專利名稱：利用fAFLP標(biāo)記技術(shù)分析貝類遺傳多樣性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分析 貝類遺傳多樣性的方法，更具體地說是一種利用fAFLP標(biāo)記 技術(shù)分析貝類遺傳多樣性的方法。
背景技術(shù)：
AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism,擴(kuò)增片段長度多態(tài) 性)技術(shù)是目前使用廣泛且有效的遺傳多樣性檢測(cè)方法，它集RFLPOtestriction Fragment LengthPolymorphism,限制性片段長度多態(tài)性)技術(shù)的穩(wěn)定性和RAPD(Random AmplifiedPolymorphism DNA,隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)技術(shù)的高效性于一身，具有所需DNA量 小、標(biāo)記信息量大、多態(tài)性豐富、靈敏度高、快速高效、所得數(shù)據(jù)可靠等諸多優(yōu)點(diǎn)，且不需預(yù) 先知道研究生物的遺傳背景，不受組織器官種類、發(fā)育階段、生境條件等因素的影響，結(jié)果 遵從孟德爾分離的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于多種生物的遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜 構(gòu)建、目的基因的克隆和定位等多個(gè)遺傳學(xué)研究領(lǐng)域。在貝類研究方面，潘潔等(2002)應(yīng) 用AFLP技術(shù)對(duì)櫛孔扇貝的中國長島群體和韓國東部、韓國西部群體3個(gè)群體進(jìn)行了遺傳多 樣性分析。陳省平等(2005)對(duì)我國4種主要養(yǎng)殖扇貝——椅孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、蝦夷 扇貝、海灣扇貝的群體遺傳多樣性及特異性AFLP標(biāo)記進(jìn)行了研究；萬俊芬等(2004)研究了 鮑養(yǎng)殖群體AFLP標(biāo)記位點(diǎn)及其遺傳結(jié)構(gòu)的影響。另外，潘潔等(2002)對(duì)櫛孔扇貝抗病品 系的AFLP標(biāo)記進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)選育群體的遺傳組成已經(jīng)發(fā)生了一些改變。近年發(fā)展起來的fAFLP (熒光AFLP)技術(shù)是在傳統(tǒng)AFLP技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用熒光 物質(zhì)(FAM、R0X、J0E等)標(biāo)記過的選擇性引物擴(kuò)增，產(chǎn)物在自動(dòng)DNA測(cè)序儀上進(jìn)行檢測(cè)，所 得圖像和數(shù)據(jù)可以自動(dòng)采集，并且由于熒光內(nèi)參的使用使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具準(zhǔn)確性和可比性。 相對(duì)于傳統(tǒng)AFLP技術(shù)來說，fAFLP技術(shù)省去了做膠、銀染的麻煩和不穩(wěn)定。所以，fAFLP技術(shù)不僅秉承了傳統(tǒng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，而且在高效性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性 和可重復(fù)性等方面表現(xiàn)得更加優(yōu)越，將成為分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展的主流和趨勢(shì)。目前在 海洋貝類方面，彭永興等(2008)利用fAFLP技術(shù)對(duì)文蛤(Meretrix meretrix)、青蛤 (Cyclinasinensis)、菲 _ 賓 @ ff (Ruditapes philippinarum)禾口 IjJ 冑 @ (Mercenaria mercenariaM種簾蛤科貝類的群體遺傳多樣性和種間關(guān)系進(jìn)行了研究，該文獻(xiàn)中對(duì)酶切、 預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增方面作了試驗(yàn)，并給我們提供了一組反應(yīng)體系；林志華等(2009)利用 fAFLP標(biāo)記技術(shù)，對(duì)采集于廣西的形態(tài)和殼色變異很大的2個(gè)文蛤群體以及山東文蛤群體 