一種用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記及其鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記及其鑒定方法，所述分子標(biāo)記包括32對SSR標(biāo)記，覆蓋了水稻12條染色體，其中第4、6和9號染色體上有1個標(biāo)記，第5、7、8和10號染色體上各有2個標(biāo)記，第2、3和12染色體上各有3個標(biāo)記，第1和11染色體上各有6個標(biāo)記；該鑒定過程為步驟a，DNA提?。徊襟Eb，PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系為15μL，含50mM?KCl，10mM?Tris-HCl(pH8.8)，0.1％Triton-X，1.5mM?MgCl2，200μM?each?of?dNTPs，0.2μM?of?each?primer，5％(v／v)dimethyl?sulfoxide?and?0.5U?Taq?DNA聚合酶；步驟c，PCR產(chǎn)物檢測;步驟d，統(tǒng)計分析。本發(fā)明的用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記及其鑒定方法，能夠檢測待測粳稻材料的遺傳多樣性及彼此間的遺傳差異，對粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記進(jìn)行篩選。
【專利說明】一種用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記及其鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水稻育種中的檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及適用于粳稻品種資源多樣性評價及粳稻分子輔助育種中檢測親本遺傳差異。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻的遺傳改良和突破性品種的選育均主要依賴于種質(zhì)資源的掌握和利用。只有了解育種材料的遺傳變異信息，才能有針對性地選擇親本，在后代中獲得較大的雜種優(yōu)勢，從而培育出優(yōu)良品種。因此，親本遺傳多樣性的分析對于水稻新品種的選育具有重要意義。
[0003]近些年，由于水稻全基因組測序工作已經(jīng)完成，在此基礎(chǔ)上，對有利基因進(jìn)行剪切、聚合和改良，進(jìn)行設(shè)計育種以培育在產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等多方面都具有強(qiáng)優(yōu)勢的水稻新品種已成為未來水稻育種必然趨勢。其核心技術(shù)之一便是標(biāo)記輔助選擇和全基因組設(shè)計，而二者的重要基礎(chǔ)就是育種親本材料遺傳差異的確定。此外，粳稻以其優(yōu)于秈稻的優(yōu)良食味獲得了越來越多人的喜愛，但粳稻品種存在的遺傳差異較小問題，使得選擇差異較大粳稻作為親本進(jìn)而獲得較大雜種優(yōu)質(zhì)變得越發(fā)困難。
[0004]鑒于上述缺陷，本發(fā)明創(chuàng)作者經(jīng)過長時間的研究和實踐終于獲得了本創(chuàng)作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記及其鑒定方法，用以克服上述技術(shù)缺陷。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記包括32對SSR標(biāo)記,覆蓋了水稻12條染色體，其中第4、6和9號染色體上有I個標(biāo)記，第5、7、8和10號染色體上各有2
[0007]個標(biāo)記，第2、3和12染色體上各有3個標(biāo)記，第I和11染色體上各有6個標(biāo)記。
[0008]進(jìn)一步，上述分析標(biāo)記獲取時，采用親緣關(guān)系較近的日本粳稻品種一目惚、豐錦、笸錦、日本晴、秋田小町；東北稻區(qū)導(dǎo)入少量秈稻血緣的沈農(nóng)265、遼粳263、遼粳294 ;以及廣親和粳稻02428為材料。
[0009]進(jìn)一步，所述分子標(biāo)記以PIC值>0.50作為參考指標(biāo)。
[0010]本發(fā)明還提供一種用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于，該具體過程為:
[0011]步驟a，DNA提??；
[0012]步驟al,取長至IOcm左右黃化苗4_5株剪碎,放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量離心管(EP)中；
[0013]步驟a2，加入預(yù)熱至65°C的CTAB抽提液；
[0014]步驟a3，輕輕混勻，使粉末充分散開，呈懸浮狀態(tài)，放于60°C的水浴30_60min，期間每5min輕輕倒轉(zhuǎn)離心管使之分散均勻；
[0015]步驟a4，取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿:異戊醇(24: 1)，室溫振蕩，充分混勻，然后于臺式冷凍離心機(jī)上1000Orpm離心IOmin,取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；
