專利名稱：：一種制備¹³C標(biāo)記葡萄糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種制備葡萄糖的方法，尤其是涉及一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法。
背景技術(shù)：
：葡萄糖(glucose)是己醛糖，化學(xué)式C6H12O6，分子量為180，白色晶體，易溶于水，味甜，熔點(diǎn)146°C，結(jié)構(gòu)式如下ch2oh-choh-choh-choh-choh-cho。它是自然界分布最廣泛的單糖，被廣泛用于醫(yī)療輸液、生物原料等。13c標(biāo)記的葡萄糖是葡萄糖的標(biāo)記化合物，不僅用于呼吸法臨床診斷糖尿病、通過測(cè)知腦細(xì)胞新陳代謝，進(jìn)行早期腦血管、障礙或癡呆病變(例老年癡呆癥、帕金森氏癥、阿茲海默氏癥)的早期診斷，還可用于原料生產(chǎn)標(biāo)記葡萄糖的衍生物，以及在發(fā)酵中用做碳源，合成其他標(biāo)記產(chǎn)品。葡萄糖雖然在水果和蜂蜜中含量較高，但大規(guī)模生產(chǎn)方法卻不是從中提取的，因?yàn)檫@樣做成本太高。工業(yè)生產(chǎn)主要采用玉米和馬鈴薯中所含的淀粉經(jīng)淀粉酶轉(zhuǎn)化制取葡萄糖。對(duì)于標(biāo)記葡萄糖的合成，目前已經(jīng)探索出有機(jī)合成法、微生物光合作用法、發(fā)酵法以及酶法等幾種合成方法。(1)有機(jī)合成法Williams和Whaley以5-氧代-1，2_0_亞異丙基-D-木-五呋喃糖和Na13CN為原料，經(jīng)反應(yīng)得到葡(萄)糖醛酸和艾杜糠醛酸，在四氫呋喃溶液中經(jīng)LiAlH4還原得到1，2-0-亞異丙基-D-呋喃型葡萄糖-6-13C和1，2-0-亞異丙基-L-艾杜呋喃糖_6_13C，最后在三氟乙酸溶液中水解，得到D-葡萄糖6-13C，產(chǎn)率48%(D.L.Williams，Τ.W.ffhaley.Syntheseswithstableisotopes:D-glucose_6-Candl.6—anhydro-β—L—idopyranose—6-13C.JournalofLabelledCompoundsandRadiophamaceuticals.1982,19(5)=669-679)0SharonStone-Elander等利用遠(yuǎn)程裝置，以D-樹膠醛醣和[11C]氰化物為原料，在蟻酸中，利用熱催化活性鎳催化[I-11C]-羥醛腈中間體，獲得8-11%產(chǎn)率的[l-nQ-D-glucose，純度達(dá)到99%(SharonStone-Elander,ChristerHalldin,BengtLangstrom,GunnarBlomqvist,LennartWiden.Remote-controlledproductionof[I-11C]-D-glucoseandevaluationoftheeffectoflabelingpositiononlossof[11C]CO2-Appl.Radiat.Isot.1992,43(6):721_729)。(2)微生物光合作用法Ishiwata等通過菠菜的光合作用，將11CO2轉(zhuǎn)變成11C-葡萄糖和果糖的混合物(比例11)，同位素轉(zhuǎn)化率30-50%(K.Ishiwata,M.Monma,R.Iwata,T.Ido.Automatedphotosynthesisof"C-glucose.J.Lab.CpdsRadiopharm.1982,19:11-12)。Denutte等利用遠(yuǎn)程控制，通過海藻的光合作用，將11CO2轉(zhuǎn)變成11C-葡萄糖和果糖的混合物(比例31)，同位素轉(zhuǎn)化率10-15%(H.Denutte,G.Siegers,P.Goethals,C.VandeCasteele,A.DELeenheer.Remote-controlled,photosyntheticpreparationofHPLC-purified[11C]glucose.Int.J.Appl.Radiat.Isot.1985,36(1):82_84)。(3)發(fā)酵法RobertL.Baxter等以釀酒酵母屬菌株S41為出發(fā)菌株，培養(yǎng)基為酵母提取液10g、蛋白胨20g、醋酸鉀10g、葡萄糖lg、腺嘌呤0.2g和尿嘧啶0.2g。30°C，200rpm培養(yǎng)12h，然后將菌體離心，洗滌，并懸浮在每IOOml含有[I-13C]或[2_13C]醋酸鹽lg、腺嘌呤20mg和尿嘧啶20mg、氯化鉀0.75g和15mg芐青霉素中培養(yǎng)8h。菌體經(jīng)高氯酸處理，樹脂柱吸附，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮等獲得同位素海藻糖。海藻糖在硫酸溶液中100°C水解6h，樹脂柱吸附洗脫，得到60%D-[3，4-13C2]葡萄糖，10%D-[3-13C]和[4_13C]葡萄糖以及30%未標(biāo)記物質(zhì)(RobertL.Baxter,HelenC.Baxter,ChristopherJ.Mcgregor.MicrobiologicalpreparationofD-[3,4-13C2]glucose.1992,31(12):981_985)。