進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系研究，該文獻(xiàn)在酶切、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增方面沒有提供可參考 的反應(yīng)體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀而另外提供一種高效、穩(wěn)定、 準(zhǔn)確的利用fAFLP標(biāo)記技術(shù)分析貝類遺傳多樣性的方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為利用fAFLP標(biāo)記技術(shù)分析貝類遺傳多樣性的方法，依次經(jīng)過貝類DNA提取，限制性內(nèi)切酶消化DNA，對(duì)酶切后的DNA進(jìn)行接頭 連接，PCR預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，產(chǎn)物檢測(cè)及圖像和數(shù)據(jù)的采集和分析，其特征在于所述的 PCR預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增包括如下步驟a、DNA片段的預(yù)擴(kuò)增取5μ L連接完成的DNA樣品，加入50ng/y L的Mse I引 物 1. 5μ L，50ng/y L 的 EcoR I 引物 1. 5 μ L，IOXPCR Buffer 5· O μ L，5U/μ L 的 Taq 酶 0. 2μ L,2. 5mM d NTP 4. O μ L，加水至50 μ L，混勻后，在如下PCR條件擴(kuò)增94°C預(yù)變性 2min，94°C變性30S，56°C退火30S，72°C延伸60S，20個(gè)循環(huán)，引物帶有一個(gè)堿基，為M00+C， 預(yù)擴(kuò)增完成后，在瓊脂糖膠中檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增的效果；預(yù)擴(kuò)±曾弓I 物為EOl :5 ‘ -GACTGCGTACCAATTCA-3 ‘ ；M02 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAAC-3‘；b、AFLP的選擇性擴(kuò)增熒光引物是在EcoR I引物的5'端加了熒光標(biāo)記，用多 對(duì)引物組合對(duì)各個(gè)體進(jìn)行了選擇性擴(kuò)增，取5μ L稀釋的預(yù)擴(kuò)增混合液，加入50ng/y L的 EcoR I 弓I 物 1 μ L，50ng/y L 的 Mse I 引物 lyL，2.5mM dNTP 1. 6 μ L，5U/μ L 的 Taq 酶 0. 2μ L, IOXPCR Buffer 2· O μ L，力口 H2O 至 20 μ L，PCR 擴(kuò)增94°C 預(yù)變性 2min，94°C 變性 30S，65°C退火30S，72°C延伸60S，進(jìn)行12個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0. 7°C，至56°C ； 94°C變性30S，56°C退火30S，72°C延伸60S，進(jìn)行8個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增完成后，取5 μ L在1 %瓊脂 糖膠中檢測(cè)擴(kuò)增效果，擴(kuò)增后的樣品中加入15 μ L變性Buffer，混合，95°C變性5min后，立 刻冷卻到4°C。進(jìn)一步，所述的DNA提取為如下步驟取貝類的肌肉組織或內(nèi)臟團(tuán)，用酚/氯仿法 提取基因組DNA，并用1 %瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度儀檢測(cè)DNA的純度和完整性，調(diào) 整所有樣品DNA的濃度在IOOng/ μ L。進(jìn)一步，所述的限制性內(nèi)切酶消化DNA為如下步驟用EcoR I、Mse I兩種核酸內(nèi) 切酶酶切，每個(gè)DNA樣品酶切的混合液包括DNAlOOng，Mse I 5U, EcoR I 5U，酶切Buffer 8 μ L，加水至50μ L，37°C酶切3 6h，酶切完成后，65°C處理lOmin。進(jìn)一步，所述的接頭和連接處理為如下步驟取酶切完成后的樣品，加入 2 μ mol/L 的 EcoR I 接頭 1. O μ L，20 μ mol/L 的 Mse I 接頭 1· O μ L，IOmM ATP 1· O μ L，IOU/ μ L的T4-DNA連接酶0. 2 μ L，10 X連接Buffer 5. O μ L,加水至50 μ L ； 16°C連接過夜，連 接結(jié)束后，65°C處理lOmin，EcoRI接頭5' -CTCGTAGACTGCGTACC-3 ‘3' -CTGACGCATGGTTAA-5‘，]\^6 1接頭5' -GACGATGAGTCCTGAG-3 ‘3' -TACTCAGGACTCAT-5‘。