[0016]步驟a5，重復(fù)3-4次，直至中間沒有蛋白層為止；
[0017]步驟a6，將上清液逐滴加入2倍體積的-20°C預(yù)冷的無水乙醇中，-20°C放置30min以上；
[0018]步驟a7，此時可見DNA成棉絮狀小團(tuán)漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去殘液，在超凈工作臺上吹干；
[0019]步驟a8，用100 μ L的TE緩沖液回溶待用；
[0020]步驟a9，取1.5μ L用于PCR擴(kuò)增。
[0021]步驟b，PCR 擴(kuò)增；PCR 反應(yīng)體系為 15 μ L，含 50mM KCl, IOmM Tris-HCl (ρΗ8.8)，0.1% Triton-X, 1.5mM MgCl2, 200 μ M each of dNTPs, 0.2 μ M of each primer, 5% (v /v) dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA 聚合酶；
[0022]步驟c，PCR產(chǎn)物檢測；
[0023]在上述步驟b中的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，取5 μ L上樣于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，接通電極，在80W的恒定功率下電泳2-3小時，關(guān)閉電源；取下凝膠，銀染顯色，照相統(tǒng)計。
[0024]步驟d,統(tǒng)計分析；具 體為:
[0025]步驟dl，對標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性信息量(PIC值)進(jìn)行計算；
[0026]步驟d2，遺傳多樣性分析，計算各材料間的遺傳距離⑶。
[0027]進(jìn)一步，上述步驟a2中，所述CTAB抽提液包括2 % (w / v)CTAB ;IOOmmol /LTris-Hcl, pH8.0 ；20mmol / LEDTA, pH8.0 ；1.4mol / LNaCl]600 μ L0
[0028]進(jìn)一步,上述步驟d2中，PIC值依據(jù)下述公式計算，
[0029]PIC=1- Σ fi2
[0030]式中，fi表示i位點(diǎn)的基因頻率。
[0031]進(jìn)一步，在上述步驟d2中，對遺傳多樣性分析時，將擴(kuò)增產(chǎn)物的每一條帶視為一個位點(diǎn)，具有多態(tài)性的條帶賦值為"1"，無此帶時賦值為"O"。
[0032]進(jìn)一步，在上述步驟d2中，
[0033]各材料間的遺傳距離⑶按下式計算:
[0034]GD=-ln2Nxy / (Nx+Ny),
[0035]式中Nxy為材料x、y的公共條帶數(shù)，Nx為材料x的條帶數(shù)，Ny為材料y的條帶數(shù)。
[0036]進(jìn)一步，在上述步驟b中，采用AB1-9700進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ；每個循環(huán)94°C預(yù)變性lmin，550°C退火lmin，72°C延伸2min，30個循環(huán)；最后72°C延伸8min。
[0037]進(jìn)一步，在上述步驟a8中，所述TE緩沖液包括IOmmol / LTris-Hcl; Immol /LEDTA,pH8.0。
[0038]與現(xiàn)有技術(shù)相比較本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明的用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記及其鑒定方法，能夠檢測待測粳稻材料的遺傳多樣性及彼此間的遺傳差異，對粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記進(jìn)行篩選。
【專利附圖】

【附圖說明】[0039]圖1A為本發(fā)明所用材料的489個標(biāo)記的聚類比較圖；
[0040]圖1B為本發(fā)明所用材料的32個標(biāo)記的聚類比較圖。
【具體實施方式】
[0041]以下結(jié)合附圖，對本發(fā)明上述的和另外的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)作更詳細(xì)的說明。
[0042]本發(fā)明采用親緣關(guān)系較近的日本粳稻品種一目惚、豐錦、笸錦、日本晴、秋田小町；東北稻區(qū)導(dǎo)入少量秈稻血緣的沈農(nóng)265、遼粳263、遼粳294 ；以及廣親和粳稻02428為材料，通過篩選均勻分布于水稻12條染色體上的489對分子標(biāo)記，以PIC值>0.50作為主要參考指標(biāo)確定了適于粳稻遺傳多樣性分析的32對SSR引物。
[0043]這些引物可以很好的反應(yīng)這些粳稻材料的遺傳多樣性及彼此間的遺傳差異，可以用于粳稻品種資源的大規(guī)模評價及育種親本篩選。
[0044]本發(fā)明分子標(biāo)記包括32對SSR標(biāo)記,覆蓋了水稻12條染色體，其中第4、6和9號染色體上有I個標(biāo)記，第5、7、8和10號染色體上各有2個標(biāo)記，第2、3和12染色體上各有3個標(biāo)記，第I和11染色體上各有6個標(biāo)記。
[0045]該分子標(biāo)記的鑒定過程為:
[0046]步驟a，DNA提?。?br> [0047]步驟al,取長至IOcm左右黃化苗4_5株剪碎,放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量離心管(EP)中；
[0048]步驟a2，加入預(yù)熱至65c的CTAB抽提液[2 % (w / v) CTAB;
[0049]IOOmmol / LTris-Hcl, ρΗ8.0 ；20mmol / LEDTA,ρΗ8.0 ；
[0050]1.4mol / LNaCl] 600 μ L ；
[0051]步驟a3，輕輕混勻，使粉末充分散開，呈懸浮狀態(tài)，放于60°C的水浴30_60min，期間每5min輕輕倒轉(zhuǎn)離心管使之分散均勻；
[0052]步驟a4，取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿:異戊醇(24: I)，室溫振蕩，充分混勻，然后于臺式冷凍離心機(jī)上1000Orpm離心IOmin,取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中；
[0053]步驟a5，重復(fù)3-4次，直至中間沒有蛋白層為止；
[0054]步驟a6，將上清液逐滴加入2倍體積的_20°C預(yù)冷的無水乙醇中，-20°C放置30min以上；
[0055]步驟a7，此時可見DNA成棉絮狀小團(tuán)漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去殘液，在超凈工作臺上吹干；
[0056]步驟a8,用 100 μ L 的 TE 緩沖液(IOmmol / LTris-Hcl ；lmmol / LEDTA, ρΗ8.0)回溶待用；
[0057]步驟a9，取L 5μ L用于PCR擴(kuò)增。
[0058]步驟b, PCR 擴(kuò)增；PCR 反應(yīng)體系為 15 μ L，含 50mM KCl, IOmM Tris-HCl (ρΗ8.8)，0.1% Triton-X, 1.5mM MgCl2, 200 μ M each of dNTPs, 0.2 μ M of each primet, 5% (v /v) dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA 聚合酶；
[0059]本實施例采 用AB1-9700進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ;每個循環(huán)94°C預(yù)變性lmin, 550c退火lmin, 72°C延伸2min, 30個循環(huán)；最后72°C延伸8min。
[0060]步驟c，PCR產(chǎn)物檢測；[0061]在上述步驟b中的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，取5 μ L上樣于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，接通電極，在80W的恒定功率下電泳2-3小時，關(guān)閉電源；取下凝膠，銀染顯色，照相統(tǒng)計。
[0062]步驟d，統(tǒng)計分析；
[0063]步驟dl, PIC值計算:標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性信息量(Polymorphism informationcontent, PIC)依據(jù)下述公式計算，
[0064]PIC=1- Σ fi2
[0065]式中，fi表示i位點(diǎn)的基因頻率。
[0066]PIC值的大小不僅與檢測位點(diǎn)的等位片段數(shù)有關(guān)，而且與這些等位片段在試驗材料中的分布頻率有關(guān)。不同位點(diǎn)檢測到相同的等位片段數(shù)時，各等位片段分布頻率均勻的位點(diǎn)具有較高的Pic值。
[0067]步驟d2，遺傳多樣性分析:將擴(kuò)增產(chǎn)物的每一條帶視為一個位點(diǎn)，具有多態(tài)性的條帶賦值為"1〃，無此帶時賦值為"O"。
[0068]將數(shù)據(jù)輸入NTSYSpc2.1軟件中，各材料間的遺傳距離⑶按下式計算:
[0069]GD=-ln2Nxy / (Nx+Ny),
[0070]式中Nxy為材料x、y的公共條帶數(shù)，Nx為材料x的條帶數(shù)，Ny為材料y的條帶數(shù)。
[0071]根據(jù)所得的遺傳距離，采用算術(shù)平均非加權(quán)聚類法(unweighted pair groupmethod with arithmetic averages UPGMA)進(jìn)行聚類分析，并通過NTSYSpc2.1 軟件繪制樹狀圖。
[0072]請參閱表1 所示，其為本發(fā)明32個用于粳稻遺傳多樣性分析的引物的基本信息表。
[0073]表1
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記，.其特征在于，所述分子標(biāo)記包括32對SSR標(biāo)記，覆蓋了水稻12條染色體，其中第4、6和9號染色體上有I個標(biāo)記，第5、7、8和10號染色體上各有2個標(biāo)記，第2、3和12染色體上各有3個標(biāo)記，第I和11染色體上各有6個標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記，其特征在于，上述分析標(biāo)記獲取時，采用親緣關(guān)系較近的日本粳稻品種一目惚、豐錦、笸錦、日本晴、秋田小町；東北稻區(qū)導(dǎo)入少量秈稻血緣的沈農(nóng)265、遼粳263、遼粳294 ;以及廣親和粳稻02428為材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記以PIC值>0.50作為參考指標(biāo)。
