一種評(píng)估鯉魚種群遺傳多樣性的remap標(biāo)記的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鯉魚反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子標(biāo)記，包括鯉魚反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列的預(yù)測(cè)，鑒定；篩選鯉魚多態(tài)性REMAP標(biāo)記，以及對(duì)鯉魚反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測(cè)，開發(fā)了鯉魚一個(gè)多態(tài)性豐富的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子REMAP標(biāo)記。本發(fā)明可應(yīng)用于鯉魚種群的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異水平等研究以及鯉魚地理種群的種質(zhì)鑒定。
【專利說(shuō)明】一種評(píng)估鯉魚種群遺傳多樣性的REMAP標(biāo)記

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記技術(shù)，具體涉及評(píng)估在鯉魚地理種群遺傳多樣性和種質(zhì) 鑒定的REMAP多態(tài)性標(biāo)記。

【背景技術(shù)】
[0002] 鯉魚（Cyprinus Carpio)是我國(guó)最主要的淡水養(yǎng)殖品種之一，根據(jù)FA02010報(bào)道， 鯉魚的總產(chǎn)量占全世界魚肉產(chǎn)量的10%。由于鯉魚廣泛分布于我國(guó)各大水系，加之人工選 擇育種的原因，鯉魚的一些優(yōu)良品種經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)后，遺傳多樣性急劇下降，因此保護(hù)和鑒 定鯉魚種質(zhì)資源是非常必要的。
[0003] REMAP技術(shù)是近年來(lái)新開發(fā)的多態(tài)性分子標(biāo)記，因在基因組中廣泛分布，多態(tài)性 高，鑒定效率高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。目前，REMAP技術(shù)僅在植物中常見，但在魚類中研宄 很少。REMAP是由Kalendar等（1999)首次提出和建立，其原理是根據(jù)逆轉(zhuǎn)座子的LTR保守 序列和微衛(wèi)星重復(fù)序列設(shè)計(jì)兩個(gè)引物，從而擴(kuò)增出逆轉(zhuǎn)座子與最鄰近的微衛(wèi)星間的片段， REMAP檢測(cè)的是基因組內(nèi)逆轉(zhuǎn)座子與相鄰微衛(wèi)星DNA之間的長(zhǎng)度多態(tài)性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于：開發(fā)鯉魚REMAP標(biāo)記，提供多態(tài)性引物，建立鯉 魚REMAP技術(shù)的開發(fā)體系，為鯉魚的遺傳背景分析提供更多新的分子標(biāo)記，提高種質(zhì)資源 鑒定的效率。
[0005] 本發(fā)明所要解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案：通過(guò)454高通量測(cè)序儀對(duì)鯉魚所獲得的序 列，進(jìn)行長(zhǎng)片段拼接，利用生物信息學(xué)的方法鑒定長(zhǎng)片段反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列，篩選出含有長(zhǎng) 末端重復(fù)序列的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（LTR)多態(tài)性引物，并對(duì)鯉魚的LTR位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢 測(cè)，開發(fā)出1個(gè)多態(tài)性豐富的LTR REMAP標(biāo)記，CLl，其核苷酸序列為SEQ ID NO :1。
[0006] 鯉魚LTR的REMAP標(biāo)記的CLl的引物序列為：
[0007] CLl-F ：GCTACTTTATTAGACCAGA
[0008] CLl-R :TGTGTGTGTGTGCG。
[0009] 利用該引物擴(kuò)增不同地理種群的鯉，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記在鯉魚多個(gè)地理種群的基因組中 具有拷貝數(shù)高，多態(tài)性豐富，擴(kuò)增穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)︴庺~種群的遺傳多樣性進(jìn)行有效評(píng) 估，因此將該引物開發(fā)成試劑盒，用于檢測(cè)鯉魚種群的遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定研宄。
