pseudomonas putida KTHH06。二、用菌株 Pseudomonas putida KTHH06 合成 PHA用Pseudomonas putida KTHH06轉化脂肪酸生產(chǎn)PHA的搖瓶實驗。
Y-丁內(nèi)酯購自上海國藥集團。(一 )生物合成

1)將 Pseudomonas putida KTHH06 接種于 LB-Km 液體培養(yǎng)基中，在 30°C、200rpm 下?lián)u床培養(yǎng)12h，再按5% (V/V)的比例將菌液接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm 下?lián)u床培養(yǎng)9h，得到含有Pseudomonas putida KTHH06的發(fā)酵液；2)將Y-丁內(nèi)酯加入到步驟1)中含有Pseudomonas putida KTHH06的發(fā)酵液中， 使得發(fā)酵液中Y-丁內(nèi)酯的濃度為5g/L，然后在30°C、200rpm下繼續(xù)搖床培養(yǎng)39h，得到生 物合成后的發(fā)酵液。3)獲得菌體的方法與實施例1中所述一致。(二)產(chǎn)物驗證檢測生物合成后的發(fā)酵液中菌體細胞干重(CDW，g/L)以及PHA含量)、組 成。培養(yǎng)結束后按照文獻(Ouyang，S.P.；Liu, Q. ；Fang, L. ；Chen, G.Q. Constructionof pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and theirApplications in Poly (hydroxyalkanoate)Production. Macromol. Biosci. 2007，7，227-233)所述的方法菌體的前處理方法與實施例1中所述一致。1、均聚物結構驗證P4HB組成的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；均聚物的分子結構式
III)數(shù)均分子量為487 X IO3Da (或重均分子量為854 X IO3Da)；均聚物P4HB的核磁共振圖譜如圖2所示(a 聚羥基丁酸酯核磁共振氫譜；b 聚羥 基丁酸酯核磁共振碳譜)。2、PHA含量的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；PHA含量的計算公式與 實施例1中所述相同。結果突變菌株KT0Y08在以Y - 丁內(nèi)酯為單一碳源的培養(yǎng)條件下，可以合成單體 組成只含有4-羥基丁酸(4HB)的均聚物，(表3)。上述結果表明，在Y-丁內(nèi)酯的存在下，4-羥基丁酸(HD)均聚物P4HB的形成(表 3)。表3. P. putida KTHH06轉化脂肪酸生物合成PHA。 實施例4、菌株Pseudomonas putida KTHH08的構建及生物合成一、菌株 Pseudomonas putida KTHH08 的構建菌株嗜水氣單孢菌(Aeromonas hydrophila) 4AK4基因組中PHA顆粒結合蛋 白的編碼基因(PhaP)片段的核苷酸序列如序列表中序列6所示，菌株嗜水氣單孢菌 (Aeromonashydrophila) 4AK4基因組中烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因(phaj)片段的核 苷酸序列如序列表中序列7所示；菌株嗜水氣單孢菌(Aeromonas hydrophila) 4AK4基因組 中聚羥基脂肪酸酯(PHA)合成酶編碼基因(又稱PHA合成酶編碼基因、PHBHHx合酶基因或 PhaC基因)的核苷酸序列如序列表中序列8所示。

菌株嗜水氣單孢菌(Aeromonas hydrophila)4AK4(van der Meer, J R, van Neerven, A R, de Vries, E J, et al.Cloning and characterization of plasmid-encoded genes forthe degradation of 1,2-dichloro-,1,4-dichloro-,and 1， 2,4-trichlorobenzene ofPseudomonas sp. strain P51. J Bacteriol 173 (1) 6-15 Jan 1991)(由清華大學提供)。(一)質(zhì)粒pZWJ4-31 的構建1)以 Aeromonas hydrophila 4AK4 的基因組 DNA 為模板，在引物 Pl TTTGGTACCTGGAGACCGATGATGAATATGG 和 P2 :ATGAATTCTTAAGGCAGCTTGACCACGG 的引導下，PCR 擴增相連的3個基因，包括PHA顆粒結合蛋白基因(phaP)片段、PHBHHx合酶基因(phaC)片 段和烯脂酰輔酶A水合酶基因(phaj)片段；用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI對PCR擴增產(chǎn) 物進行雙酶切，回收大小約為2. 