紅錐ssr5標(biāo)記、引物對(duì)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紅錐SSR5標(biāo)記、引物對(duì)及其制備方法和應(yīng)用，發(fā)明人利用特定引物對(duì)HZ5對(duì)紅錐總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到簡單重復(fù)序列SSR5標(biāo)記。該法簡單易行、操作簡便，得到的簡單重復(fù)序列在兩個(gè)紅錐天然群體的居群內(nèi)和居群間檢測表明具有較高的多態(tài)性。紅錐SSR5標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，較之其它分子標(biāo)記，SSR標(biāo)記重復(fù)性好、可靠性高，可應(yīng)用于紅錐的遺傳多樣性評(píng)價(jià)、紅錐遺傳圖譜構(gòu)建、紅錐種群遺傳變異空間分布格局和紅錐起源進(jìn)化的研究，以及目標(biāo)基因的標(biāo)定，還可應(yīng)用于紅錐的分子標(biāo)記輔助育種和QTL研究。
【專利說明】紅錐SSR5標(biāo)記、引物對(duì)及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物科學(xué)中的分子標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種紅錐SSR5標(biāo)記、引物對(duì)及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]紅維(Castanopsishystrix)為殼斗科(Fagaceae)栲屬(Castanopsis)常綠喬木，是華南地區(qū)重要的鄉(xiāng)土闊葉、優(yōu)質(zhì)珍貴用材樹種。它生長快、適應(yīng)廣、效益高，可用做建筑、造船、高檔家具等；萌芽力強(qiáng)，枝葉濃密，較耐蔭蔽，混生性能好，可純林種植，亦可混交造林，是針葉樹種混交造林的最理想的伴生樹種之一；紅錐對(duì)生境適應(yīng)能力強(qiáng)，在群落中位于喬木層，為優(yōu)勢種，對(duì)于維持群落穩(wěn)定具有重要作用，特別適宜人工營造用材林和水源涵養(yǎng)林。由于紅錐木材非常珍貴，近些年遭到了大量采伐，其天然林遭受了嚴(yán)重破壞。
[0003]SSR標(biāo)記(Simple sequence repeat),也叫微衛(wèi)星序列重復(fù),是由一類由幾個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十乃至數(shù)百個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，長度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復(fù)單位的次數(shù)的不同或重復(fù)程度的不完全相同，造成了 SSR長度的高度變異性，由此產(chǎn)生SSR標(biāo)記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用微衛(wèi)星區(qū)域特定順序設(shè)計(jì)成對(duì)引物，通過PCR技術(shù)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點(diǎn)在不同個(gè)體間的多態(tài)性。SSR標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn):(I)標(biāo)記數(shù)量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條染色體上；(2)是共顯性標(biāo)記，呈孟德爾遺傳；(3)技術(shù)重復(fù)性好，易于操作，結(jié)果可靠。
[0004]盡管國內(nèi)外的學(xué)者已經(jīng)使用ISSR、RAPD等多種標(biāo)記研究了紅錐群體的遺傳多樣性，紅錐群體的遺傳結(jié)構(gòu)和不同種源紅錐間的遺傳關(guān)系和距離，但是ISSR和RAro兩種標(biāo)記均為顯性標(biāo)記，穩(wěn)定性差，且不能直接應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種和QTL定位。因此，研究紅錐SSR標(biāo)記、開發(fā)紅錐的SSR引物很有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種紅錐SSR5標(biāo)記、引物對(duì)及其制備方法和應(yīng)用。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:紅錐SSR標(biāo)記，具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列，微衛(wèi)星標(biāo)記編號(hào)為SSR5。
[0007]擴(kuò)增上述紅錐SSR標(biāo)記的引物對(duì)HZ5，包括具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的喊基序列。
[0008]上述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，利用特定引物對(duì)HZ5對(duì)紅錐總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到簡單重復(fù)序列；引物對(duì)HZ5包括具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的堿基序列。
[0009]上述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，包括以下步驟:
[0010]<1>紅錐總DNA提取與酶切
[0011]選取紅錐幼嫩的葉片，用CTAB法提取核基因組；用EcoRV在37°C下酶切一晚，65°C下IOmin滅活內(nèi)切酶；反應(yīng)體系20 μ L，包括2.0 μ L的10 XBuffer，1.0 μ L的EcoRV內(nèi)切酶,2 μ L的DNA，15.Ομ L的滅菌雙蒸水；
[0012]〈2>接頭的連接
[0013]將步驟〈DEcoRV酶切的紅錐基因組DNA連接上下接頭；20 μ L連接體系中含有酶切的紅錐基因組DNA4y L，上下接頭各IOOpmol ;連接反應(yīng)T4連接酶緩沖條件下進(jìn)行，T4連接酶1.0 μ L，連接酶buffer2.0 μ L ;于16°C連接過夜；連接后的混合物在65°C反應(yīng)lOmin，滅活連接酶；
[0014]〈3>連接產(chǎn)物的擴(kuò)增