進(jìn)一步，所述的產(chǎn)物檢測(cè)為如下步驟在自動(dòng)DNA測(cè)序儀上進(jìn)行檢測(cè)選擴(kuò)產(chǎn)物在 ABI公司的3760XL型測(cè)序儀上進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)一步，所述的圖像和數(shù)據(jù)的采集和分析為如下步驟用GeneMarker 1. 6軟件進(jìn) 行分析，將100-500bp間的擴(kuò)增帶譜轉(zhuǎn)換成0、1數(shù)據(jù)矩陣，用PopGene 32軟件計(jì)算各群體 的多態(tài)率、基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)信息指數(shù)以及種群間的相對(duì)遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用fAFLP標(biāo)記技術(shù)結(jié)合自創(chuàng)的反應(yīng)體系， 對(duì)貝類遺傳多樣性分析來說高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確，另外，本方法具有擴(kuò)增位點(diǎn)多，多態(tài)位點(diǎn)比例高，Nei基因多樣性和香農(nóng)信息指數(shù)大的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為引物組合E33M62對(duì)SD種群和GX種群的銀染AFLP擴(kuò)增圖譜。
圖2為引物組合E33M62對(duì)SD種群和GX種群的fAFLP擴(kuò)增圖譜。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。下面結(jié)合文蛤不同地理群體AFLP多樣性檢測(cè)的銀染法和熒光標(biāo)記法具體實(shí)施 例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的優(yōu)越性。(1)高質(zhì)量DNA的提取2006年7月，取文蛤山東種群(簡稱SD)和廣西種群(簡 稱GX)各20個(gè)的閉殼肌，用酚/氯仿法提取基因組DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分 光光度儀檢測(cè)DNA的純度和完整性，調(diào)整所有樣品DNA的濃度在lOOng/μ L。(2)限制性內(nèi)切酶消化DNA 用EcoR I、Mse I兩種核酸內(nèi)切酶酶切。每個(gè)DNA樣 品酶切的混合液包括DNA100ng，Mse I 5U, EcoR I 5U，酶切Buffer 8 μ L，加水至50 μ L。 37°C酶切3 6h，酶切完成后，65°C處理lOmin。(3)接頭連接
權(quán)利要求
1.一種利用fAFLP標(biāo)記技術(shù)分析貝類遺傳多樣性的方法，依次經(jīng)過貝類DNA提取，限制 性內(nèi)切酶消化DNA，對(duì)酶切后的DNA進(jìn)行接頭連接，PCR預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，產(chǎn)物檢測(cè)及圖 像和數(shù)據(jù)的采集和分析，其特征在于所述的PCR預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增包括如下步驟a、DNA片段的預(yù)擴(kuò)增取5yL連接完成的DNA樣品，加入^Ong/yL的MseI弓丨 物 1. 5μ L，50ng/y L 的 EcoR I 引物 1. 5 μ L，IOXPCR Buffer 5· O μ L，5U/μ L 的 Taq 酶 0. 2μ L,2. 5mM d NTP 4. O μ L，加水至50 μ L，混勻后，在如下PCR條件擴(kuò)增94°C預(yù)變性 2min，94°C變性30S，56°C退火30S，72°C延伸60S，20個(gè)循環(huán)，引物帶有一個(gè)堿基，為M00+C， 預(yù)擴(kuò)增完成后，在瓊脂糖膠中檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增的效果；預(yù)擴(kuò)增 引 物為:E01 5 ‘ -GACTGCGTACCAATTCA-3 ‘ ；M02 5 ‘ -GATGAGTCCTGAGTAAC-3‘；b、AFLP的選擇性擴(kuò)增熒光引物是在EcoRI引物的5'端加了熒光標(biāo)記，用多對(duì)引物 組合對(duì)各個(gè)體進(jìn)行了選擇性擴(kuò)增，取5 μ L稀釋的預(yù)擴(kuò)增混合液，加入50ng/ μ L的EcoR I 弓 I 物 1 μ L，50ng/ μ L 的 Mse I 引物 1 μ L，2. 