6kb的酶切片段；PCR擴增產(chǎn)物中含有如下融合片段phaP 片段、phaC片段和phaj片段依次連接構成的融合片段，融合片段的基因序列為序列序列6、 序列8和序列7依次連接構成的序列；所述PHA顆粒結合蛋白基因(phaP)位于所述融合基 因的上游，所述PHA合酶基因(phaC)位于所述融合基因的中游，所述烯脂酰輔酶A水合酶 基因(PhaJ)位于所述融合基因的下游。2)用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI對質(zhì)粒pBBRl_MCS2進行雙酶切，回收酶切大片 段；3)將步驟1)和步驟2)的回收片段用T4DNA連接酶進行連接，連接反應完成后， 將連接產(chǎn)物用電轉化的方法導入到E. coli S17-1(ATCC編號47055)中，將轉化子涂布于 LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；4)挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中， 在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI對質(zhì)粒進行 酶切鑒定，結果產(chǎn)生大小為5. IOOkb及2. 643kb的DNA片段，初步驗證質(zhì)粒構建正確，進一 步進行測序驗證，結果測得的融合片段的序列正確，且融合序列位于PBBR1-MCS2的KpnI和 EcoRI間，表明構建的質(zhì)粒正確，將構建正確的含有融合片段(phaP片段、phaC片段和phaj 片段)的大腸桿菌克隆載體命名為PZWJ4-31。將含有質(zhì)粒pZWJ4-31 的 E. coli S17-1 記作重組菌 E. coli S17-1 (pZWJ4-31)。( 二 )菌株 Pseudomonas putida KTHH08 的構建1)挑取步驟(一)中獲得的含有質(zhì)粒pZWJ4-31的重組菌E. coli S17-1 (pZWJ4-31)，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h ；同時 將Pseudomonasputida KT0Y08-G菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h ；然后各取0. 5mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液混合至同一無菌小管中，SOOOrpm離心2分 鐘，棄去上清液，再加入ImL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，置于30°C培養(yǎng)箱中1小時，用 無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱 中培養(yǎng)24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆。3)驗證從步驟(2)得到的單克隆中提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶PstI對質(zhì) 粒進行酶切；結果得到大小為1754bp、2087bp及3902bp的DNA片段，表明導入的質(zhì)粒為 pZWJ4-31o 將含有質(zhì)粒 pZWJ4-31 的突變株 KT0Y08-G 命名為 Pseudomonas putida KTHH08。二、用Pseudomonas putida KTHH08轉化脂肪酸生產(chǎn)PHA的搖瓶實驗

戊酸鈉購自上海國藥集團。(一 )生物合成1)將 Pseudomonas putida KTHH08 接種于 LB-Km 液體培養(yǎng)基中，在 30°C、200rpm 下?lián)u床培養(yǎng)12h，再按5% (V/V)的比例將菌液接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm 下?lián)u床培養(yǎng)9h，得到含有Pseudomonas putida KTHH08的發(fā)酵液；2)將戊酸鈉加入到步驟1)中含有Pseudomonas putida KTHH08的發(fā)酵液中，使得 發(fā)酵液中戊酸鈉的濃度為5g/L，然后在30°C、200rpm下繼續(xù)搖床培養(yǎng)39h，得到生物合成后 的發(fā)酵液。3)獲得菌體的方法與實施例1中所述一致。( 二)產(chǎn)物驗證檢測生物合成后的發(fā)酵液中菌體細胞干重(CDW，g/L)以及PHA含量)、組 成。培養(yǎng)結束后按照文獻(Ouyang，S.P. ；Liu, Q. ；Fang, L. ；Chen, G.Q. Constructionof pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and theirApplications in Poly (hydroxyalkanoate)Production. Macromol. Biosci. 2007，7，227-233)所述的方法菌體的前處理方法與實施例1中所述一致。1、均聚物結構驗證PHA組成的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；均聚物的分子結構式