[0010] 本申請(qǐng)以鯉中具有代表性的松荷鯉，荷包紅鯉，鏡鯉，興國(guó)紅鯉，黑龍江鯉，黃河鯉 和建鯉7個(gè)地理種群為例進(jìn)行說(shuō)明。涉及如下技術(shù)方案：
[0011] 1.鯉魚反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子REMAP標(biāo)記，其特征在于：所述的REMAP標(biāo)記CLl，其核苷酸 序列如SEQ ID NO :1所述。
[0012] 2.權(quán)利要求1所述的鯉魚反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子REMAP標(biāo)記的引物，其特征在于：其為 CLl-F :GCTACTTTATTAGACCAGA ; CL I-R :TGTGTGTGTGTGCG。
[0013] 3. -種試劑盒，其包含權(quán)利要求2所述的引物。
[0014] 4、權(quán)利要求1所述的標(biāo)記或權(quán)利要求2所述的引物或權(quán)利要求3所述的試劑盒在 區(qū)分鯉不同地理種群的種質(zhì)特異性方面的用途。
[0015] 5、如權(quán)利要求4所述的用途，不同地理種群的種質(zhì)分別為：松荷鯉，荷包紅鯉，鏡 鯉，興國(guó)紅鯉，錦鯉，黃河鯉和建鯉。
[0016] 6、一種鑒定鯉不同地理種群的種質(zhì)特異性的方法，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求2 所述引物擴(kuò)增7個(gè)地理群體的DNA樣本，在每個(gè)群體中產(chǎn)生了 9-14個(gè)清晰可辨的多態(tài)性 位點(diǎn)，鑒定結(jié)果為：松荷鯉在1200bp，475bp和455bp出現(xiàn)特異等位基因，荷包紅鯉在495bp 和475bp出現(xiàn)特異等位基因；鏡鯉是基因組純度較高的地理種群，800bp，830bp，470bp， 330bp，310bp和300bp等位基因在鏡鯉種群中出現(xiàn)缺失；興國(guó)紅鯉在540bp出現(xiàn)特異等位 基因；黑龍江鯉在310bp，330bp和340bp出現(xiàn)特異等位基因；黃河鯉在1200bp出現(xiàn)特異位 點(diǎn)且380-500bp區(qū)間由于等位基因缺失，所形成特異區(qū)域；建鯉在505和495bp出現(xiàn)特異等 位基因。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1 :7個(gè)地理種群的REMAP標(biāo)記的遺傳多樣性電泳圖。左I :DL2000Marker ;左 2-4 :松荷鯉；5-7 :荷包紅鯉；8-10 :鏡鯉；11-13 :興國(guó)紅鯉；14-16 :黑龍江鯉；17-19 :黃河 鯉；20-22 :建鯉。箭頭所示為每個(gè)種群的特異位點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 1.鯉魚基因組序列的獲得
[0019] 利用454高通量測(cè)序儀對(duì)鯉魚基因組進(jìn)行測(cè)序，獲得0. OlX覆蓋，測(cè)序深度為1。
[0020] 2.鯉魚LTR序列的鑒定流程
[0021] 從鯉魚基因組中的片段序列中，鑒定轉(zhuǎn)座子分類：
[0022] 利用 Repeat masker 軟件的 RepeatModeler (http://www. repeatmasker. org/ RepeatModeler. html)，進(jìn)行denovo的重復(fù)序列鑒定；
[0023] 鑒定含有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的序列：
[0024] 利用blastn確認(rèn)TE中含有轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白：將這些序列與斑馬魚的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座 子的氨基酸序列進(jìn)行 blastx 比對(duì)（http://www. repeatmasker. org/RepeatProteinMask. html#database)。將所有含有轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的編碼蛋白，按長(zhǎng)度進(jìn)行排序；
[0025] 鑒定全長(zhǎng)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列：
[0026] 利用軟件LTR FINDER掃描候選序列，挑選具有完好的TSD、PBS、PPT，以及在編碼 功能域的部分不包含相位移位和編碼終止子的序列。
[0027] 3.基于REMAP技術(shù)，LTR多態(tài)性標(biāo)記的開發(fā)：