5mM dNTP 1· 6 μ L，5U/ μ L 的 Taq 酶 0. 2 μ L, IOXPCR Buffer 2. O μ L，加 H2O 至 20 μ L，PCR 擴(kuò)增94°C預(yù)變性 2min，94°C變性 30S，65°C 退火30S，72°C延伸60S，進(jìn)行12個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0. 7°C，至56°C ；94°C變性 30S，56°C退火30S，72°C延伸60S，進(jìn)行8個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增完成后，取5 μ L在1 %瓊脂糖膠中檢 測(cè)擴(kuò)增效果，擴(kuò)增后的樣品中加入15 μ L變性Buffer，混合，95°C變性5min后，立刻冷卻到 4°C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的DNA提取為如下步驟取貝類的肌 肉組織或內(nèi)臟團(tuán)，用酚/氯仿法提取基因組DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度 儀檢測(cè)DNA的純度和完整性，調(diào)整所有樣品DNA的濃度在lOOng/μ L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的限制性內(nèi)切酶消化DNA為如下步驟 用EcoR I、Mse I兩種核酸內(nèi)切酶酶切，每個(gè)DNA樣品酶切的混合液包括DNAlOOng，Mse I 5U, EcoR I 5U，酶切Buffer 8 μ L，加水至50 μ L，37°C酶切3 6h，酶切完成后，65°C處理 IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的接頭和連接處理為如下步驟取酶 切完成后的樣品，加入2ymol/L的EcoR I接頭1. O μ L，20 μ mol/L的Mse I接頭1.0 μ L， IOmM ATP 1. Ομ L，lOU/μ L 的 T4-DNA 連接酶 0. 2μ L，IOX 連接 Buffer 5. O μ L，加水至 501^;161連接過夜，連接結(jié)束后，651處理lOmin，已(；01 1接頭5' -CTCGTAGACTGCGTACC-3 ‘3 ‘ -CTGACGCATGGTTAA-5‘，皿86 1接頭5' -GACGATGAGTCCTGAG-3 ‘3 ‘ -TACTCAGGACTCAT-5‘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的產(chǎn)物檢測(cè)為如下步驟在自動(dòng)DNA 測(cè)序儀上進(jìn)行檢測(cè)選擴(kuò)產(chǎn)物在ABI公司的3760 XL型測(cè)序儀上進(jìn)行檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的圖像和數(shù)據(jù)的采集和分析為如下步 驟用GeneMarker 1. 6軟件進(jìn)行分析，將100_500bp間的擴(kuò)增帶譜轉(zhuǎn)換成O、1數(shù)據(jù)矩陣，用 PopGene 32軟件計(jì)算各群體的多態(tài)率、基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)信息指數(shù)以及種群間的相對(duì) 遺傳距離和遺傳相似性系數(shù)。
全文摘要
一種利用fAFLP標(biāo)記技術(shù)分析貝類遺傳多樣性的方法，依次經(jīng)過貝類DNA提取，限制性內(nèi)切酶消化DNA，對(duì)酶切后的DNA進(jìn)行接頭連接，PCR預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，產(chǎn)物檢測(cè)及圖像和數(shù)據(jù)的采集和分析。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用fAFLP標(biāo)記技術(shù)結(jié)合自創(chuàng)的反應(yīng)體系，可對(duì)貝類遺傳多樣性進(jìn)行高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地分析，另外，本方法具有擴(kuò)增位點(diǎn)多，多態(tài)位點(diǎn)比例高，Nei基因多樣性大的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102041303SQ20101016128
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月10日
發(fā)明者林志華, 董迎輝 申請(qǐng)人:浙江萬里學(xué)院