一種hbv dna數字pcr定量檢測試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于病毒體外檢測【技術領域】，具體為一種HBVDNA數字PCR定量檢測試劑盒及其應用。本發(fā)明提供檢測試劑盒，包括PCR反應引物：SEQIDNO.1、SEQIDNO.3與探針SEQIDNo.2；SEQIDNo.4、SEQIDNo.6與探SEQIDNo.5；SEQIDNo.7、SEQIDNo.9與探針SEQIDNo.8；作為內參反應引物：SEQIDNo.10、SEQIDNo.12與探針SEQIDNo.11，以及競爭性探針：SEQIDNo.13～SEQIDNo.16。使用時提取人血漿樣本DNA，采用復合熒光多重PCR技術在數字PCR芯片微孔中對靶DNA進行擴增；顯示藍色熒光的微孔數即為總反應體系中HBVDNA定量結果。本發(fā)明用于HBV定量檢測，快速、簡便、靈敏度高、特異性強，適于大規(guī)模推廣應用。
【專利說明】-種HBV DNA數字PCR定量檢測試劑盒及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒體外檢測【技術領域】，具體涉及一種JffiV DNA數字PCR定量檢測試 劑盒及其應用。 技術背景
[0002] 慢性乙型肝炎（Chronic Hepatitis B, CHB)是由于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV)在人肝細胞中慢性感染所致的一種肝臟炎癥疾病，其持續(xù)進展可導致肝硬化、 肝功能衰竭及肝癌。據估計，全世界目前有HBV攜帶者約3. 5億人，每年約有100萬人死于 HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化或肝癌。2012年，由中華醫(yī)學會肝病分會和中國醫(yī)學會感 染病學分會聯合制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》指出，目前我國現有的慢性HBV感染者約 9300萬，其中CHB患者超過2000萬。
[0003] 對于CHB，無論是中國版的還是歐洲肝病協(xié)會制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》均 指出，抗病毒治療是最重要的治療措施。在CHB的抗病毒治療中，核苷(酸）類似物(包括拉 米夫定、阿德福韋酯、替比夫定、恩替卡韋、替諾夫韋酯等）以其口服方便、抗病毒療效確切 成為CHB患者中應用最為廣泛的一類藥物，其中恩替卡韋及替諾福韋酯為國內外指南推薦 的一線用藥。
[0004] 無論是采用核苷(酸）類似物還是干擾素等進行抗HBV治療，其抗病毒療效監(jiān)測均 需要對CHB患者外周血中的病毒載量進行檢測，即HBV DNA定量檢測。在國內外相關的治療 指南中均指出，無論是采用何種抗HBV治療方案，均需要采用HBV DNA定量檢測的方法對抗 HBV療效進行評估，理想狀態(tài)下，需將CHB患者外周血中的HBV DNA控制在現有檢測手段檢 測不到的水平。當前，國內外進行HBV DNA定量檢測采用的方法均為實時熒光PCR方法。國 際公認的HBV DNA定量檢測方法是羅氏公司生產的、在國際上具有參比價值的Roche COBAS TaqMan HBV Test檢測試劑盒。依據這一定量方法，美國肝病協(xié)會指出，在抗HBV治療中， HBV DNA定量水平應盡可能小于或等于10 IU/ml，歐洲肝病研究協(xié)會則指出，將HBV DNA定 量水平控制在10-15 IU/ml可有效防止疾病復發(fā)。在我國CFDA于2013年5月發(fā)布的《乙 型肝炎病毒脫氧核糖核酸定量檢測試劑注冊技術審查指導原則》中則建議HBV DNA定量檢 測試劑的最低檢出限應小于或等于30 IU/ml。
[0005] 然而，我國CFDA早期批準的HBV DNA定量檢測試劑，其靈敏度均在500 IU/ml以 上，難以達到慢性乙型肝炎臨床診療和我國法規(guī)的最新要求。2009年有學者以Roche試劑 盒為參照，對我國已批準上市的幾種HBV DNA定量檢測試劑進行了評估，結果表明，5種試 劑盒在IXlO4 -IX IO8 IU/ml范圍內，各種試劑盒的符合率較高。2013年中國食品藥品 檢定研究院的學者以Roche HBV DNA定量檢測試劑為參照，對一檢測靈敏度為500 IU/ml 的國產HBV DNA定量檢測試劑的質量進行了評估，在193份HBsAg陽性的樣本中，Roche試 劑盒檢出HBV DNA的樣本占到了 95%，而國產試劑則僅為70% ;而在122份HBsAg陰性的樣 本中，Roche試劑檢出約31%的樣本HBV DNA呈陽性，其中包括6份"兩對半"結果均呈陰性 的樣本，而國產試劑在這122份樣本中未檢出1例呈HBV DNA呈陽性。這樣的結果顯示國 產試劑盒質量有待進一步提高，最為重要的是要提高國產試劑盒對HBV DNA的檢測靈敏度。
