專利名稱：水稻鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子新基因及抗旱耐鹽應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物工程和植物改良基因工程領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及水稻 鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子新基因及其編碼的蛋白或多肽在增強(qiáng)植物抗旱耐鹽性中的用途，以及通 過(guò)抑制所述基因或其表達(dá)的蛋白來(lái)改進(jìn)植物對(duì)鹽和/或干旱脅迫的抗性的方法及轉(zhuǎn)基因 植物。
背景技術(shù)：
全球糧食需求的增加和耕地面積的不斷減少對(duì)各國(guó)糧食安全形成持續(xù)的壓力。在 糧食生產(chǎn)中，干旱、鹽堿等是最主要的非生物脅迫，每年造成農(nóng)作物大量減產(chǎn)及品質(zhì)下降。 并且，干旱和鹽堿常相伴出現(xiàn)，例如土壤鹽堿化是干旱地區(qū)常見的一種土地退化現(xiàn)象。有資料表明，中國(guó)每年由于干旱造成的水稻損失價(jià)值至少為20億美元，而農(nóng)田的 鹽堿化也是減產(chǎn)、低產(chǎn)的主要原因。干旱和鹽堿已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)面臨的兩個(gè)嚴(yán)重問題。因此，如何提高作物對(duì)干旱和/或鹽堿的抗性能力對(duì)于提高產(chǎn)量，解決中國(guó)乃至 世界的糧食問題具有重大的意義，對(duì)于這些非生物逆境的研究是植物研究領(lǐng)域最迫切且最 具挑戰(zhàn)性的工作之一。目前已經(jīng)有一部分抗旱、耐鹽相關(guān)基因包括一些轉(zhuǎn)錄因子被克隆，而且通過(guò)基因 工程技術(shù)獲得一些抗逆植物或農(nóng)作物品系?？鼓婊蚬こ叹褪峭ㄟ^(guò)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來(lái) 改善植物的抗逆能力，而在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄因子起著關(guān)鍵作用。目前，已發(fā)現(xiàn)一些參與脅迫應(yīng)答基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。但是，由于有眾多的轉(zhuǎn)錄因 子參與復(fù)雜的植物逆境響應(yīng)過(guò)程，現(xiàn)在所發(fā)現(xiàn)的參與脅迫應(yīng)答基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子只是冰 山一角，還有許多轉(zhuǎn)錄因子有待發(fā)現(xiàn)和研究、并進(jìn)一步應(yīng)用于農(nóng)作物抗逆分子育種。因此，本領(lǐng)域迫切需要對(duì)參與脅迫應(yīng)答基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行研究，開發(fā)出可 用于農(nóng)作物抗逆育種的新方法和新品種，從而提高農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一正是提供一種新的與植物(尤其是作物)耐鹽抗旱性密切相關(guān) 的基因——水稻鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子DST，明確了該轉(zhuǎn)錄因子是植物耐鹽抗旱性的負(fù)調(diào)控因 子。本發(fā)明的另一目的是為增強(qiáng)植物對(duì)鹽堿和/或干旱脅迫的抗性提供了一種新的途徑。 本發(fā)明的另一目的是提供具有增強(qiáng)的抗旱耐鹽性的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法及轉(zhuǎn)基因植物。 本發(fā)明的另一目的是提供篩選具有優(yōu)異抗旱耐鹽性植株的方法及用該方法篩選獲得的植 物。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，其包含具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽、其保守性變異多肽、或其同源多肽。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述多肽具有Cys-2/His-2型鋅指結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述多肽參與調(diào)控過(guò)氧化物酶相關(guān)基因、控制過(guò)氧化氫的累 積和/或調(diào)控葉片氣孔的開度，從而影響水稻的抗旱和耐鹽性。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加 而形成的，且具有提高植物感旱感鹽性的由(a)衍生的多肽；或(c)具有Cys-2/His-2型鋅指結(jié)構(gòu)域，且具有提高植物感旱感鹽性的(a)和(b)中 所述多肽的同源多肽。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述植物是雙子葉植物或單子葉植物，優(yōu)選作物。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述植物選自禾本科植物、錦葵科棉屬植物、十字花科蕓苔 屬植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或傘形科植物，優(yōu)選禾本科植物。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述植物選自水稻、玉米、小麥、大麥、甘蔗、高粱、擬南芥、棉 花或油菜，更優(yōu)選水稻、玉米、小麥、大麥、甘蔗或高粱。在另一優(yōu)選例中，所述鹽是指氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉。在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種分離的多核苷酸，它包含編碼本發(fā)明多肽的 核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽或 其同源多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO :1中1-435位的核苷酸序列；或(c)與(a)-(b)中任一種核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸。在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種載體，它含有本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述載體選自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒或哺 乳動(dòng)物細(xì)胞病毒，優(yōu)選 pCAMBIA1301、pEGFP-l、pBI121、pCAMBIA1300、pCAMBIA2301 或 pHB， 更優(yōu)選 PCAMBIA1301。在本發(fā)明的第四方面中，提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明的載 體或基因組中整合有本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述宿主細(xì)胞選自原核細(xì)胞、低等真核細(xì)胞或高等真核細(xì)胞，優(yōu) 選細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞，更優(yōu)選大腸桿菌、鏈霉菌、農(nóng)桿菌、酵母菌，最優(yōu)選農(nóng)桿 菌，所述農(nóng)桿菌包括但不限于EHA105、SOUP 1301或C58，優(yōu)選EHA105。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種順式作用元件，其具有SEQ ID NO :3所述的序 列，且能夠與本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述順式作用元件的序列為TGCTANN(A/T)TTG，其中N選自A、C、 G或T。在另一優(yōu)選例中，所述順式作用元件與本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子的鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述順式作用元件與本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合具有提高植物 感旱感鹽性的作用。在本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子或多核苷酸的拮抗劑。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述拮抗劑是小分子干擾RNA、抗體或反義寡核苷酸。在本發(fā)明的第七方面，提供了一種提高植物抗旱耐鹽性的方法，所述方法包括抑