[0015]過夜步驟〈2>連接后的混合物以AP2和復(fù)合SSR引物為上下引物對(duì)連接后的混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2.0%的瓊脂膠電泳，切膠回收500-1000bp的片段，試劑盒純化；[0016]<4>克隆并篩選富集的微衛(wèi)星DNA片段
[0017]將步驟<3>PCR產(chǎn)物連接到載體pMD18-T Vectors上，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜；用M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，選取400-1000bp左右的片段；
[0018]〈5>測序、引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增分析
[0019]將步驟<4>PCR產(chǎn)物送測序；利用Primer5.0軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)并送合成，得引物對(duì)HZ5 ;利用引物對(duì)HZ5在紅錐基因組中擴(kuò)增出片段SSR5標(biāo)記。
[0020]步驟〈2>中上下接頭分別具有序列表SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5的堿基序列；步驟〈3>中AP2和復(fù)合SSR引物分別具有序列表SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7的堿基序列；步驟<4>中M13引物對(duì)具有序列表SEQ.1D.N0.8和SEQ.1D.N0.9的堿基序列；步驟<5>中引物對(duì)HZ5分別具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的堿基序列。
[0021]上述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，步驟〈5>中擴(kuò)增按以下操作進(jìn)行:
[0022]擴(kuò)增體系:反應(yīng)體系1(^1^，包括30-50叩的模板0嫩，0.25個(gè)單位的0嫩聚合酶(TaKaRa)，1.Ομ L 的 10 X Buffer，2.5mM MgCl2I μ I, 2.5mM dNTPsl μ 1，0.1 μ I bovineserum albumin (BSA)；
[0023]擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性 5min;95°C變性 30s，52°C 復(fù)性 45s，72°C 延伸 lmin30s，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin。
[0024]上述紅錐SSR5標(biāo)記在紅錐的分子標(biāo)記輔助育種方面的應(yīng)用。
[0025]上述紅錐SSR5標(biāo)記在紅錐的QTL (數(shù)量性狀基因座)研究方面的應(yīng)用。
[0026]經(jīng)過對(duì)紅錐的深入研究，發(fā)明人利用特定引物對(duì)HZ5對(duì)紅錐總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到簡單重復(fù)序列SSR5標(biāo)記。具體制備方法包括以下步驟:〈1>紅錐總DNA提取與酶切；<2>接頭的連接；〈3>連接產(chǎn)物的擴(kuò)增；〈4>克隆并篩選富集的微衛(wèi)星DNA片段；〈5>測序、引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增分析。該法簡單易行、操作簡便，得到的簡單重復(fù)序列在兩個(gè)紅錐天然群體的居群內(nèi)和居群間檢測表明具有較高的多態(tài)性。紅錐SSR5標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，較之其它分子標(biāo)記，SSR標(biāo)記重復(fù)性好、可靠性高，可應(yīng)用于紅錐的遺傳多樣性評(píng)價(jià)、紅錐遺傳圖譜構(gòu)建、紅錐種群遺傳變異空間分布格局和紅錐起源進(jìn)化的研究，以及目標(biāo)基因的標(biāo)定，還可應(yīng)用于紅錐的分子標(biāo)記輔助育種和QTL研究。
【具體實(shí)施方式】[0027]實(shí)施例
[0028]<1>紅錐總DNA提取與酶切
[0029]選取紅錐幼嫩的葉片，用CTAB法提取核基因組；用EcoRV在37°C下酶切一晚，65°C下IOmin滅活內(nèi)切酶；反應(yīng)體系20 μ L，包括2.0 μ L的lOXBuffer，1.Ομ L的EcoRV內(nèi)切酶,2 μ L的DNA，15.Ομ L的滅菌雙蒸水；
[0030]〈2>接頭的連接
[0031 ] 將步驟〈DEcoRV酶切的紅錐基因組DNA連接上下接頭(上接頭序列GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT,序列表 SEQ.1D.N0.4 ;下接頭序列accagccc-nh2,序列表seq.1d.N0.5) ;20 μ l連接體系中含有酶切的紅錐基因組DNA4 μ l，上下接頭各IOOpmol ;連接反應(yīng)在T4連接酶緩沖條件下(T4連接酶l.0yL，連接酶buffer2.0yL)進(jìn)行，于16°C連接過夜；連接后的混合物在65°C反應(yīng)lOmin，滅活連接酶；
[0032]〈3>連接產(chǎn)物的擴(kuò)增
[0033]過夜步驟〈2>連接后的混合物以AP2 (序列表SEQ.1D.N0.6)和復(fù)合SSR引物(序列表SEQ.1D.N0.7)為上下引物對(duì)連接后的混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2.0%的瓊脂膠電泳，切膠回收500-1000bp的片段，試劑盒純化；
[0034]<4>克隆并篩選富集的微衛(wèi)星DNA片段
[0035]將步驟<3>PCR產(chǎn)物連接到載體pMD18-T Vectors (Takara)上，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜；用M13引物對(duì)(M13F和M13R，序列表SEQ.1D.N0.8和SEQ.1D.N0.9)進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，選取400_1000bp左右的片段；
[0036]〈5>測序、引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增分析