[0006] 研究表明，HBV雖然是一種DNA病毒，但由于HBV DNA聚合酶本身無3'到5'端校 正功能，HBV DNA在復制過程中的自發(fā)突變率較高。依據HBV DNA序列的相似性，HBV至少 可分為A、B、C、E、F、G、H等7種基因型。中國慢性乙型肝炎患者中，則以C型和B型為主。 在傳統(tǒng)的HBV DNA實時熒光PCR檢測試劑中，雖然在進行引物設計時，會考慮到不同基因型 HBV間的保守性，但考慮到HBV自身高自發(fā)突變率，一套引物與探針對不同的基因型的覆蓋 率是有限的，除檢測試劑自身的靈敏度外，這可能也是國產HBV DNA實時熒光PCR檢測試劑 漏檢率高的重要原因之一。要提高對不同基因型HBV的覆蓋，一個可行的方案是通過多重 PCR進行檢測，即在HBV DNA多個保守區(qū)域同時進行檢測。由此而帶來的另一個問題是，熒 光信號強度與HBV DNA的量間的關系將不可避免地出現異化。


【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的就是針對上述對HBV DNA檢測靈敏度的更高需求(包括現實需求和 法規(guī)要求)，提供一種檢測快速、簡便，特異性強、靈敏度高的HBV DNA數字PCR定量檢測試 劑盒及其應用。
[0008] 根據HBV DNA數字PCR定量檢測要求，本發(fā)明首先設計HBV DNA特異性引物、檢測 探針和競爭性探針，具體如下：

【權利要求】
1. 一種HBV DNA數字PCR定量檢測試劑盒，其特征在于，其特征在于包括：第一引物容 器、第二引物容器、第三引物容器、第四引物容器；這些容器中具有探針組合物中對應的引 物對和探針： 第一引物容器內具有第一 PCR引物對SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3所示的核苷酸序 列，以及相應的檢測探針SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列； 第二引物容器內具有第二PCR引物對SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 6所示的核苷酸序 列，以及相應的檢測探針SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列； 第三引物容器內具有第三PCR引物對SEQ ID No. 7)和SEQ ID No. 9所示的核苷酸 序列，以及相應的檢測探針SEQ ID No. 8所示的核苷酸序列； 第四引物容器內具有第四PCR引物對SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 12所示的核苷酸 序列，以及相應的檢測探針SEQ ID No. 11所示的核苷酸序列； 其中，SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 8 熒光素標記為 FAM，SEQ ID No. 11 突光素標記為VIC。
2. 如權利要求1所述試劑盒在HBV DNA數字PCR定量檢測中的應用，其特征在于具體 步驟為： (1) 提取人血漿樣本中的DNA，包括HBV DNA與游離的人基因組DNA ; (2) 采用試劑盒中的引物與探針，通過復合熒光多重PCR引物在數字PCR檢測芯片微孔 中對靶DNA進行PCR擴增； (3) 檢測芯片微孔熒光情況：在檢出綠色熒光微孔的情況下，計數藍色熒光微孔數即為 總反應體系中HBV DNA定量結果。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于當藍色熒光檢測微孔數大于10000時，將上 樣模板稀釋1〇〇倍后重新進行檢測。
4. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述PCR擴增的反應體系為： 2X PCR反應緩沖液，包括了 Taq酶、dNTP、鎂離子 7. 25微升 10X HBV DNA檢測用引物、探針組合 1. 45微升 去離子水 0. 80微升 模板DNA 5. 00微升 總反應體積 14. 50微升 PCR反應條件為： 96度變性10分鐘，然后60度2分鐘、98度變性30秒，共39個循環(huán)，之后60度保溫2 分鐘，反應結束后進行FAM和VIC熒光信號檢測。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于所述多重PCR反應體系中，各引物探針的優(yōu) 選反應濃度依次為： SEQ ID No. 1 300nmol/L SEQ ID No. 2 lOOnmol/L SEQ ID No. 3 300nmol/L SEQ ID No. 4 300nmol/L SEQ ID No. 5 lOOnmol/L SEQ ID No. 6 300nmol/L SEQ ID No. 7 300nmol/L SEQ ID No. 8 lOOnmol/L SEQ ID No. 9 300nmol/L SEQ ID No. 10 350nmol/L SEQ ID No. 11 lOOnmol/L SEQ ID No. 12 350nmol/L SEQ ID No. 13 80nmol/L SEQ ID No. 14 80nmol/L SEQ ID No. 15 80nmol/L SEQ ID No. 16 80nmol/L 。
【文檔編號】C12Q1/70GK104450963SQ201410733794
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權日:2014年12月8日
【發(fā)明者】趙書民, 趙翊均, 周巍 申請人:上海五色石醫(yī)學研究有限公司