5制本發(fā)明的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子、抑制本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)、或抑制本發(fā)明的所述順式 作用元件與本發(fā)明的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。在另一優(yōu)選例中，所述抑制采用缺失、突變、RNAi、反義或顯性負(fù)調(diào)節(jié)方法進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述抑制包括使得本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子或本發(fā)明的多核苷酸序列發(fā) 生一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的取代、缺失或添加，從而使得所述植株具有提高的抗旱而 鹽性。在另一優(yōu)選例中，以SEQ ID NO 2中的氨基酸計(jì)數(shù)為準(zhǔn)，所述抑制是使得具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的第69位的天冬酰胺突變?yōu)樘於匪?、?62位的丙氨酸突變?yōu)樘K 氨酸，從而使得含有該突變序列的植株具有提高的抗旱耐鹽性。在另一個(gè)優(yōu)選例中，所述方法包括將本發(fā)明的拮抗劑作用于植物。在另一優(yōu)選例中，所述抑制包括用含有針對(duì)本發(fā)明的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的小分 子干擾RNA的載體或含有所述載體的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括使得通過(guò)上述方法獲得的具有提高抗旱耐鹽性 的植株與非轉(zhuǎn)基因植物或其它轉(zhuǎn)基因植物雜交。在另一優(yōu)選例中，所述鹽是指氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉。在本發(fā)明的第八方面，提供了一種篩選抗旱耐鹽性植株的方法，所述方法包括(i)檢測(cè)候選植株中本發(fā)明鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的水平、本發(fā)明多核苷酸的表達(dá)水 平、和/或本發(fā)明的順式作用元件與本發(fā)明的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合水平；(ii)將步驟⑴所檢測(cè)到的候選植株中的水平與對(duì)照植株中相應(yīng)的水平相比，如 果候選植株中的水平較對(duì)照植株有所降低，則表明所述植株是抗旱耐鹽性植株。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述鹽是指氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉。在本發(fā)明的第九方面，提供了一種本發(fā)明的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的制備方法，其特 征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出所述鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子。在本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子或核苷酸序列的抑制劑 或非保守性突變序列在提高植物抗旱耐鹽性中的用途。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述抑制劑是針對(duì)所述轉(zhuǎn)錄因子或核苷酸序列的小分子干擾 RNA、抗體或反義寡核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述非保守性突變序列使得包含所述非保守性突變序列的植株 中本發(fā)明鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子或核苷酸序列的翻譯或表達(dá)受到抑制，從而使其抗旱耐鹽性優(yōu) 于不包含所述非保守性突變的野生型植株。在另一優(yōu)選例中，所述非保守性突變序列是SEQ ID NO :1的核苷酸序列的第205 位堿基A突變?yōu)镚和第484位堿基G突變?yōu)锳、或SEQ ID NO 2的氨基酸序列的第69位天 冬酰胺突變?yōu)樘於匪岷偷?62位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述提高植物抗旱耐鹽性包括(i)將所述抑制劑直接作用于植物；(ii)將所述非保守性突變序列導(dǎo)入植物；或(iii)設(shè)計(jì)針對(duì)所述非保守性突變序列的分子標(biāo)記，并用該分子標(biāo)記對(duì)包含所述非保守性突變序列的突變體與其它水稻品種的雜交后代進(jìn)行選擇，從而篩選出攜帶所述非 保守性突變序列的個(gè)體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述分子標(biāo)記為序列如SEQ ID N0:10和SEQ IDN0 11 所示的引物對(duì)，和/或序列如SEQ ID N0:12和SEQ ID NO :13所示的引物對(duì)。在本發(fā)明的又一方面，提供了一種提高植物抗旱耐鹽性的方法，所述方法包括 (A)提供本發(fā)明的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子或核苷酸序列的抑制劑或非保守性突變序列；(B)對(duì) 植物進(jìn)行選自下組的一種或多種處理(i)將所述抑制劑直接作用于植物；(ii)將所述非 保守性突變序列導(dǎo)入植物；或(iii)設(shè)計(jì)針對(duì)所述非保守性突變序列的分子標(biāo)記，并用該 分子標(biāo)記對(duì)包含所述非保守性突變序列的突變體與其它水稻品種的雜交后代進(jìn)行選擇，從 而篩選出攜帶所述非保守性突變序列的個(gè)體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述分子標(biāo)記為序列如SEQ ID N0:10和SEQ IDN0 11 所示的引物對(duì)，和/或序列如SEQ ID N0:12和SEQ ID NO :13所示的引物對(duì)。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括(1)用含有本發(fā)明鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的非保守性突變序列或本發(fā)明多核苷酸的非 保守性突變序列的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官；(2)選擇轉(zhuǎn)入所述非保守性突變序列的植物細(xì)胞、組織或器官；和(3)將步驟⑵中的植物細(xì)胞、組織或器官再生成植株，其中，所得的轉(zhuǎn)基因植物的抗旱耐鹽性較未轉(zhuǎn)化的植物有所增強(qiáng)。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括使所得的轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物或其它轉(zhuǎn) 基因植物雜交，從而獲得包含所述非保守性突變序列的雜交后代，所述雜交后代的抗旱耐 鹽性較未轉(zhuǎn)化的植物有所增強(qiáng)，優(yōu)選所述雜交后代具有穩(wěn)定的遺傳性狀。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括用設(shè)計(jì)針對(duì)所述非保守性突變序列的分子標(biāo)記 對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的雜交后代進(jìn)行篩選，以獲得具有改良的抗旱耐鹽性的植物。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖1 水稻DST基因序列(圖1A)及其編碼的氨基酸序列(圖1B)。圖2 水稻DST基因的突變體dst與野生型在干旱和鹽堿條件下的表型比較。各 照片的左側(cè)為野生型(中花11，ZH11)，右側(cè)為突變體dst。圖3 野生型、通過(guò)互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)入DST基因的dst突變體、以及通過(guò)RNAi降低DST 功能的植株在干旱和鹽堿條件下的表型比較。圖4 采用Matchmaker GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)3 (Clontech)的DST轉(zhuǎn)錄激活分析。圖 5 凝膠滯后實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)結(jié)果。圖6 禾本科作物DST同源蛋白鋅指結(jié)構(gòu)域的序列比對(duì)分析。