4.一種用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于，該具體過程為: 步驟a，DNA提??； 步驟al，取長至10cm左右黃化苗4-5株剪碎，放于研缽中并立即加入液氮研磨成粉末，置于1.5ml的微量離心管(EP)中； 步驟a2，加入預(yù)熱至65°C的CTAB抽提液； 步驟a3，輕輕混勻，使粉末充分散開，呈懸浮狀態(tài)，放于60°C的水浴30-60min，期間每5min輕輕倒轉(zhuǎn)離心管使之分散均勻； 步驟a4，取出后，待冷至室溫后加入等體積的氯仿:異戊醇(24: I)，室溫振蕩，充分混勻，然后于臺式冷凍離心機(jī)上1000Orpm離心lOmin，取上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中； 步驟a5，重復(fù)3-4次，直至中間沒有蛋白層為止； 步驟a6，將上清液逐滴加入2倍體積的_20°C預(yù)冷的無水乙醇中，-20°C放置30min以上； 步驟a7，此時可見DNA成棉絮狀小團(tuán)漂于液面，用玻璃鉤勾出，以滅菌的濾紙條吸去殘液，在超凈工作臺上吹干； 步驟a8，用100 μ L的TE緩沖液回溶待用； 步驟a9，取1.5μ L用于PCR擴(kuò)增; 步驟 b，PCR 擴(kuò)增；PCR 反應(yīng)體系為 15yL，#50mM KCl，IOmM Tris-HCl (pH8.8),0.1 %Triton-X, 1.5mM MgCl2, 200 μ M each of dNTPs, 0.2 μ M of each primer, 5 % (v / v)dimethyl sulfoxide and0.5U Taq DNA 聚合酶； 步驟c，PCR產(chǎn)物檢測； 在上述步驟b中的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液，取5 μ L上樣于6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，接通電極，在80W的恒定功率下電泳2-3小時，關(guān)閉電源；取下凝膠，銀染顯色，照相統(tǒng)計； 步驟d，統(tǒng)計分析；具體為: 步驟dl，對標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性信息量(PIC值)進(jìn)行計算； 步驟d2，遺傳多樣性分析，計算各材料間的遺傳距離GD。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于，上述步驟a2中，所述CTAB抽提液包括2% (w / v)CTAB; IOOmmol / LTris-Hcl,pH8.0;20mmol / LEDTA,ρΗ8.0;1.4mol / LNaCl]600L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于，上述步驟d2中，PIC值依據(jù)下述公式計算，
PIC=1- Σ fi2 式中，fi表示i位點(diǎn)的基因頻率。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于，在上述步驟d2中，對遺傳多樣性分析時，將擴(kuò)增產(chǎn)物的每一條帶視為一個位點(diǎn)，具有多態(tài)性的條帶賦值為"1〃，無此帶時賦值為"O"。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于，在上述步驟d2中， 各材料間的遺傳距離GD按下式計算:
GD = -ln2Nxy / (Nx+Ny), 式中Nxy為材料X、y的公共條帶數(shù)，Nx為材料x的條帶數(shù)，Ny為材料y的條帶數(shù)。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于，在上述步驟b中，采用AB1-9700進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min;每個循環(huán)94°C預(yù)變性lmin，550°C退火lmin，72°C延伸2min，30個循環(huán);最后72°C延伸8min。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用于粳稻遺傳多樣性分析的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于，在上述步驟a8中，所述TE緩沖液包括IOmmol / LTris-Hcl ；lmmol / LEDTA，pH8.0。
【文檔編號】C12Q1/68GK103789308SQ201410038681
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】姜樹坤, 徐正進(jìn), 張鳳鳴, 王嘉宇, 白良明, 孫世臣, 丁國華, 王彤彤, 張喜娟, 姜輝 申請人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所