O a/
2(式 IV)數(shù)均分子量為815 X IO3Da (或重均分子量為1056 X IO3Da)；均聚物HV的核磁共振圖譜如圖3所示(a 聚羥基戊酸酯核磁共振氫譜；b 聚羥基 戊酸酯核磁共振碳譜)。2、PHA含量的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；PHA含量的計算公式與 實施例1中所述相同。
結果突變菌株KT0Y08在以戊酸鈉為單一碳源的培養(yǎng)條件下，可以合成單體組成 只含有3-羥基戊酸(3HV)的均聚物，(表4)。上述結果表明，在戊酸鈉的存在下，3-羥基戊酸(HV)均聚物PHV的形成(表4)。。表4. P. putida KTHH08轉化脂肪酸生物合成PHA。 實施例5、菌株Pseudomonas putida KTQQ20的構建及生物合成一、菌株 Pseudomonas putida KTQQ20 的構建(一 )大腸桿菌克隆載體PKQQ12的構建1)以Pseudomonas putida KT2442的基因組DNA為模板，用引物Pl和P2進行PCR 擴增，得到3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶基因PP2047的上游片段(PP2047的上游片段的序列 如序列表中序列9所示)；用限制性內(nèi)切酶HindIII和PstI對PCR擴增產(chǎn)物進行雙酶切， 回收大小約為430bp的酶切片段；以Pseudomonas putida KT2442的基因組DNA為模板，用引物P3和P4進行PCR 擴增，得到脂酰輔酶A脫氫酶基因PP2048的下游片段(PP2048的下游片段如序列表中序列 10所示)；用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI對PCR擴增產(chǎn)物進行雙酶切，回收大小約為488bp 的酶切片段；Pl:AATAAGCTTGCGATGGCTGCGCTGAP2 CATCTGCAGGATTGATCGGGAAGGGAP3 :AATCTGCAGCTAGCGCACGGCAAACP4 TGATGGATCCTCCGAACCGGTACCTG2)用限制性內(nèi)切酶HindIII和PstI對質(zhì)粒pK18mobSaCB進行雙酶切，回收酶切大 片段；3)將步驟1)的上游片段和步驟2)的回收片段用T4DNA連接酶進行連接，連接反 應完成后，將連接產(chǎn)物用化學轉化的方法導入到E. coli S17-1(ATCC編號47055)中，將轉 化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；4)挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中， 在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶PstI和Hindi 11對質(zhì)粒進行 酶切鑒定，陽性質(zhì)粒經(jīng)酶切后可產(chǎn)生大小為430bp的DNA片段，將構建正確的含有PP2047 上游PCR片段的大腸桿菌克隆載體命名為PKQQ12-1。5)用限制性內(nèi)切酶PstI & BamHI對質(zhì)粒pKQQ12_l進行酶切，回收6576bp的酶切 片段；6)將步驟1)的下游片段和步驟5)的回收片段用T4DNA連接酶進行連接，連接反 應完成后，將連接產(chǎn)物用化學轉化的方法導入到E. coli S17-1(ATCC編號47055)中，將轉 化子涂布于LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h ；挑取在LB-Km固體培養(yǎng)平板 上長出的單克隆。7)驗證將步驟6)得到的單克隆接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶PstI和NcoI對質(zhì)粒進行酶切鑒定，結果獲得大 小為1598bp及5022bp的DNA片段；將質(zhì)粒進行測序，結果表明，序列9所示DNA (即PP2047 的上游片段)和序列10所示DNA (即PP2048的下游片段)構成融合片段，融合片段(融合 片段的序列為序列9和序列10融合構成的序列)位于出發(fā)載體pK18mobSacB的HindIII 和BamHI位點間，證明質(zhì)粒結構正確，將構建正確的含有PP2047上游和PP2048下游的兩段 PCR片段的大腸桿菌克隆載體命名為PKQQ12。所述序列表中序列9所示DNA(PP2047上游 片段)位于所述融合基因的上游，所述序列表中序列10所示DNA(PP2048下游片段)位于 所述融合基因的下游。( 二 )通過自殺質(zhì)粒 pKQQ12 敲除 Pseudomonas putida KT0Y08-G 中 PP2047 禾口 PP2048基因