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)期而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了一種水稻鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子新基因DST， 抗旱耐鹽性相關(guān)基因DST (Drought and Salt Tolerance gene)，并證明了該基因?yàn)榭购?、耐鹽的負(fù)調(diào)控因子，可控制植物抗旱和耐鹽性，其表達(dá)抑制可增強(qiáng)植物對(duì)鹽或干旱脅迫的抗 性，因而在植物的抗旱和耐鹽等抗逆性的分子育種中起重要作用。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完 成了本發(fā)明。具體而言，本發(fā)明人通過(guò)在鹽脅迫下大規(guī)模篩選水稻突變體庫(kù)(EMS誘變)和圖位 克隆技術(shù)克隆了控制水稻抗旱、耐鹽的新基因DST。DST基因的基因組長(zhǎng)度為906bp，沒有內(nèi) 含子，全長(zhǎng)0RF(open reading-frame)長(zhǎng)度為906bp。該基因編碼301個(gè)氨基酸、約29KDa 的具有保守鋅指結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白，該蛋白為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。表型鑒定結(jié)果表明該基因的突變體(例如DST基因存在2個(gè)堿基變異，引起2個(gè) 氨基酸發(fā)生了替換)表現(xiàn)既抗旱又耐鹽，同時(shí)通過(guò)RNAi把該基因表達(dá)下調(diào)時(shí)也產(chǎn)生較強(qiáng)的 抗旱和耐鹽性。生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DST是一個(gè)既有轉(zhuǎn)錄激活域，又有DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄因子；基因 芯片分析表明DST作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游一系列基因。功能研究顯示突變體與野生型相比，在氣孔周圍累積較多的過(guò)氧化氫(H202)，氣孔 開度較小，在干旱脅迫下葉片保持較高的相對(duì)含水量，因此突變體的抗旱性較強(qiáng)；另外，由 于突變體的氣孔開度較小，氣孔導(dǎo)度較低，水分蒸騰速度較慢，從而減少Na+離子從根部運(yùn) 到地上部(葉片等)，降低Na+毒害，因此提高耐鹽性。該研究表明DST參與調(diào)控過(guò)氧化物 酶相關(guān)基因、控制過(guò)氧化氫(H202)的累積、調(diào)控葉片氣孔的開度，從而影響水稻的抗旱和耐 鹽性。通過(guò)上述研究表明DST基因?yàn)榭购怠⒛望}的負(fù)調(diào)控因子，其表達(dá)抑制可增強(qiáng)植物 對(duì)鹽或干旱脅迫的抗性，該特性可用于生產(chǎn)對(duì)鹽脅迫和干旱抗性明顯提高的轉(zhuǎn)基因植物。 因此，DST基因在提高作物對(duì)鹽和干旱等逆境脅迫能力方面具有較大的應(yīng)用潛力。并且，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索發(fā)現(xiàn)，在高梁(Sorghum bicolor)的基因組中有一個(gè)DST的 同源基因，蛋白的相似性為54. 3%;在玉米(Zea mays)的基因組中有三個(gè)DST的同源基因， 蛋白的相似性分別為51. 7%,36. 和33. 5%;在大麥(Hordeumvulgare)的基因組中有一 個(gè)DST的同源基因，蛋白的相似性為38.4% ；在甘蔗(Saccharum officinarum)的基因組 中有三個(gè)DST的同源基因，蛋白的相似性分別為38. 2%,38. 2%和34. 5%。這些同源基因 都具有保守的C2H2類型鋅指結(jié)構(gòu)域，同時(shí)在N端的相似性較高，推測(cè)其它植物(優(yōu)選禾本 科植物)的DST同源基因具有與水稻DST基因相似的功能。DST蛋白或多肽及其編碼序列在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“DST蛋白或多肽”、“DST基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽”或“鋅指蛋 白轉(zhuǎn)錄因子”是指由本發(fā)明的DST基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽，該定義中也包括所述蛋白質(zhì)或 多肽的保守性變異多肽、或其同源多肽。它們均具有Cys-2/His-2型鋅指結(jié)構(gòu)域，且所述蛋 白或多肽表達(dá)受到抑制后，可提高植物干旱或鹽脅迫抗性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控過(guò)氧化物酶相關(guān)基因、控制 過(guò)氧化氫的累積和/或調(diào)控葉片氣孔的開度，從而影響水稻的抗旱和耐鹽性。所述DST蛋白質(zhì)或多肽的序列可選自(a)具有SEQ ID NO :2氨基酸序列的多肽； (b)將SEQ ID NO :2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的， 且具有提高植物感旱感鹽性的由(a)衍生的多肽；或(c)具有Cys-2/His-2型鋅指結(jié)構(gòu)域， 且具有提高植物感旱感鹽性的(a)和(b)中所述多肽的同源多肽。優(yōu)選所述蛋白質(zhì)或多肽能與TGCTANN(A/T) TTG結(jié)合，其中N代表A、C、G或T。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重 組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。本 發(fā)明中DST蛋白或多肽優(yōu)選由禾本科植物(優(yōu)選水稻)DST基因或其同源基因或家族基因 編碼。本發(fā)明蛋白質(zhì)或多肽的變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50 個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè) 以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或 相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)或多肽的功能，例如本發(fā)明的DST蛋白 質(zhì)或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有增強(qiáng)植物重金屬或鹽脅迫抗性 的活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本領(lǐng)域常識(shí)和/或常規(guī)試驗(yàn)很容易地確定這些變異方式， 而不會(huì)影響蛋白或多肽的活性。在本發(fā)明中，“保守性變異多肽”指與SEQ ID NO 2的氨基酸序列相比，有至多20 個(gè)，較佳地至多10個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸 所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)下表進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生 可采用輻射或暴露于誘變劑下來(lái)產(chǎn)生隨機(jī)誘變，也可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其它已知 的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)獲得上述(b)中的蛋白質(zhì)或多肽?？衫镁幋a所述蛋白質(zhì)或多肽的編 碼序列來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，并觀察該轉(zhuǎn)基因植物的性狀是否發(fā)生變化來(lái)篩選和鑒別所得蛋 白質(zhì)或多肽。該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo) 突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與DST蛋白編碼序列雜交的序列所編碼的蛋白、以及 利用抗DST蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還可使用其它多肽，如包含DST蛋白或 其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了 DST蛋白的可溶性片段。通 常，該片段具有DST蛋白序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較 佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨 基酸。