[0028] 利用REMAP技術(shù)建立鯉魚LTR多態(tài)性分子標(biāo)記的體系
[0029] 3. 1基因組提取
[0030] 利用QIAGEN基因組試劑盒提取鯉魚松荷鯉，荷包紅鯉，鏡鯉，興國(guó)紅鯉，黑龍江 鯉，黃河鯉和建鯉7個(gè)地理種群的基因組DNA。每個(gè)地理種群各采樣50尾，共350個(gè)樣品；
[0031] 3. 2多態(tài)性引物設(shè)計(jì)
[0032] REMAP中的逆轉(zhuǎn)座子引物從逆轉(zhuǎn)座子LTR保守區(qū)域設(shè)計(jì)Pl :GCTACTTTATTAGACCAG， 而選擇性添加的引物則為SSR引物P2 :TGTGTGTGTGTGCG ;
[0033] 3. 3REMAP分子標(biāo)記PCR反應(yīng)技術(shù)體系的建立
[0034] 利用3. 2得到的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為25uL:基因組DNA40ng， 2. 5mmol/LMgC12 I. 5uL，dNTps2. OuL，10XBuffer2. 5uL，TaqDNA 聚合酶 I. 5U，lOumol/L Pl 引物 I. OuL，lOumol/L P2 引物 L OuL，加 ddH20 至 25uL。反應(yīng)程序：4°C預(yù)變性 4min ;94°C 變性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸lmin30s，共36個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用 8%聚丙稀胺凝膠分離，片段長(zhǎng)度分析軟件Gelpro根據(jù)Marker DL2000確定。
[0035] 3. 4多態(tài)性引物檢測(cè)
[0036] 利用軟件Genepop3. 4檢測(cè)該位點(diǎn)的哈迪-溫伯格平衡（HWE)，軟件popgene3. 0檢 測(cè)該LTR位點(diǎn)的等位基因數(shù)目，遺傳多樣性（Nei's gene diversity(1973))和Shannon's 遺傳多樣性指數(shù)（Shannon's information index)。結(jié)果表明：在鯉7個(gè)地理種群中，共獲 得多態(tài)性位點(diǎn)21個(gè)，遺傳多樣性為0. 2774, Shannon' s遺傳多樣性指數(shù)為0. 3372。如圖1 和表1所示。
[0037] 該LTR序列在種間存在較強(qiáng)的多態(tài)性，在種內(nèi)出現(xiàn)較強(qiáng)的保守性。松荷鯉在 1200bp，475bp和455bp出現(xiàn)特異等位基因，荷包紅鯉在495bp和475bp出現(xiàn)特異等位基因； 鏡鯉是基因組純度較高的地理種群，800bp，830bp，470bp，330bp，310bp和300bp等位基因 在鏡鯉種群中出現(xiàn)缺失；興國(guó)紅鯉在540bp出現(xiàn)特異等位基因；黑龍江鯉在3IObp，330bp 和340bp出現(xiàn)特異等位基因；黃河鯉在1200bp出現(xiàn)特異位點(diǎn)且380-500bp區(qū)間由于等位基 因缺失，所形成特異區(qū)域；建鯉在505和495bp出現(xiàn)特異等位基因，這些特異的等位基因?yàn)?趣魚品種的種質(zhì)鑒定提供了尚效的工具。
[0038] 表1 7個(gè)鯉魚地理種群的REMAP標(biāo)記的遺傳多樣性統(tǒng)計(jì)表
[0039]

【權(quán)利要求】
1. 鯉魚反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子REMAP標(biāo)記，其特征在于：所述的REMAP標(biāo)記CL1，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO :1 所述。
2. 權(quán)利要求1所述的鯉魚反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子REMAP標(biāo)記的引物，其特征在于：其為CL 1-F : GCTACTTTATTAGACCAGA ；CL 1-R ：TGTGTGTGTGTGCG〇
3. -種試劑盒，其包含權(quán)利要求2所述的引物。
4. 權(quán)利要求1所述的標(biāo)記或權(quán)利要求2所述的引物或權(quán)利要求3所述的試劑盒在區(qū)分 鯉不同地理種群的種質(zhì)特異性方面的用途。
5. 如權(quán)利要求4所述的用途，不同地理種群的種質(zhì)分別為：松荷鯉，荷包紅鯉，鏡鯉，興 國(guó)紅鯉，錦鯉，黃河鯉和建鯉。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104498488SQ201410734479
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】張研, 徐鵬, 李曉敏, 孫效文 申請(qǐng)人:張研, 徐鵬, 李曉敏, 孫效文