1)挑取步驟(一)中獲得的含有質(zhì)粒PKQQ12的重組菌E. coli S17-1 (ρ_2)， 將其接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h ；同時將Pseudomonas putidaKT0Y08-G菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)12h ；然后各取 0. 5mL上述兩種菌株的培養(yǎng)液混合至同一無菌小管中，SOOOrpm離心2分鐘，棄去上清液，再 加入ImL無菌LB液體培養(yǎng)基，重懸細菌后，置于30°C培養(yǎng)箱中1小時，用無菌接種環(huán)通過劃 線法將一環(huán)混合菌液涂布于LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ；2)挑取在LB-Km-Amp固體培養(yǎng)平板上長出的單克隆，將其接種至LB-Amp液體培養(yǎng) 基中，在30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h ；3)用無菌接種環(huán)通過劃線法將一環(huán)2)中所獲菌液涂布于LBS-Amp固體培養(yǎng)平板 上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;4)在3)中的LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上挑取20個單菌落，編號，并按次序將各單菌 落分別接種在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板和LB-Km固體培養(yǎng)平板上，在30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。5)挑取上一步驟中只能在LBS-Amp固體培養(yǎng)平板上生長而不能同時在LB-Km固體 培養(yǎng)平板上生長的單菌落。6)驗證將步驟5)獲得的單菌落分別接種至LB-Amp液體培養(yǎng)基中，在 30°C、200rpm下?lián)u床培養(yǎng)24h ；獲得的培養(yǎng)液各取1ml，離心，去上清，用200ul無菌 水重懸。將重懸的菌液置于沸水浴中10分鐘。冷卻后，以該菌液為模板，在引物Pl AATAAGCTTGCGATGGCTGCGCTGA 和 P4 TGATGGATCCTCCGAACCGGTA CCTG 的引導下，進行 PCR 擴 增。將PCR擴增產(chǎn)物進行測序。將測得的序列與序列9所示DNA(即PP2047的上游片段) 和序列10所示DNA(即PP2048的下游片段)的融合片段進行比對，結果完全匹配，說明序 列9所示DNA與Pseudomonas putidaKT0Y08-G基因組中的PP2047基因發(fā)生了同源重組， 序列10所示DNA與Pseudomonas putidaKT0Y08_G基因組中的PP2048基因發(fā)生了同源重 組，Pseudomonas putida KT0Y08-G基因組中的PP2047基因的大部分片段和PP2048基因 的大部分片段被敲除。將PP2047基因的大部分片段和PP2048基因的大部分片段被敲除后 ^ Pseudomonas putida KT0Y08-G ^^^J Pseudomonasputida KTQQ20。二、用Pseudomonas putida KTQQ20轉化脂肪酸生產(chǎn)PHA的搖瓶實驗癸酸鈉購自上海國藥集團；月桂酸(十二烷酸)購自汕頭光華試劑廠；和豆蔻酸 (十四烷酸)購自上海國藥集團；(一 )生物合成
1)將 Pseudomonas putida KTQQ20 接種于 LB-Km 液體培養(yǎng)基中，在 30°C、200rpm 下?lián)u床培養(yǎng)12h，再按5% (V/V)的比例將菌液接種到LB-Km液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm 下?lián)u床培養(yǎng)9h，得到含有Pseudomonas putida KTQQ20的發(fā)酵液；2)分別將癸酸鈉、月桂酸(十二烷酸)和豆蔻酸(十四烷酸)加入到步驟1)中含 有Pseudomonas putida KTQQ20的發(fā)酵液中，使得發(fā)酵液中癸酸鈉的濃度為2g/L、月桂酸 (十二烷酸)的濃度是6g/L、豆蔻酸(十四烷酸)的濃度是4g/L，然后在30°C、200rpm下繼 續(xù)搖床培養(yǎng)39h，得到生物合成后的發(fā)酵液。