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以是糖基化的，或可以 是非糖基化的。該術(shù)語(yǔ)還包括DST蛋白的活性片段和活性衍生物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“DST基因”、“植物DST基因”或“本發(fā)明轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列” 可互換使用，均是指一種編碼本發(fā)明所述的DST蛋白或多肽的序列，其與水稻DST基因序列 (參見SEQ ID NO :1)可高度同源或在嚴(yán)格條件下與所述基因序列雜交的分子或與上述分 子高度同源的家族基因分子，所述基因表達(dá)受到抑制對(duì)植物干旱或鹽脅迫抗性具有一定的 改善作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述多核苷酸是(a)具有SEQ ID NO 1的核苷酸序 列；(b)具有SEQ ID NO :1中1-435位的核苷酸序列；或(c)與(a)-(b)中任一種核苷酸序 列互補(bǔ)的多核苷酸。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指⑴在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和 洗脫，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或⑵雜交時(shí)加有變性劑，如50% (v/v)甲酰胺，0. 1% 小牛血清/0. Ficoll，42°C等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在50%，優(yōu)選 55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu) 選是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。例如，所述序列可為(a)中所限定序列的互補(bǔ)序列。本發(fā)明的DST基因核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人 工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放 閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備 的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò) 增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。應(yīng)理解，本發(fā)明的DST基因優(yōu)選獲自水稻，獲自其它植物的與水稻DST基因高度同 源(如具有50%以上，優(yōu)選55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上， 更優(yōu)選85 %以上如85 %、90 %、95 %、甚至98 %序列相同性)的其它基因也在本發(fā)明優(yōu)選考 慮的等同范圍之內(nèi)。比對(duì)序列相同性的方法和工具也是本領(lǐng)域周知的，如BLAST。棺物及其對(duì)鹽和/或干旱脅迫的抗件如本文所用，所述的“植物”包括(但不限于)禾本科植物、錦葵科棉屬植物、十字 花科蕓苔屬植物、菊科植物、茄科植物、唇形科植物或傘形科植物等，優(yōu)選所述植物為禾本 科植物，更優(yōu)選為禾本科作物。例如，所述植物可選自水稻、玉米、小麥、大麥、甘蔗、高粱、 擬南芥、棉花或油菜，更優(yōu)選水稻、玉米、小麥、大麥、甘蔗或高粱。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“作物”是指在糧、棉、油等農(nóng)業(yè)和工業(yè)中具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物， 其經(jīng)濟(jì)價(jià)值可體現(xiàn)在該植物的種子、果實(shí)、根、莖、葉等有用部位上。作物包括但不限于雙 子葉植物或單子葉植物。優(yōu)選的單子葉植物為禾本科植物，更優(yōu)選水稻、小麥、大麥、玉米、 高粱等。優(yōu)選的雙子葉植物包括但不限于錦葵科棉屬植物、十字花科蕓苔屬植物等，更優(yōu) 選棉花、油菜等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“鹽脅迫”是指指植物在含有高濃度鹽分的土壤或者水體中生 長(zhǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，甚至死亡的現(xiàn)象。造成鹽屬脅迫的鹽類包括(但不限于)氯 化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉。本發(fā)明的DST基因或其編碼的蛋白質(zhì)或多肽可增強(qiáng)植物 對(duì)鹽脅迫的抗性，該抗性的提高可表現(xiàn)為與未經(jīng)所述基因、蛋白質(zhì)或多肽處理的對(duì)照植物 相比所述植物在高濃度鹽分存在下的生長(zhǎng)發(fā)育未受影響或受影響程度降低、或可在更高 的鹽濃度下存活。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“干旱脅迫”是指植物在缺水的土壤或者其它干旱環(huán)境中生長(zhǎng) 時(shí)，其生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，甚至死亡的現(xiàn)象。本發(fā)明的DST基因或其編碼的蛋白質(zhì)或多肽可 增強(qiáng)植物對(duì)干旱脅迫的抗性，該抗性的提高可表現(xiàn)為與未經(jīng)所述基因、蛋白質(zhì)或多肽處理 的對(duì)照植物相比所述植物在缺水條件下的生長(zhǎng)發(fā)育未受影響或受影響程度降低、或可在 更干旱的條件下存活。載體、宿主及轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明還涉及包含DST基因的載體，以及用該載體經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞， 以及通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得高表達(dá)DST的轉(zhuǎn)基因植物。通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984 ；224 1431)，可利用本發(fā)明的編碼序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的DST蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼DST蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重 組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；和(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)或多肽。本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“載體”與“重組表達(dá)載體”可互換使用，指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、 噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其它載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi) 復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟 動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含DST編碼序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯 控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。 所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體 還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明中優(yōu)選使用pEGFP-l、pBI121、 PCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA2301 或 pHB。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或 是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌， 鏈霉菌屬、農(nóng)桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞等。