[0037]將步驟<4>PCR產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序；利用Primer5.0軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)并送上海英駿生物公司合成，得引物對(duì)HZ5 (序列表SEQ.1D.N0.2和序列表SEQ.1D.N0.3);利用引物對(duì)HZ5在紅錐基因組中擴(kuò)增出片段SSR5標(biāo)記(序列表 SEQ.1D.N0.l)o
[0038]擴(kuò)增按以下操作進(jìn)行:
[0039]擴(kuò)增體系:反應(yīng)體系1(^1^，包括30-50叩的模板0嫩，0.25個(gè)單位的0嫩聚合酶(TaKaRa)，1.Ομ L 的 lOXBuffer，2.5mM MgCl2I μ I, 2.5mM dNTPsl μ I, 0.1 μ I bovineserum albumin (BSA)；
[0040]擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性 5min;95°C變性 30s，52°C 復(fù)性 45s，72°C 延伸 lmin30s，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin。
[0041]〈6>多態(tài)性分析
[0042]以30個(gè)來自2個(gè)不同種源的紅錐基因組DNA為材料檢測引物多態(tài)性；在30個(gè)紅錐個(gè)體中擴(kuò)增出11條譜帶，說明HZ5為高多態(tài)性引物。
【權(quán)利要求】
1.一種紅錐SSR標(biāo)記，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.1的堿基序列，微衛(wèi)星標(biāo)記編號(hào)為SSR5。
2.擴(kuò)增權(quán)利要求1所述紅錐SSR標(biāo)記的引物對(duì)HZ5，其特征在于包括具有序列表SEQ.1D.N0.2 和 SEQ.1D.N0.3 的堿基序列。
3.權(quán)利要求1所述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，其特征在于利用特定引物對(duì)HZ5對(duì)紅錐總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到簡單重復(fù)序列；所述引物對(duì)HZ5包括具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的喊基序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，其特征在于包括以下步驟: <1>紅錐總DNA提取與酶切 選取紅錐幼嫩的葉片，用CTAB法提取核基因組；用EcoRV在37°C下酶切一晚，65°C下IOmin滅活內(nèi)切酶；反應(yīng)體系20 μ L，包括2.0 μ L的10 X Buffer，1.0 μ L的EcoRV內(nèi)切酶，2 μ L的DNA，15.0 μ L的滅菌雙蒸水； 〈2>接頭的連接 將步驟<1>EcoRV酶切的紅錐基因組DNA連接上下接頭；20 μ L連接體系中含有酶切的紅錐基因組DNA4 μ L，上下接頭各IOOpmol ;連接反應(yīng)在Τ4連接酶緩沖條件下進(jìn)行，Τ4連接酶1.0 μ L，連接酶buffer2.0 μ L ;于16°C連接過夜；連接后的混合物在65°C反應(yīng)lOmin，滅活連接酶； <3>連接產(chǎn)物的擴(kuò)增 過夜步驟〈2>連接后的混合物以AP2和復(fù)合SSR引物為上下引物對(duì)連接后的混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2.0%的瓊脂膠電泳，切膠回收500-1000bp的片段，試劑盒純化； <4>克隆并篩選富集的微衛(wèi)星DNA片段 將步驟<3>PCR產(chǎn)物連接到載體pMD18-T Vectors上，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜；用M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，選取400-1000bp左右的片段； <5>測序、引物設(shè)計(jì)與擴(kuò)增分析 將步驟<4>PCR產(chǎn)物送測序；利用Primerf.0軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行SSR引物設(shè)計(jì)并送合成，得引物對(duì)HZ5 ;利用引物對(duì)HZ5在紅錐基因組中擴(kuò)增出片段SSR5標(biāo)記。
5.權(quán)利要求4所述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，其特征在于: 步驟〈2>中上下接頭分別具有序列表SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5的堿基序列； 步驟<3>中AP2和復(fù)合SSR引物分別具有序列表SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7的堿基序列； 步驟<4>中M13引物對(duì)具有序列表SEQ.1D.N0.8和SEQ.1D.N0.9的堿基序列； 步驟<5>中引物對(duì)HZ5分別具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的堿基序列。
6.權(quán)利要求5所述紅錐SSR標(biāo)記的制備方法，其特征在于步驟〈5>中擴(kuò)增按以下操作進(jìn)行:擴(kuò)增體系:反應(yīng)體系10 μ L，包括30-50ng的模板DNA，0.25個(gè)單位的DNA聚合酶(TaKaRa)，1.Ομ L 的 10 X Buffer，2.5mM MgCl2I μ I, 2.5mM dNTPsl μ I, 0.1 μ I bovineserum albumin (BSA)； 擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性5min;95°C變性30s, 52°C復(fù)性45s, 72°C延伸lmin30s, 30個(gè)循環(huán);最后72°C延伸IOrnin0
7.權(quán)利要求1所述紅錐SSR5標(biāo)記在紅錐的分子標(biāo)記輔助育種方面的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述紅錐SSR5標(biāo)記在紅錐的QTL研究方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103740703SQ201410029387
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月22日
【發(fā)明者】蔣燚, 劉海龍, 朱積余, 黃榮林, 姜英, 何應(yīng)會(huì) 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院