月桂酸和豆蔻酸的加入方式于菌體培養(yǎng)12h后一次性加入培養(yǎng)基中；癸酸鈉的加入方式平分成兩次加入，第一次是在菌體培養(yǎng)12h后，第二次是在第 一次加入12h后。；3)獲得菌體的方法與實施例1中所述一致。 (二)產(chǎn)物驗證檢測生物合成后的發(fā)酵液中菌體細胞干重(CDW，g/L)以及PHA含量)、組 成。培養(yǎng)結束后按照文獻(Ouyang，S.P. ；Liu, Q. ；Fang, L. ；Chen, G.Q. Constructionof pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and theirApplications in Poly (hydroxyalkanoate)Production. Macromol. Biosci. 2007，7，227-233)所述的方法菌體的前處理方法與實施例1中所述一致。1、以癸酸鈉為碳源，得到的產(chǎn)物的驗證(1)均聚物結構驗證PHA組成的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；均聚物的分子結構式
(式 V-l)數(shù)均分子量為248. 6 X IO3Da (或重均分子量為361. 4 X IO3Da)；均聚物PHD的核磁 共振圖譜如圖6所示(a 聚羥基癸酸酯核磁共振氫譜；b 聚羥基癸酸酯核磁共振碳譜)。(2) PHA含量的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；PHA含量的計算公式 與實施例1中所述一致。結果突變菌株KT0Y08在以癸酸鈉為單一碳源的培養(yǎng)條件下，可以合成單體組成只含有3-羥基癸酸(3HD)的均聚物，(表5)。2、以月桂酸為碳源，得到的產(chǎn)物的驗證(1)共聚物結構驗證PHA組成的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；共聚物的分子結構式 數(shù)均分子量為119. 4 X IO3Da (或重均分子量為155. 5 X IO3Da)；(2) PHA含量的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；PHA含量的計算公式 與實施例2中所述一致。結果突變菌株KT0Y08在以月桂酸為單一碳源的培養(yǎng)條件下，可以合成單體組成 含有3-羥基癸酸(3HD)和3-羥基十二酸(3HDD)的共聚物，(表5)。3、以豆蔻酸為碳源，得到的產(chǎn)物的驗證(1)均聚物結構驗證PHA組成的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；均聚物的分子結構式
(式 V-3)重均分子量為> 50 X IO3Da ；(2) PHA含量的檢測方法氣相色譜分析和核磁共振法分析；PHA含量的計算公式與實施例2中所述一致。結果突變菌株KT0Y08在以豆蔻酸為單一碳源的培養(yǎng)條件下，可以合成單體組成 含有3-羥基十二酸(3HDD)和3-羥基十四酸(3HTD)的共聚物，(表5)。上述結果表明，在癸酸、十二酸和十四酸的存在下，3-羥基癸酸(HD)均聚物PHD和 3-羥基十四酸(HTD)均聚物PHTD分別形成(表5)。表5. P. putida KTQQ20轉化脂肪酸生物合成PHA。 “ND”表示未檢測到數(shù)值。
權利要求
重組惡臭假單胞菌，如下述1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的使出發(fā)惡臭假單胞菌中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶編碼基因和3-酮酰輔酶A硫解酶編碼基因的編碼功能喪失，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌I；2)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的使所述重組惡臭假單胞菌I中的3-羥基脂酰載脂蛋白輔酶A轉移酶編碼基因的編碼功能喪失，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌II；3)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的向所述重組惡臭假單胞菌II中導入聚-β-羥基丁酸合成酶編碼基因和4-羥基丁酰輔酶A轉移酶編碼基因，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌III；4)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的向所述重組惡臭假單胞菌II中導入PHA顆粒結合蛋白的編碼基因、烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因和PHA合成酶編碼基因，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌IV；5)所述重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的使所述重組惡臭假單胞菌II中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因和脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因的編碼功能喪失，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌V。