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用農(nóng)桿菌作為宿主 細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將 會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用 于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增 強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化植物可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物 細(xì)胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得抗病性提高的植物。獲得的轉(zhuǎn)化子 可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用 的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生 長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì) 胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞膜上表達(dá)或分泌到細(xì)胞外。如果 需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些 方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)
口 o順式作用元件
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“順式作用元件”是指存在于基因旁側(cè)序列中，能影響基因表達(dá) 的序列，其作用是參與基因表達(dá)的調(diào)控。順式作用元件本身不編碼任何蛋白質(zhì)，僅僅提供一 個(gè)作用位點(diǎn)，其要與反式作用因子相互作用而起作用。本發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的DST蛋白具有DNA的結(jié)合能力，其結(jié)合的核心元 件為順式作用元件TGCTANN(A/T)TTG，N代表A、C、G或T。本發(fā)明的順式作用元件與DST轉(zhuǎn) 錄因子結(jié)合，并使得植物的感旱感鹽性提高，從而降低了植物的抗旱耐鹽性。優(yōu)選所述順式 作用元件與DST的鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合。反之，如果本發(fā)明順式作用元件與DST轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合受到抑制，則可使得植物 的抗旱耐鹽性提高。提高棺物抗旱耐鹽件的方法如本文所述，本發(fā)明的DST蛋白、其編碼序列或DST蛋白與其順式作用元件的結(jié)合 與植物的抗旱耐鹽性有密切的聯(lián)系DST蛋白、其編碼序列或DST蛋白與其順式作用元件的 結(jié)合受到抑制，則植物的抗旱耐鹽性有所提高。因此，本發(fā)明還提供了通過(guò)抑制DST蛋白、其編碼序列、或DST蛋白與其順式作用 元件的結(jié)合來(lái)提高植物抗旱耐鹽性的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)使用本發(fā)明DST蛋白或其編碼序列的拮抗劑 來(lái)抑制其表達(dá)。所述拮抗劑包括但不限于小分子干擾RNA、抗體、顯性負(fù)調(diào)節(jié)或反義寡核 苷酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在知曉了 DST蛋白及其編碼序列的前提下，可通過(guò)常規(guī)方法和 試驗(yàn)篩選并獲得所述的拮抗劑。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“非保守性突變”是指使得本發(fā)明的DST蛋白或其編碼序列發(fā) 生一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸的取代、缺失或添加(優(yōu)選為非保守)，從而使得所述植株具 有提高的抗旱耐鹽性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法使得本發(fā)明的DST蛋白 或其編碼序列發(fā)生非保守性突變。例如，可通過(guò)DST蛋白編碼序列中核苷酸的突變，使得具 有SEQ ID NO :2的DST蛋白中的氨基酸序列發(fā)生非保守突變，從而使得含有該突變序列的 植株具有提高的抗旱耐鹽性，例如使得氨基酸序列的第69位的天冬酰胺突變?yōu)樘於匪帷?第162位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，可制備DST基因或蛋白表達(dá)受到抑制的轉(zhuǎn)基因植 物，并任選地用所述轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物或其它轉(zhuǎn)基因植物雜交。例如，可用含有針 對(duì)DST蛋白或其編碼蛋白的小分子干擾RNA的載體、反義載體、顯性負(fù)調(diào)節(jié)載體或含有所述 載體的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化植物。篩選抗旱耐鹽性植株的方法根據(jù)本發(fā)明DST蛋白及其編碼蛋白的特性，本發(fā)明還進(jìn)一步包括篩選抗旱耐鹽性 植株的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的篩選方法包括(i)檢測(cè)候選植株中本發(fā)明DST鋅指 蛋白轉(zhuǎn)錄因子的水平、其編碼多核苷酸的表達(dá)水平、和/或本發(fā)明順式作用元件與DST鋅指 蛋白轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合水平；(ii)將步驟(i)所檢測(cè)到的候選植株中的水平與對(duì)照植株中相 應(yīng)的水平相比，如果候選植株中的水平較對(duì)照植株有所降低，則表明所述植株是抗旱耐鹽 性植株。
在另一實(shí)施方式中，可運(yùn)用本領(lǐng)域已知的分子標(biāo)記選擇技術(shù)將抗旱耐鹽DST基因 導(dǎo)入其它品種中以篩選和培育抗旱耐鹽新品種，該方法通過(guò)常規(guī)的雜交育種方法，不需要 轉(zhuǎn)基因，避免轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)，因此具有優(yōu)勢(shì)。所述方法可包括設(shè)計(jì)針對(duì)所述非保守性突 變序列的分子標(biāo)記，并用該分子標(biāo)記對(duì)包含本發(fā)明非保守性突變序列的突變體與其它水稻 品種的雜交后代進(jìn)行選擇，從而篩選出攜帶所述非保守性突變序列的個(gè)體。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)鑒別了 DST基因及其編碼的蛋白質(zhì)或多肽，并明確了其與植物抗旱耐鹽性之 間的關(guān)系，從而為研究植物的抗旱耐鹽性提供了一種新的方法；(2)提供了具有改良鹽或干旱脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因植物，為糧、棉、油等生產(chǎn)和加工 提供了優(yōu)良原料和產(chǎn)品；(3)提供了利用分子標(biāo)記對(duì)抗旱耐鹽雜交后代的選擇方法，可實(shí)現(xiàn)通過(guò)常規(guī)的雜 交育種方法，不需要轉(zhuǎn)基因，避免轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)。本發(fā)明提供了改善植物鹽或干旱脅迫抗性的新途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前景。實(shí)施例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件(例如可參照 如Sambrook等人的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，英文名稱為《Molecular Cloning :A Laboratory Manual)) (2001, Cold Spring Harbor Laboratory press) iiK^MftjlJiar^ltflB'f 建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例部分中使用的各種培養(yǎng)基(YEB液體培養(yǎng)基、AB液體培養(yǎng)基、AAM液體培養(yǎng) 基、N6D2培養(yǎng)基、N6D2C培養(yǎng)基、共培養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基N6D2S 1、N6D2S2、預(yù)分化培養(yǎng)基、 分化培養(yǎng)基、1/2 MS0H培養(yǎng)基、水稻培養(yǎng)液、SD培養(yǎng)基等)按照相關(guān)文獻(xiàn)的記載配制(分子 克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989 ；Hiei, Y.