氫離子轉(zhuǎn)運無機焦磷酸酶基因表達(dá)差異在番茄耐鹽性上的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種氫離子轉(zhuǎn)運無機焦磷酸酶基因表達(dá)差異在番茄耐鹽性上的應(yīng)用，它是以5-6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉。離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗1次，葉片用剪刀剪成長方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分。選擇化學(xué)純的5%NaCl，處理時間為6min。本發(fā)明提取鹽脅迫后2min的離體葉片RNA，通過實時定量PCR，耐鹽性強的番茄基因型H+-PPase基因表達(dá)量增強，耐鹽性弱的表達(dá)量變化很小。通過H+-PPase基因表達(dá)差異，比較番茄耐鹽大小。本方法在基因水平上揭示番茄耐鹽潛力，對于培育抗逆性提高的番茄及其他植物新品種具有重要的理論和實際意義。
【專利說明】氫離子轉(zhuǎn)運無機焦磷酸酶基因表達(dá)差異在番茄耐鹽性上的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及氫離子轉(zhuǎn)運無機焦磷酸酶(H+-PPase)基
因表達(dá)差異在番茄耐鹽性上的應(yīng)用。更具體地說是一種利用H+-PPase基因表達(dá)差異檢測番茄耐鹽性的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類社會的發(fā)展，人們對土地不斷開發(fā)利用，致使土壤次生鹽潰化程度日益加重。作為主要的蔬菜作物之一，番茄的耐鹽性研究引起人們高度重視，相關(guān)研究已逐漸展開和深化。但因涉及到的參數(shù)和指標(biāo)包括形態(tài)、生物量和生理生化等多個方面，加上鑒定時期也各不相同，故目前尚未形成統(tǒng)一的方法和標(biāo)準(zhǔn)用于番茄耐鹽性鑒定。番茄耐鹽性鑒定方面的研究主要兩種，一種是形態(tài)鑒定，地上部鮮重、根鮮重、地上部干重、根干重、壯苗指數(shù)、根/冠比作為幼苗期耐鹽鑒定指標(biāo)；其次是生理生化指標(biāo)，主要有脯氨酸、可溶性糖、丙二醛、相對葉綠素含量(SPAD)、SOD活性、POD活性等。番茄耐鹽性的遺傳規(guī)律還不是很清楚，控制耐鹽基因的遺傳定位也有待于深入研究，特別是還沒有找到能對番茄耐鹽性進(jìn)行可靠、高效的鑒定方法。半定量RT-PCR技術(shù)是研究植物的基因表達(dá)水平變化的一項重要技術(shù)，根據(jù)PCR擴增產(chǎn)物的量可以確定目標(biāo)基因的表達(dá)水平。RT-PCR為反轉(zhuǎn)錄RCR(reversetranscript1n PCR)和實時PCR (real time PCR)共同的縮寫。反轉(zhuǎn)錄PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴增。RT-PCR的指數(shù)擴增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA。
[0003]H+-PPase是定位于植物液泡膜上的一種H+轉(zhuǎn)運蛋白，它水解ppi為pi的同時能將H+從細(xì)胞質(zhì)跨過液泡膜泵入植物液泡中，從而起到酸化液泡、維持跨液泡膜H+梯度的作用。近幾年，此酶在植物抵御鹽脅迫和調(diào)節(jié)植物生長方面的功能中逐步被認(rèn)識，并廣泛應(yīng)用。
[0004]本研究以番茄為材料，通過Real-time PCR技術(shù)對番茄鹽脅迫時H+-PPase基因的表達(dá)差異性分析，鑒定番茄耐鹽性。其目在于針對目前還沒有找到能對番茄耐鹽性進(jìn)行可靠、高效的鑒定方法，從基因水平上區(qū)分耐鹽性不同的番茄基因型，為培育抗逆性提高的番茄及其他植物新品種提供行之有效的檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是利用鹽脅迫時離體葉片中H+-PPase (氫離子轉(zhuǎn)運無機焦磷酸酶)基因的表達(dá)差異來檢測番茄的耐鹽性。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下方法予以實現(xiàn):
一種用于番茄耐鹽性測定的特異性引物，它具有SEQ ID NO: 1-2所示的核苷酸序列: it-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca。
[0007]本發(fā)明進(jìn)一步公開了采用特異性引物進(jìn)行番茄耐鹽性測定的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行:
(1)以5-6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉，離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗I次，葉片用剪刀剪成I X 2cm大小的長方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分；
(2)選擇化學(xué)純的NaCl，5-8%(w/w)，處理時間為2_6min，提取葉片總RNA ;優(yōu)選NaCl，5% (w/w),處理時間為2min。
[0008](3)將得到的cDNA溶液用于下一步PCR擴增；
(4) Real-time PCR
引物設(shè)計:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca
Real-time PCR 反應(yīng)體系:
模板:3ul 引物(0.4ηΜ):2ul All-1n-one:10ul MOX:0.4ul 水:2.6ul
其中所述的取番茄植株第一片成熟葉指的是從上往下數(shù)的第一片成熟葉。
[0009]本發(fā)明更進(jìn)一步公開了番茄耐鹽性的測定方法在不同基因型番茄苗耐鹽性方面的應(yīng)用。實驗結(jié)果表明:植物在受到各種逆境危害時，膜的功能首先受到影響，通過膜上H+-PPase基因表達(dá)能快速準(zhǔn)確地比較不同基因型的耐鹽性。采用本發(fā)明的方法可以解決鑒定番茄耐鹽性受環(huán)境和植株大小等多方面影響的問題。可以有效地壓縮田間試驗的規(guī)模，節(jié)約時間和人力，大幅度提聞優(yōu)良耐鹽基因型的篩選效率，加速耐鹽植物育種的步伐。
[0010]耐鹽能力不同的番茄基因型，鹽脅迫下離體葉片中H+-PPase基因表達(dá)有很大的差異，耐鹽性強的番茄基因型H+-PPase基因表達(dá)量增強，耐鹽性弱的表達(dá)量變化很小。通過H+-PPase基因表達(dá)差異，比較番茄耐鹽大小。
[0011]本發(fā)明更加詳細(xì)的制備方法描述如下:
以5-6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉(從上往下數(shù))。離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗I次，葉片用剪刀剪成I X 2cm大小的長方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分。選擇化學(xué)純的NaCl，溶液濃度一般以5%為宜。處理時間為6min。葉片脅迫時間過長RNA降解嚴(yán)重，提取困難。本發(fā)明是通過RT-PCR技術(shù)比較鹽脅迫下離體葉片中H+-PPase基因在不同基因型中的表達(dá)差異。耐鹽性強的番茄基因型H+-PPase基因表達(dá)量增強，耐鹽性弱的表達(dá)量變化很小。通過H+-PPase基因表達(dá)差異，比較番茄耐鹽大小。
[0012]本發(fā)明公開的番茄葉片耐鹽性的檢測方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于:
Cl)發(fā)明提取鹽脅迫時番茄葉片的RNA，通過RT-PCR技術(shù)，可以檢測很低拷貝數(shù)的RNA，非常靈敏。
[0013](2)杜絕了通過番茄形態(tài)、生物量和生理生化等受環(huán)境和植株大小等多方面的影響。可以有效地壓縮田間試驗的規(guī)模，節(jié)約時間和人力，大幅度提高優(yōu)良耐鹽基因型的篩選效率，加速耐鹽植物育種的步伐。
[0014](3)利用本方法檢測番茄耐鹽性，只需要提供一片成熟葉即可，不需要整個植株，大大減少了工作量，方便快捷。
[0015]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1鹽脅迫下H+-PPase基因表達(dá)差異；其中1-4為LA2711，l:0min，2:2 min, 3:4min, 4:6min。5-8 為 JF544, 5:Omin, 6:2 min, 7:4 min, 8:6min。
[0016]M:marker 自上而下為:100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。
[0017]

【具體實施方式】
下述實施例中所用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。所用到的耐鹽番茄LA2711和不耐鹽的天津地方品種津粉544番茄苗均由市售。
[0018]實施例1