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組惡臭假單胞菌，其特征在于 所述1)所示重組惡臭假單胞菌中，所述使出發(fā)惡臭假單胞菌中的3-羥基脂酰輔酶A 脫氫酶編碼基因和3-酮酰輔酶A硫解酶編碼基因的編碼功能喪失是通過同源重組實現(xiàn)的； 所述同源重組的方法包括如下步驟向所述出發(fā)惡臭假單胞菌中導入序列表中序列1所示 DNA和序列表中序列2所示DNA，所述序列表中序列1所示DNA與所述出發(fā)惡臭假單胞菌中 的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因發(fā)生同源重組，所述序列表中序列2所示DNA與所 述出發(fā)惡臭假單胞菌中的3-酮酰輔酶A硫解酶的編碼基因發(fā)生同源重組，得到所述重組惡 臭假單胞菌I ；所述2)所示重組惡臭假單胞菌中，所述使所述重組惡臭假單胞菌I中的3-羥基脂酰 載脂蛋白輔酶A轉移酶編碼基因的編碼功能喪失是通過同源重組實現(xiàn)的；所述同源重組的 方法包括如下步驟向所述重組惡臭假單胞菌I中導入序列表中序列3所示DNA，所述序列 表中序列3所示DNA與所述重組惡臭假單胞菌I中的3-羥基脂酰載脂蛋白輔酶A轉移酶 的編碼基因發(fā)生同源重組，得到所述重組惡臭假單胞菌II ；所述3)所示重組惡臭假單胞菌中，所述聚_ β _羥基丁酸合成酶編碼基因和4-羥基丁 酰輔酶A轉移酶編碼基因是通過重組載體導入的；所述重組載體是按照如下方法制備得到的將質(zhì)粒PKSSE5. 3用限制性內(nèi)切酶BamHI和 EcoRI進行酶切，回收大片段，記作大片段I ；將載體PBBR1-MCS2用限制性內(nèi)切酶BamHI和 EcoRI進行酶切，回收載體大片段，記作大片段II ；將所述大片段I和所述大片段II連接， 得到所述重組載體；所述4)所示重組惡臭假單胞菌中，所述PHA顆粒結合蛋白的編碼基因、烯脂酰輔酶A 水合酶的編碼基因和PHA合成酶編碼基因是通過重組載體導入的；所述重組載體是將所述 PHA顆粒結合蛋白的編碼基因、PHA合成酶編碼基因和烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因構成 的融合基因插入載體PBBR1-MCS2的KpnI和EcoRI位點得到的；所述PHA顆粒結合蛋白的編碼基因位于所述融合基因的上游，所述PHA合成酶編碼基因位于所述融合基因的中游， 所述烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因位于所述融合基因的下游；所述5)所示重組惡臭假單胞菌中，所述使所述重組惡臭假單胞菌II中的3-羥基脂酰 輔酶A脫氫酶的編碼基因和脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因的編碼功能喪失是通過同源重組 實現(xiàn)的；所述同源重組的方法包括如下步驟向所述重組惡臭假單胞菌II中導入序列表中 序列9所示DNA和序列表中序列10所示DNA，所述序列表中序列9所示DNA與所述重組惡 臭假單胞菌II中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因發(fā)生同源重組，所述序列表中序 列10所示DNA與所述重組惡臭假單胞菌II中的脂酰輔酶A脫氫酶的編碼基因發(fā)生同源重 組，得到所述重組惡臭假單胞菌V。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的重組惡臭假單胞菌，其特征在于所述1)所示重組惡臭假單胞菌中，所述序列表中序列1所示DNA和序列表中序列2所 示DNA是通過重組載體導入的；所述重組載體是將所述序列表中序列1所示DNA和表中序 列2所示DNA構成的融合基因插入出發(fā)載體pK18mobSacB的XbaI和HindIII位點得到的； 所述序列表中序列1所示DNA位于融合基因的上游，所述表中序列2所示DNA位于融合基 因的下游；所述2)所示重組惡臭假單胞菌中，所述序列表中序列3所示DNA是通過重組載體導入 的；所述重組載體是將所述序列表中序列3所示DNA插入出發(fā)載體pK18mobSacB的HindIII 和XmaI位點得到的；所述3)所示重組惡臭假單胞菌中，所述聚_ β _羥基丁酸合成酶編碼基因的核苷酸序 列如序列表中序列4所示，所述4-羥基丁酰輔酶A轉移酶編碼基因的核苷酸序列如序列表 