等， Plant J. ，1994，6，271-282)。實(shí)施例1 :DST的水稻轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)1.高抗旱耐鹽的DST突變體的獲得、性狀和亞細(xì)胞定位用0. 6%濃度的EMS處理水稻種子構(gòu)建包含有約9000個(gè)株系的水稻突變體庫(kù)。在 140mM氯化鈉濃度的鹽脅迫下大規(guī)模篩選水稻突變體庫(kù)，經(jīng)過(guò)多次用140mM氯化鈉濃度的 鹽脅迫和20% PEG4000模擬干旱脅迫對(duì)候選突變體進(jìn)行驗(yàn)證、觀察耐鹽抗旱表型，獲得一 份表現(xiàn)高度抗旱、耐鹽的突變體(dst)。用分子標(biāo)記將DST基因初定位在水稻第三號(hào)染色體上。用dst突變體與感鹽品 種雜交構(gòu)建大規(guī)模F2群體，用分子標(biāo)記從該群體中篩選交換個(gè)體并結(jié)合交換個(gè)體的基因 型和表型，開展圖位克隆，成功克隆了 DST基因。該DST基因編碼一個(gè)具有保守的C2H2類 型鋅指結(jié)構(gòu)域的功能未知鋅指蛋白(轉(zhuǎn)錄因子)，在水稻基因組中沒有找到DST的同源拷貝，在植物擬南芥基因組中沒有發(fā)現(xiàn)同源基因。該基因的基因組長(zhǎng)度為906bp，沒有內(nèi)含子， 全長(zhǎng)0RF(open reading-frame)長(zhǎng)度為906bp，編碼301個(gè)氨基酸，蛋白產(chǎn)物分子量估計(jì)為 29KDa(圖1)。通過(guò)序列比較分析表明，在突變體中DST基因存在2個(gè)堿基變異，引起2個(gè) 氨基酸發(fā)生了替換(第69位的天冬酰胺突變?yōu)樘於匪岷偷?62位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨 酸)，產(chǎn)生抗旱、耐鹽表型，這表明DST為抗旱、耐鹽的負(fù)調(diào)控因子。將DST與GFP(綠色熒光蛋白)進(jìn)行融合，通過(guò)基因槍的方法轉(zhuǎn)到洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn) 行瞬時(shí)表達(dá)，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察熒光在細(xì)胞內(nèi)的位置，來(lái)考察DST的亞細(xì)胞定位。 通過(guò)亞細(xì)胞定位表明DST特異性定位于細(xì)胞核。2. DST基因組片段的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒構(gòu)建將野生型水稻BAC克隆用ApaLI單切后用T4DNA聚合酶補(bǔ)平，然后再用Sail進(jìn)行 酶切，回收4. 6-kb的野生型品種基因組片段(包含DST的全長(zhǎng)0RF、啟動(dòng)子區(qū)以及終止密碼 子的下游區(qū))。植物表達(dá)雙元載體pCAMBIA1301 (購(gòu)自CAMBIA)用EcoRI酶切后用T4DNA聚 合酶補(bǔ)平，再用Sail進(jìn)行酶切，然后與上述回收片段進(jìn)行連接，從而成功構(gòu)建p-DST質(zhì)粒， 用于轉(zhuǎn)化突變體，進(jìn)行互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。所用工具酶均購(gòu)自New England Biolabs。 3. DST-RNAi表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建用5'和3'端的寡核苷酸為引物(SEQ ID NO :4和5)，用PCR進(jìn)行擴(kuò)增DST的特 異性編碼區(qū)(535-bp)片段，連接到載體pl300RNAi (用pCAMBIA1300改造獲得，增加了過(guò)氧 化氫酶內(nèi)含子(Catalase intron)作為連接子，兩側(cè)各有poly-A和poly-T。這樣成功構(gòu)建 DST-RNAi 質(zhì)粒。5'端寡核苷酸引物序列為5' -AAGCTTTCCTTGCGAAGCCAAATAGC-3‘ (SEQ ID NO. 4)3'端引物序列為5' -GGATCCCGAGGCTCAAGTTGAGGTCGA-3‘ (SEQ ID NO. 5)4. DST轉(zhuǎn)化水稻將上述二種重組質(zhì)粒通過(guò)凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105。在每200 u 1EHA105感 受態(tài)細(xì)胞中加入0. 5-1 y g(約10 ill)質(zhì)粒DNA，混勻，依次于冰上、液氮和37°C水浴中各放 置5分鐘；用新鮮的YEB液體培養(yǎng)基稀釋至1ml，于28°C振搖培養(yǎng)2_4小時(shí)；取200 u 1涂布 于含抗生素Kan(50iig/ml)的YEB平板上，28°C培養(yǎng)2-3天。長(zhǎng)出的菌落在含Kan (50 y g/ ml)的YEB平板上劃單菌，連續(xù)劃3次。從YEB平板上挑取農(nóng)桿菌單菌落接種到3ml含 50ug/ml Kan抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中于28°C振搖培養(yǎng)過(guò)夜。第2天，按接種量轉(zhuǎn) 接入50ml含抗生素50 u g/ml Kan的AB液體培養(yǎng)基中，200rpm繼續(xù)振搖培養(yǎng)至0D6(1(1為0. 6 至0. 8左右時(shí)，將新鮮的農(nóng)桿菌菌液于5000rpm、4°C離心5分鐘，收集并重懸于1/3體積的 AAM液體培養(yǎng)基中，此時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化水稻各種受體材料。本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻中花11 (或它的突變體)的幼胚愈 傷。取授粉后12-15天的中花11未成熟種子經(jīng)70%乙醇浸泡1分鐘后，于NaCIO溶液中 (與水1 3混合，加2-3滴吐溫20)消毒90分鐘以上，用無(wú)菌水沖洗4-5次，然后用解剖 刀和攝子挑出幼胚并接種于N6D2培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，在26士 1°C、避光條件下培育，4 天后可用于轉(zhuǎn)化。將如上獲得的幼胚愈傷組織浸泡入新鮮的AAM農(nóng)桿菌菌液中并不時(shí)搖動(dòng)，20分鐘后將水稻材料移出，在無(wú)菌濾紙上吸去過(guò)多的菌液，隨即轉(zhuǎn)移到鋪有無(wú)菌濾紙的N6D2C培養(yǎng) 基上，于26°C共培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)時(shí)，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮作為農(nóng)桿菌Vir基 因活化物，使用濃度為lOOiimol/L。3天后，從共培養(yǎng)培養(yǎng)基上取出愈傷組織，切去胚芽并轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基N6D2S1 (含 25mg/l Hyg的N6D2培養(yǎng)基)進(jìn)行選擇培養(yǎng)。7_12天后將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)到N6D2S2 (含 50mg/l Hyg的N6D2培養(yǎng)基)選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選。10-12天后，將生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周左右，再 移至分化培養(yǎng)基上分化(12小時(shí)光照/天)。再生的小苗在1/2MS0H培養(yǎng)基上生根壯苗，隨 后移入人工氣候室盆土栽培。獲得的再生植株移栽成活后，用本領(lǐng)域已知的方法，通過(guò)檢測(cè)葡萄糖苷酶 (beta-glucuronidase, GUS,參見文獻(xiàn) Jefferson 等 EMB0 J. 6，3901-3907，1987)或用 0. 的除草劑涂抹葉片，鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株；提取陽(yáng)性植株葉片總DNA，經(jīng)PCR進(jìn)一步鑒定 轉(zhuǎn)化植株。在后繼的試驗(yàn)中，用上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物的T2代進(jìn)行干旱、鹽脅迫(140mM NaCl)處理，觀察抗旱、耐鹽性表型，驗(yàn)證DST基因的功能。棚列2 ■賄_士綠肝1、腿迫1 式駘取實(shí)施例1中獲得的轉(zhuǎn)基因水稻的種子，于45°C烘箱內(nèi)打破休眠一周后，用室溫 自來(lái)水浸種3天，37°C催芽2天。等萌發(fā)后點(diǎn)播于96孔板。然后移入光照培養(yǎng)箱，30°C培 養(yǎng)，每天光照13小時(shí)。