一種聯(lián)產(chǎn)Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢桿菌菌株及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及一種聯(lián)產(chǎn)Surfactin和 Plipastatin的枯草芽孢桿菌菌株，具體涉及該枯草芽孢桿菌及其在構(gòu)建過程中獲得的重 組質(zhì)粒pDL-PSQ、該枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 芽孢桿菌是自然界中分布非常廣泛的一類革蘭氏陽性細(xì)菌，其中枯草芽孢桿菌和 淀粉液化芽孢桿菌作為土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢(shì)菌群，可以產(chǎn)生多種植物病害防治方面有廣 泛應(yīng)用價(jià)值的脂肽類抗菌物質(zhì)如:Surfactin，是由一條含有13-14個(gè)碳原子的β-羥基脂肪 酸鏈和7個(gè)氨基酸縮肽組成的環(huán)狀脂肽，作為一種很強(qiáng)的生物表面活性劑，還具有抗細(xì)菌、 抗腫瘤、抗病毒和防止纖維蛋白凝塊等生物活性。Fengycin或Plipastatin是由14-18個(gè)碳 原子組成的β-羥基脂肪酸和成環(huán)十肽兩部分組成;對(duì)絲狀真菌具有很好的抑制活性。
[0003] Surf act in和Plipastatin均是由芽孢桿菌中的非核糖體肽合成酶系催化產(chǎn)生的 次級(jí)代謝產(chǎn)物，在合成過程中，4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶（由sfp基因編碼)是必不可 少的功能酶，如若缺失，將不能生產(chǎn)Surfactin和Plipastatin。同時(shí)，degQ基因是一種多效 性的調(diào)控基因，有研究表明，該基因?qū)lipastatin的合成具有上調(diào)控作用。B. subtil is pB2基因組中含有完整的Surf act in合成酶srf A操縱子和Plipastatin合成酶pps操縱子， 但由于sfp基因和degQ基因堿基突變失活，導(dǎo)致B. subtil is pB2不能生產(chǎn)Surfactin和 Plipastatin。
[0004] 由于產(chǎn)環(huán)脂肽類化合物的野生型芽孢桿菌都難以被轉(zhuǎn)化，限制了非核糖體肽合成 酶系的進(jìn)一步研究，B.subtilis pB2作為模式菌枯草芽孢桿菌，其轉(zhuǎn)化方法已成熟，如若利 用同源重組的方法，將有功能活性的sfp基因和degQ基因?qū)隑.subtilis pB2基因組中，使 其恢復(fù)生產(chǎn)Surf act in和Plipastatin的能力，貝lj會(huì)對(duì)后續(xù)Plipastatin合成酶的結(jié)構(gòu)與功 能的深入研究提供先決條件，同時(shí)開發(fā)具有新的微生物來源的脂肽類化合物的潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種運(yùn)用同源重組的方法，將有功能活 性的sfp基因和degQ基因一起整合到枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is )pB2基因組的解淀 粉酶基因 amyE位點(diǎn)上，篩選獲得了一株聯(lián)產(chǎn)Surfactin和Plipastatin的重組菌株 B.subtilis pB2_L〇
[0006] 本發(fā)明目的通過如下手段獲得：
[0007] 1.本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌菌株，該菌株聯(lián)產(chǎn)Surfactin和Plipastatin，命 名為PB2-L，在2015年11月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保 藏號(hào)為CGMCC No. 11723,分類名為:枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis;保藏地址為:北京市 朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。
[0008] 2.本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒pDL-PSQ，該重組質(zhì)粒序列如SEQ ID N0.1所示，包 括sfp基因和degQ基因。
[0009] 3.上述2提供的重組質(zhì)粒pDL-PSQ，該重組質(zhì)粒以P43基因?yàn)閱?dòng)子，amyE為同源 臂。
[0010] 4.本發(fā)明還提供一種聯(lián)產(chǎn)Surf act in和Plipastat in的枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu) 建方法，該方法包括如下步驟：