中序列5所示；所述聚-β -羥基丁酸合成酶編碼基因位于所述融合基因的上游，所述4-羥 基丁酰輔酶A轉移酶編碼基因位于所述融合基因的下游；所述4)所示重組惡臭假單胞菌中，所述PHA顆粒結合蛋白的編碼基因的核苷酸序列如 序列表中序列6所示，所述烯脂酰輔酶A水合酶的編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列 7所示；所述PHA合成酶編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示；所述重組載體是按照如下方法得到的以Aeromonas hydrophi 1 a 4AK4的基因組 DNA為模板，用如下引物對進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI 對所述PCR擴增產(chǎn)物進行雙酶切，回收基因片段；用限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI對載體 PBBR1-MCS2進行雙酶切，回收酶切大片段；將所述基因片段與所述酶切大片段連接，得到 所述重組載體；所述5)所示重組惡臭假單胞菌中，所述序列表中序列9所示DNA和序列表中序列10 所示DNA是通過重組載體導入的；所述重組載體是將所述序列表中序列9所示DNA和序列 表中序列10所示DNA構成的融合基因插入出發(fā)載體pK18mobSacB的HindIII和BamHI位 點得到的；所述序列表中序列9所示DNA位于所述融合基因的上游，所述序列表中序列10 所示DNA位于所述融合基因的下游。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一所述的重組惡臭假單胞菌，其特征在于所述出發(fā)惡臭假 單胞菌為菌株 Pseudomonas putida KT0Y06。
5.權利要求1-4中任一所述的重組惡臭假單胞菌在制備聚羥基脂肪酸酯中的應用。
6.一種制備聚羥基脂肪酸酯的方法，包括如下步驟以脂肪酸、可溶性脂肪酸鹽或Y-丁內(nèi)酯為碳源，用權利要求1-4中任一所述重組惡臭假單胞菌進行生物合成，得到聚羥基脂肪酸酯。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述生物合成的方法包括如下步驟發(fā)酵 權利要求1-4中任一所述重組惡臭假單胞菌，得到含有所述重組惡臭假單胞菌的發(fā)酵液； 向所述含有重組惡臭假單胞菌的發(fā)酵液中加入所述脂肪酸或所述可溶性脂肪酸鹽或所述 Y-丁內(nèi)酯，在溫度為30°C的條件下繼續(xù)培養(yǎng)39h，得到聚羥基脂肪酸酯。
8.根據(jù)權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述脂肪酸為戊酸、己酸、庚酸、辛 酸、壬酸、癸酸、月桂酸或豆蔻酸，所述可溶性脂肪酸鹽為戊酸鈉、己酸鈉、庚酸鈉、辛酸鈉、 壬酸鈉或癸酸鈉。
9.根據(jù)權利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述聚羥基脂肪酸酯為羥基脂 肪酸酯均聚物或羥基脂肪酸酯共聚物；所述生物合成的方法為如下1)、2)、3)、4)或5)所示1)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌I，所述可溶性脂肪酸鹽為庚酸鈉，所 述聚羥基脂肪酸酯的化學式如式I所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為252 X IO3Da, 所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為455X IO3Da ；所述庚酸鈉在所述含有惡臭假單胞菌的 發(fā)酵液中的濃度為5g/L; 2)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌II，所述可溶性脂肪酸鹽為己酸鈉，所述聚羥基脂肪酸酯的化學式如式II-I所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為206X IO3Da,所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為272X IO3Da ；所述己酸鈉在所述含有惡臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃度為10g/L ； )所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌II，所述可溶性脂肪酸鹽為辛酸鈉， 所述聚羥基脂肪酸酯的化學式如式II-2所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為 148X IO3Da,所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為ISOXlO3Da ；所述己酸鈉在所述含有惡 臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃度為10g/L ； 2(式 II-2)3)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌III，所述碳源為Y-丁內(nèi)酯，所述聚羥 基脂肪酸酯的化學式如式III所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為487X IO3Da,所述 聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為854Χ IO3Da ；所述γ _ 丁內(nèi)酯在所述含有惡臭假單胞菌的 發(fā)酵液中的濃度為5g/L; 4 (式 III)4)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌IV所述可溶性脂肪酸鹽為戊酸 鈉，所述聚羥基脂肪酸酯的化學式如式IV所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為 815X103Da，所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為1056X 103Da ；所述戊酸鈉在所述含有惡 臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃度為5g/L ； (式 IV)5)所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌V:所述可溶性脂肪酸鹽為癸酸鈉，所述聚羥基脂肪酸酯的化學式如式V-I所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為`248. 6X IO3Da,所述聚羥基脂肪酸酯的重均分子量為361. 4X IO3Da ；所述癸酸鈉在所述含 有惡臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃度為2g/L ； 所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌V:所述脂肪酸為月桂酸，所述聚羥基脂 肪酸酯的化學式如式ν-2所示，所述聚羥基脂肪酸酯的數(shù)均分子量為119. 4 X IO3Da,所述聚 羥基脂肪酸酯的重均分子量為155. 5X IO3Da ；所述月桂酸在所述含有惡臭假單胞菌的發(fā)酵 液中的濃度為6g/L ； 所述重組惡臭假單胞菌為重組惡臭假單胞菌V 所述脂肪酸為豆蔻酸，所述聚羥基脂 肪酸酯的化學式如式ν-3所示；所述豆蔻酸在所述含有惡臭假單胞菌的發(fā)酵液中的濃度為 4g/L；
10.根據(jù)權利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述含有重組惡臭假單胞菌 的發(fā)酵液是按照包括如下步驟的方法得到的將所述重組惡臭假單胞菌接種于LB-Km液體 培養(yǎng)基中，在溫度為30°C的條件下培養(yǎng)，得到所述發(fā)酵液；所述LB-Km液體培養(yǎng)基由酵母提 取物、蛋白胨、NaCl、硫酸卡那霉素和水組成，酵母提取物在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃度為 5g/L，蛋白胨在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃度為10g/L，NaCl在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃度為 10g/L，硫酸卡那霉素在LB-Km液體培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備羥基脂肪酸酯均聚物的方法及其專用菌。重組惡臭假單胞菌是按照包括如下步驟的方法制備的使出發(fā)惡臭假單胞菌中的3-羥基脂酰輔酶A脫氫酶編碼基因和3-酮酰輔酶A硫解酶編碼基因的編碼功能喪失，得到重組惡臭假單胞菌，記作重組惡臭假單胞菌I。實驗證明，用本發(fā)明的重組菌生物合成聚羥基脂肪酸酯，均可得到羥基脂肪酸酯均聚物，尤其是中長鏈羥基脂肪酸酯均聚物(C4-C14)。得到的羥基脂肪酸酯均聚物純度高、產(chǎn)量高。本發(fā)明方法可以合成任意長度的中長鏈羥基脂肪酸酯均聚物，克服了現(xiàn)有技術中生物合成只能得到3-羥基丁酸酯(HB)的均聚物的缺陷。因此，本發(fā)明方法在羥基脂肪酸酯的均聚物的生物合成領域將有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/40GK101845414SQ20101016131
公開日2010年9月29日 申請日期2010年4月28日 優(yōu)先權日2010年4月28日
發(fā)明者陳國強 申請人:清華大學