1天后，溫度逐步降低到28°C、26°C再各培養(yǎng)一天，夜間以20°C進(jìn)行 培養(yǎng)。等幼苗基本出齊后自來(lái)水換成水稻培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)約14天后，幼苗長(zhǎng)至兩葉一心期，用含有140mM的NaCl的水稻培養(yǎng)進(jìn)行鹽處 理12天，或用含20% (m/v)PEG-4000的水稻培養(yǎng)液進(jìn)行PEG處理7天，以模擬干旱脅迫。對(duì)于在PVP管(聚乙烯吡咯烷酮管，高1.2米，直徑20厘米，管的底部有兩個(gè)可以 排水的孔)中進(jìn)行的干旱處理，將在培養(yǎng)箱中水培了 25天的苗移栽到裝有土壤的PVP管 中，置人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)。溫度為24°C 30°C，濕度為50% 60%。移栽30天后將 水倒掉，并打開底部的排水孔進(jìn)行排水，進(jìn)行干旱處理12天。試驗(yàn)結(jié)果如圖2和圖3所示。如圖2所示，水稻突變體dst比野生型(中花11， ZH11)明顯提高抗旱性和耐鹽性。通過(guò)觀察比較還發(fā)現(xiàn)突變體與野生型相比，在氣孔周圍 累積較多的過(guò)氧化氫(H202)，氣孔開度較小，在干旱脅迫下葉片保持較高的相對(duì)含水量，因 此突變體的抗旱性較強(qiáng)；另外，由于突變體的氣孔開度較小，氣孔導(dǎo)度較低，水分蒸騰速度 較慢，從而減少Na+離子從根部運(yùn)到地上部(葉片等)，降低Na+毒害，因此提高耐鹽性。由圖3可見把野生型(中花11，ZH11)的DST基因組片段通過(guò)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)入dst 突變體中，轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)(complemented)株系恢復(fù)了野生型的感旱感鹽的表型；而通過(guò) RNAi (轉(zhuǎn)化中花11)把DST的表達(dá)量降低時(shí)，使中花11的抗旱性和耐鹽性明顯提高。該結(jié)果表明成功克隆了 DST基因和通過(guò)DST的基因工程可顯著提高水稻的抗逆 性。實(shí)施例3 :DST的轉(zhuǎn)錄激活活性分析實(shí)驗(yàn)用Matchmaker GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)3 (Clontech)對(duì)DST的轉(zhuǎn)錄激活進(jìn)行分析。 為了構(gòu)建陽(yáng)性對(duì)照載體PAD，將NLS和GAL4的激活域序列和GAL4的DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建
16到pGBKT7載體(購(gòu)自Clontech)上，其中pAD是將pGADT7的NLS和AD用PCR方法擴(kuò)增連 到 pGBKT7 的 BamHI 和 Sail 上(引物為 SEQ ID NO 6 和 7)。然后用PCR方法擴(kuò)增DST的全長(zhǎng)0RF(引物為SEQ ID NO :8和9)，經(jīng)測(cè)序正確后 構(gòu)建到PGBKT7載體的BamHI和Sail上，從而與GAL4的DNA結(jié)合域融合，獲得pGBKT7_DST 載體。將各種載體轉(zhuǎn)化到酵母菌種AH109中，稀釋生長(zhǎng)過(guò)夜的菌種，涂在缺Trp或缺少三種 氨基酸(-Trp/-HiS/-Ade)的SD培育基上，然后觀測(cè)菌種生長(zhǎng)情況，測(cè)定DST的轉(zhuǎn)錄激活活 性。引物寡核苷酸序列為5' -AAAGGATCCAAGCGGAATTAATTCCCGAG-3' (SEQ ID NO 6)；5' -AAAGTCGACCCTCTTTTTTTGGGTTTGGTGG-3' (SEQ ID NO 7)；5' -AAAGGATCCTGATGGACTCCCCGTCGCCT-3' (SEQ ID NO 8)；5' -AAAGTCGACCGAGGCTCAAGTTGAGGTCGAG-3' (SEQ ID N0 :9)。結(jié)果如圖4所示。由圖可見水稻的DST蛋白具有轉(zhuǎn)錄激活活性；而突變的DST蛋 白和缺失N端的蛋白則喪失了轉(zhuǎn)錄激活活性。該結(jié)果顯示pGBKT7-DST具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活活性，并且轉(zhuǎn)錄激活在N端，表明DST 是具有轉(zhuǎn)錄激活的轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)施例4 :DST蛋白質(zhì)分析和凝膠滯后實(shí)驗(yàn)1、原核蛋白表達(dá)從pGBKT7-DST載體上用EcoRI和Sal I將DST的全長(zhǎng)cDNA切下，然后重組到 pET32a(+)。將重組有DST的原核表達(dá)載體pET32a (+)轉(zhuǎn)化入BL21，IPTG誘導(dǎo)原核表達(dá)，然 后用His-tag柱(珠)純化蛋白。2、抗體制備用以上的純化蛋白采用常規(guī)方法對(duì)兔進(jìn)行免疫以制備DST的抗體。3、合成探針，用生物素進(jìn)行標(biāo)記，PAGE膠進(jìn)行純化，電洗脫進(jìn)行回收。4、將標(biāo)記的探針與原核表達(dá)并純化的DST蛋白進(jìn)行反應(yīng)，然后跑Native-PAGE電 泳，用半干轉(zhuǎn)膜法將探針轉(zhuǎn)到尼龍膜上后壓到X-光片進(jìn)行放射自顯影，觀察滯后條帶。試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5可見DST具有DNA的結(jié)合能力(DNA-binding)，DST 結(jié)合的核心元件為順式作用元件TGCTANN(A/T)TTG(SEQ ID NO :3)。本研究表明DST與該順式作用元件的結(jié)合，可調(diào)節(jié)其下游基因的表達(dá)，從而影響 植物的抗旱耐鹽性。因此，DST與順式作用元件的結(jié)合對(duì)其在抗旱耐鹽的負(fù)調(diào)控中發(fā)揮重 要作用。實(shí)施例5.不同植物中DTS同源基因的存在數(shù)據(jù)庫(kù)搜索(http://plantta.jcvi.org/index.shtml)發(fā)現(xiàn)，在高梁 (Sorghumbicolor)的基因組中有一個(gè)DST的同源基因，蛋白的相似性為54. 3% ；在玉米 (Zeamays)的基因組中有三個(gè)DST的同源基因，蛋白的相似性分別為51.7%、36. 和 33.5% ；在大麥(Hordeum vulgare)的基因組中有一個(gè)DST的同源基因，蛋白的相似性為 38. 4%;在甘蔗(Saccharum officinarum)的基因組中有三個(gè)DST的同源基因，蛋白的相似 性分別為 38. 2%、38. 2%和 34. 5%。這些同源基因都具有保守的C2H2類型鋅指結(jié)構(gòu)域，它們的鋅指結(jié)構(gòu)域完全一樣，同時(shí)在N端的相似性較高(圖6顯示了這些同源基因所共有的序列，該序列為DGKDVRLFPC LFCNKKFLKSQALGGHQNAHKKERSIGWNPYFYM, BP SEQ ID NO 2 的第 42-85 位)。C2H2 類型鋅指 蛋白由鋅指結(jié)構(gòu)域與順式作用元件相結(jié)合，因此這些同源基因與順式作用元件均存在對(duì)應(yīng) 關(guān)系，這表明其它禾本科作物的DST同源基因具有與水稻DST基因相似的功能。實(shí)施例6.水稻等農(nóng)作物DST基因的分子標(biāo)記輔助詵擇技術(shù)在農(nóng)作物抗逆件育種 改良中的應(yīng)用通過(guò)化學(xué)誘變(EMS)使DST基因發(fā)生2個(gè)堿基變異(第205位堿基A突變?yōu)镚和 第484位堿基G突變?yōu)锳)，引起2個(gè)氨基酸發(fā)生了替換(第69位的天冬酰胺突變?yōu)樘於?酸和第162位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸)，產(chǎn)生抗旱、耐鹽表型。在該基因內(nèi)設(shè)計(jì)如下所示的 二對(duì)引物SNP5和SNP3，使得擴(kuò)增產(chǎn)物分別包含第一個(gè)點(diǎn)突變和第二個(gè)點(diǎn)突變。SNP-5S :ATGGACTCCCCGTCGCCT (SEQ ID NO 10)SNP-5A :GTGCGCCGGGAGAAGCCC (SEQ ID NO 11)SNP-3S :GCGGTGCCGACGTCGTTCCC (SEQ ID NO : 12)SNP-3A :GCCGCCGTCGTCGTCGTCTTC (SEQ ID NO 13)第一個(gè)突變位點(diǎn)形成了 ScrFI的酶切位點(diǎn)，而第二個(gè)點(diǎn)突變使BstUI的酶切位點(diǎn) 喪失。引物SNP5擴(kuò)增的產(chǎn)物用ScrFI進(jìn)行酶切，野生型片段可以切下311bp+85bp+31bp， 而突變體片段可以切下202bp+109bp+85bp+3 lbp，從而產(chǎn)生多態(tài)性；引物SNP3擴(kuò)增的 產(chǎn)物用BstUI進(jìn)行酶切，野生型片段可以切下66bp+40bp+25bp，而突變體片段可以切下 91bp+40bp，從而也產(chǎn)生多態(tài)性。