[0011] (1)設(shè)計(jì)引物對(duì)P43-F和P43-R、sfp-F和sfp-R、degQ_F和degQ-R:以B · subtil is fmbj的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增sfp基因和degQ基因；以B.subtilis pB2基因組DNA為模 板，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子P43基因；
[0012] (2)設(shè)計(jì)引物對(duì)PS-F和PS-R，通過重疊延伸PCR擴(kuò)增，獲得融合片段P43-sfp;
[0013] ⑶用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并通過連接反應(yīng)將degQ基因片段插入質(zhì)粒PDL的酶 切位點(diǎn)之間得到質(zhì)粒pDL-degQ;
[0014] (4)用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并通過連接反應(yīng)將融合片段P43-Sfp插入質(zhì)粒PDL- degQ，最后獲得重組整合質(zhì)粒pDL-PSQ;
[0015] (5)將重組整合質(zhì)粒pDL-PSQ轉(zhuǎn)入B.subtilis pB2菌株中，通過同源臂位點(diǎn)交換， 將目的基因 P43-sfp-degQ整合到了基因組中，抗性篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)化子，即為聯(lián)產(chǎn) Surf act in和Plipastat in的枯草芽抱桿菌工程菌，命名為B. subtil is pB2_L。
[0016] 5 .上述4提供的構(gòu)建方法，其中，步驟（1)通過PCR擴(kuò)增，在啟動(dòng)子P43基因中引入 EcoRI酶切位點(diǎn)，在sfp基因中引入BamM酶切位點(diǎn)，在degQ基因中引入BamHI和Sac頂每切位 點(diǎn)。
[00Π ] 6 ·上述4提供的構(gòu)建方法，其中，步驟(1)所述引物對(duì)序列如下：
[0018] P43-FdnSEQIDN0.2K*;P43UnSEQIDN0.3m* ;
[0019] sfp-F:如SEQ ID NO.4所示；sfp-R:如SEQ ID NO.5所示；
[0020] degQ-FjnSEQIDN0.6m*;degQUnSEQIDN0.7m*。
[0021] 7.上述4提供的構(gòu)建方法，其中，步驟(2)所述引物對(duì)序列如下：
[0022] PS-FdnSEQIDN0.8K*;PSUnSEQIDN0.9m*。
[0023] 8.根據(jù)上述4-7任一項(xiàng)提供的方法獲得的聯(lián)產(chǎn)Surfactin和Plipastatin的枯草芽 孢桿菌。
[0024] 9.上述8提供的枯草芽孢桿工程菌在革蘭氏陽性細(xì)菌、絲狀真菌抑制方面的應(yīng)用。
[0025] 10.上述8提供的枯草芽孢桿工程菌在桃軟腐病菌防治方面的應(yīng)用。
[0026] 有益效果：
[0027] 本發(fā)明利用同源重組的方法，將一株不產(chǎn)抗菌物質(zhì)Surfactin和Plipastat in的 B . subtilis pB2，在amyE位點(diǎn)導(dǎo)入了 一段融合基因 P43-sfp-degQ，獲得了一株聯(lián)產(chǎn) Surfactin和Plipastat in的重組菌株B. subtil is pB2_L，該菌株對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌、絲狀 真菌具有一定的抑菌活性。
[0028]本發(fā)明采用的枯草芽孢桿菌是被我國農(nóng)業(yè)部列為可在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域及其食品領(lǐng)域得 到廣泛的應(yīng)用安全菌株。產(chǎn)生的抗菌脂肽Surfactin和Plipastat in屬于微生物天然抗菌 肽，對(duì)人類健康和食品安全性高，不會(huì)導(dǎo)致對(duì)環(huán)境的污染，可用于生物防治，食品加工和農(nóng) 產(chǎn)品貯藏保鮮等。
[0029] 本發(fā)明建立了一套枯草芽孢桿菌化學(xué)轉(zhuǎn)化和同源重組方法，對(duì)后續(xù)研究 Plipastatin合成酶系結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)理論具有重要意義。
【附圖說明】
[0030] 圖1功能基因 sfp和degQ核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫上比對(duì)分析
[0031] A圖：功能基因 sfp與Bacillus.amyloliquefaciens subsp.plantarum UCMB5063 進(jìn)行比對(duì)；