1、耐鹽番茄LA2711和不耐鹽的天津地方品種津粉544 5_6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉(從上往下數(shù))。離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗I次，葉片用剪刀剪成lX2cm大小的長方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分。離體葉片在5% (w/w)氯化鈉溶液中經(jīng)過0，2，4，6min脅迫后，提取葉片總RNA，進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0019]2、利用北京全式金生物技術(shù)有限公司的Transcript First-Strand cDNASynthesis SuperMix進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到的cDNA溶液用于下一步PCR擴增。
[0020]3、Real-time PCR 引物設(shè)計:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca
Real-time PCR 反應(yīng)體系:
模板:3ul 引物(0.4ηΜ):2ul All-1n-one:10ul MOX:0.4ul 水:2.6ul。
[0021 ] 反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。以耐鹽番茄LA2711和不耐鹽的天津地方品種津粉544的離體葉片為材料，在5%氯化鈉溶液中脅迫不同時間，H+-PPase基因在LA2711對照葉片中沒有表達(dá)，鹽脅迫2min后表達(dá)急劇增強，4min后降低；而在JF544的葉片中H+-PPase基因表達(dá)不明顯。因此離體葉片在5%氯化鈉溶液中脅迫2min，H+-PPase基因表達(dá)差異可以區(qū)分不同基因型番茄耐鹽性。
[0022]實施例2
采用特異性引物進(jìn)行番茄耐鹽性測定的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行:
(I)以5-6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉，指的是從上往下數(shù)的第一片成熟葉。離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗I次，葉片用剪刀剪成I X 2cm大小的長方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分；(2)選擇化學(xué)純的NaCl，5%(w/w)，處理時間為2min，提取葉片總RNA ;
(3)將得到的cDNA溶液用于下一步PCR擴增；
(4)Real-time PCR引物設(shè)計:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct getReverse: cac gcacggtggt cttctcttcaReal-time PCR 反應(yīng)體系:
模板:3ul引物(0.4ηΜ):2ulAll-1n-one:10ulMOX:0.4ul水:2.6ul。
【權(quán)利要求】
1.一種用于測定番茄耐鹽性的特異性引物，它具有SEQ ID NO: 1-2所示的核苷酸序列:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca。
2.一種采用權(quán)利要求1所述的特異性引物進(jìn)行番茄耐鹽性測定的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行: (1)以5-6葉番茄苗為材料，取番茄植株第一片成熟葉，離體葉片用蒸餾水沖洗3次，去離子水沖洗I次，葉片用剪刀剪成I X 2cm大小的長方形，然后用去離子水沖洗3次，吸水紙吸干水分； (2)選擇化學(xué)純的NaCl，5-8%(w/w)，處理時間為2_6min，提取葉片總RNA ; (3)將得到的cDNA溶液用于下一步PCR擴增；
(4)Real-time PCR
引物設(shè)計:
Irt-PPase Forwoard: aatgaagagtgttggaagtgct get
Reverse: cac gcacggtggt cttctcttca
Real-time PCR 反應(yīng)體系: 模板:3ul 引物(0.4nM):2ul All-1n-one:1ul MOX:0.4ul 水:2.6ul。
3.權(quán)利要求1所述番茄耐鹽性的測定方法，其中所述的取番茄植株第一片成熟葉指的是從上往下數(shù)的第一片成熟葉。
4.權(quán)利要求1所述番茄葉片耐鹽性的測定方法，其中所述的NaCl，5%(w/w)，處理時間為 2min。
5.權(quán)利要求1所述番茄葉片耐鹽性的測定方法可在不同基因型番茄苗耐鹽性方面應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450906SQ201410734091
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】郟艷紅, 王姝, 宋建, 吉利柱 申請人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心