由此，這兩對(duì)引物SNP5和SNP3可以作為分子標(biāo)記，應(yīng)用于 分子標(biāo)記輔助選擇育種中。利用該抗旱耐鹽的dst突變體與水稻推廣品種雜交，通過(guò)其中一個(gè)分子標(biāo)記或二 個(gè)分子標(biāo)記對(duì)雜交后代進(jìn)行選擇，選出了攜帶DST突變基因的個(gè)體，從而培育抗旱、耐鹽增 強(qiáng)的新品種(系)。該方法通過(guò)常規(guī)的雜交育種方法，不需要轉(zhuǎn)基因，避免轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)，因此具有 優(yōu)勢(shì)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于，它包含具有SEQ ID NO2第42-85位氨基酸序列的多肽、其保守性變異多肽、或其同源多肽。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)錄因子，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQID NO 2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQID NO :2氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形 成的，且具有提高植物感旱感鹽性的由(c)衍生的多肽；或(c)具有Cys-2/His-2型鋅指結(jié)構(gòu)域，且具有提高植物感旱感鹽性的(a)-(b)中所述多 肽的同源多肽。
3.一種多核苷酸，其特征在于，它包含編碼權(quán)利要求1所述多肽的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQID N0:1的核苷酸序列；(b)具有SEQID N O :1中1-435位的核苷酸序列；或(c)與(a)-(b)中任一種核苷酸序列互補(bǔ)的多核苷酸。
5.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體或基因組 中整合有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種順式作用元件，其具有SEQ ID NO :3所述的序列，且能夠與權(quán)利要求1所述的 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。
8.權(quán)利要求1所述的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子或權(quán)利要求3所述的多核苷酸的抑制劑或非保 守性突變序列。
9.一種提高植物抗旱耐鹽性的方法，所述方法包括抑制權(quán)利要求1所述鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄 因子、抑制權(quán)利要求3所述多核苷酸的表達(dá)、或抑制權(quán)利要求7所述順式作用元件與權(quán)利要 求1所述鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。優(yōu)選所述方法包括使用權(quán)利要求8中所述的表達(dá)抑制劑或在植物中產(chǎn)生權(quán)利要求8 中所述的非保守性突變序列，更優(yōu)選使得SEQ ID N0:1的核苷酸序列或SEQ ID NO 2的氨 基酸序列發(fā)生非保守突變、或使用所述核苷酸序列或氨基酸序列的抑制劑，更優(yōu)選使得SEQ ID N0:1的核苷酸序列的第205位堿基A突變?yōu)镚和第484位堿基G突變?yōu)锳或使得SEQ ID NO 2的氨基酸序列的第69位天冬酰胺突變?yōu)樘於匪岷偷?62位的丙氨酸突變?yōu)樘K 氨酸。
10.一種篩選抗旱耐鹽性植株的方法，所述方法包括(i)檢測(cè)候選植株中權(quán)利要求1所述鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的水平、權(quán)利要求3所述多核苷 酸的表達(dá)水平、和/或權(quán)利要求7所述順式作用元件與權(quán)利要求1所述鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子 的結(jié)合水平；(ii)將步驟(i)所檢測(cè)到的候選植株中的水平與對(duì)照植株中相應(yīng)的水平相比，如果候 選植株中的水平較對(duì)照植株有所降低，則表明所述植株是抗旱耐鹽性植株。
11.權(quán)利要求1所述的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子或權(quán)利要求3所述的核苷酸序列的抑制劑或 非保守性突變序列在提高植物抗旱耐鹽性中的用途。在一個(gè)優(yōu)選例中，所述抑制劑是針對(duì)所述轉(zhuǎn)錄因子或核苷酸序列的小分子干擾RNA、抗 體或反義寡核苷酸。
12.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述提高植物抗旱耐鹽性包括(i)將所述抑制劑直接作用于植物；(ii)將所述非保守性突變序列導(dǎo)入植物；或(iii)設(shè)計(jì)針對(duì)所述非保守性突變序列的分子標(biāo)記，并用該分子標(biāo)記對(duì)包含所述非保 守性突變序列的突變體與其它水稻品種的雜交后代進(jìn)行選擇，從而篩選出攜帶所述非保守 性突變序列的個(gè)體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述分子標(biāo)記為序列如SEQ ID N0:10和SEQ IDN0:11所示 的引物對(duì)，和/或序列如SEQ ID N0:12和SEQ ID NO :13所示的引物對(duì)。
13.一種提高植物抗旱耐鹽性的方法，所述方法包括(A)提供權(quán)利要求1所述的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子或權(quán)利要求3所述的核苷酸序列的抑制 劑或非保守性突變序列；(B)對(duì)植物進(jìn)行選自下組的一種或多種處理(i)將所述抑制劑直接作用于植物；(ii)將所述非保守性突變序列導(dǎo)入植物；或(iii)設(shè)計(jì)針對(duì)所述非保守性突變序列的分子標(biāo)記，并用該分子標(biāo)記對(duì)包含所述非保 守性突變序列的突變體與其它水稻品種的雜交后代進(jìn)行選擇，從而篩選出攜帶所述非保守 性突變序列的個(gè)體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述分子標(biāo)記為序列如SEQ ID N0:10和SEQ IDN0:11所示 的引物對(duì)，和/或序列如SEQ ID N0:12和SEQ ID NO :13所示的引物對(duì)。
14.一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，所述方法包括(1)用含有權(quán)利要求1所述的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的非保守性突變序列或權(quán)利要求3所 述的多核苷酸的非保守性突變序列的構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、組織或器官；(2)選擇轉(zhuǎn)入所述非保守性突變序列的植物細(xì)胞、組織或器官；和(3)將步驟(2)中的植物細(xì)胞、組織或器官再生成植株，其中，所得的轉(zhuǎn)基因植物的抗旱耐鹽性較未轉(zhuǎn)化的植物有所增強(qiáng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了水稻鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子新基因及其抗旱耐鹽的應(yīng)用。本發(fā)明具體涉及包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、其保守性變異多肽、或其同源多肽的分離的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子；該轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列及包含該編碼序列的載體或宿主；與該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件；以及所述轉(zhuǎn)錄因子或編碼序列的拮抗劑。本發(fā)明還涉及提高植物抗旱耐鹽性的方法和篩選具有高抗旱耐鹽性植物的方法。本發(fā)明提供了改善和研究植物抗旱耐鹽性的新方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101875689SQ201010161188
公開日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月8日
發(fā)明者施敏, 晁代印, 朱美珍, 林鴻宣, 高繼平, 黃新元 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院