[0032] B圖：功能基因 degQ與Bacillus.amyloliquefaciens subsp.plantarum UCMB5063 進(jìn)行比對(duì)。
[0033]圖2重組整合質(zhì)粒pDL-PSQ與同源重組原理示意圖 [0034] 圖A:重組整合質(zhì)粒pDL-PSQ示意圖；
[0035] 圖B:同源重組原理示意圖。
[0036] 圖3重組菌株目的基因 P43-sfp-degQ的擴(kuò)增（注:Μ為DNA Marker;泳道1、2、3、4為 挑取的轉(zhuǎn)化子DNA為模板，目的基因 P43-sfp-degQ的擴(kuò)增）
[0037] 圖4重組菌B.subtilis pB2_L產(chǎn)Surfactin和Plipastatin的ESI-MS圖
[0038] A圖：重組菌B·subtilispB2-L產(chǎn)Surfactin的ESI-MS圖；
[0039] B圖：重組菌B.subtilis pB2-L產(chǎn)Plipastatin的ESI-MS圖。
[0040] 圖5重組菌B.subtilis pB2-L產(chǎn)抗菌物質(zhì)的溶血活性圖和抑菌圖
[0041 ] 圖A:重組菌B.subtilis pB2_L產(chǎn)抗菌物質(zhì)的溶血活性圖
[0042] 圖B:重組菌B.subtilis pB2_L產(chǎn)抗菌物質(zhì)的抑菌圖
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段，或按照制造廠商的建議條件，實(shí)施例中涉及的菌株均屬于 現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地從公開是商業(yè)渠道獲得。
[0044] 實(shí)施例1 [0045] 1.材料與方法
[0046] 1.1菌株和質(zhì)粒
[0047] 枯草芽抱桿菌B. subtilis fmbJ(CGMCC N0.0943)、大腸桿菌Escherichia coli DH5a克隆宿主(購買自諾唯贊生物公司）、B. subtilis pB2以及枯草芽孢桿菌整合質(zhì)粒pDL (Yuan and Wong,Regulation of groE expression in Bacillus subtilis：the involvement of the sigma A-like promoter and the roles of the inverted repeat sequence(CIRCE)，1995)均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室保存;Escherichia coli T-A克 隆載體pMD 19-T(購自TaKaRa公司）。指示菌株：桃軟腐病菌Rhizopus stolonifer(AS 3.2336)，藤黃微球菌(CMCC 28001)，購于中科院微生物研究所菌種保藏中心。
[0048] 1 · 2培養(yǎng)基
[0049] LB培養(yǎng)基:蛋白胨 10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 10.0g，蒸餾水 1000mL，pH 7.0~7.2;
[0050] 10XT baase: (NH4)2S〇4 20.0g，K2HP〇4 140.0g，KH2P〇4 60.0g，Na3C6H5〇7 · 2H20 10.0g，MgS〇4 · 7H20 2.0g，加水至lOOOmL;
[0051] 種子培養(yǎng)基：牛肉浸膏5.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水 1000mL，pH7.0~7.2;
[0052] 改良Landy培養(yǎng)基：葡萄糖40.0g · L-SL-谷氨酸2.0g · L-^(NHASOa 2.3g · L-1， K2HPO4 l.Og · L_1,MgS〇4 0.5g*L_1,KCl 0.5g · L_1 ,CuS04 1.6mg · L_1 ,Fe2(S04)3 1.2mg* L-^MnSfM 0.4mg.L-SlOOmM 3-N-瑪啡啉丙磺酸(M0PS)，pH 7.0~7.2;
[0053] PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯洗凈去皮，切成lcm3小丁，稱取200-300g，煮沸半小時(shí)，八層紗 布過濾取汁，加入20.0 g葡萄糖，蒸餾水定容至lOOOmL，再加入15-20g瓊脂，115°C，30min高 壓蒸汽滅菌，pH自然；
[0054] GM 1:10 XT baase 100mL，100g · L-1 葡萄糖50mL，50g · L-1 酵母膏20mL，10g · L-1 酸水解酪蛋白20mL，2.5g · L-1色氨酸20mL，加水至lOOOmL;
[0055] GM II: 10 X T baase 100mL，lOOg · L-1 葡萄糖50mL，50g · L-1 酵母膏0.4mL，lOg · L -1 酸水解酪蛋白· 5mL，0.5mol · L-WgCh 5mL，0.05mol · L-taCh 10mL，加水至lOOOmL;
[0056] GM I、GM