EhrinE以海藻為原料，H11CO3-為唯一碳源，發(fā)酵。得到的菌體經(jīng)提取可獲得U-11C葡萄糖、果糖等多種糖。U-11C葡萄糖產(chǎn)量75mg/L(EhrinΕ,WestmanΕ,NilssonS.0,NilssonJ.G,LarssonC,Μ,TillbergJ.Ε.J.Lab.CpdsRadiopharm.1980，17453)。Luthra等在EhrinE的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，以豐度90%的13C碳酸鹽為唯一碳源，獲得了豐度為60%的U-13C-葡萄糖(S.KLuthra,V.WPike,F.Brady,D.R.Turton,B.Wood,R.WMatthews,G.EHawkes.Theutilityof13C/nC-C0-labellingandsubsequent13C-NMRinthecharacterizationof11C-Iabelledproducts.J.Lab.CpdsRadiopharm.1980,231070-1072)。(4)酶法Sturani以1，5二磷酸核酮糖與14CO2為原料，合成3_磷酸甘油酸_1_14C，再經(jīng)二磷酸核酮糖羧化酶作用得到葡萄糖-3和4-14C。產(chǎn)率35-40%(E.Sturani.Synthesisofglucose-3and4-14Cofhighspecificactivityandradiochemicalpurity.JournalofLabelledCompounds.1969,5(1):47_53)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種工藝簡(jiǎn)單、豐度較高、純度較高的制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)以畢赤酵母作為出發(fā)菌株，13C甲醇作為碳源，經(jīng)發(fā)酵、離心獲得菌體，經(jīng)乙醇溶液提取、脫色、結(jié)晶，獲得13C標(biāo)記的海藻糖；(2)將13C標(biāo)記的海藻糖酸解，然后，中和、脫色、結(jié)晶，獲得13C標(biāo)記的葡萄糖。該方法具體包括以下步驟(1)將畢赤酵母一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，115°C滅菌20min，再于28-37°C，控制轉(zhuǎn)速為150-240rpm搖瓶培養(yǎng)16_24h，得到種子液，以10%V/V的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，滅菌后用30%的濃氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH至4.0-6.0，加入滅菌的甲醇和微量元素，控制溫度為28-37°C，轉(zhuǎn)速為150-240rpm搖瓶發(fā)酵24_48h，升溫至40-50°C，維持0.5-4h得到菌體，再控制溫度為_55°C，轉(zhuǎn)速為4000rpm離心20min，將菌體用蒸餾水洗滌，繼續(xù)離心20min，控制溫度30-90°C，采用30_70wt%乙醇提取菌體0.5_5h，得到的提取液經(jīng)10000分子量的納濾膜過濾、市售D001樹脂脫色及無水乙醇結(jié)晶步驟，得到13C海藻糖；(2)將13C海藻糖放入硫酸中于95_105°C酸解5_8h，加入碳酸鋇中和到pH為6.8-7.0后，離心，上清液經(jīng)市售DOOl樹脂脫色，最后經(jīng)過濃縮、結(jié)晶，得到13C標(biāo)記的葡萄糖。所述步驟(1)中的種子培養(yǎng)基以蒸餾水為溶液，包括以下組分及含量13C甲醇，5-30mg/L，無氨基酸的酵母氮堿1-13.4g/L，生物素5_20mg/L，磷酸氫二鉀0.10-3.24g/L。所述步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分及含量=CaSO4·2H200.05-0.93g/L，MgSO4·7H201.5-14.9g/L，磷酸氫二鉀1-53.4g/L。所述步驟(1)中的微量元素包括以下組分及含量=FeSO4·7H2065g/L，MnSO4·H2O3g/L,Na2MoO4·2H200.2g/L,H3BO3O.2g/L,CoCl2O.5g/L,ZnCl220g/L,生物素0.2g/L,CuSO4·5Η206g/L，KI0.8g/L，肌醇0.3g/L，煙酰胺0.8g/L，對(duì)氨基苯甲酸0.06g/L，維生素B1O.8mg/L,維生素B2O.02mg/L。所述步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基、甲醇和微量元素的重量比為1000(5-30)(1-10)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用13C甲醇作為同位素原料，經(jīng)發(fā)酵，將獲得的菌體用乙醇溶液提取、脫色、結(jié)晶獲得13C海藻糖，再經(jīng)酸解，脫色、結(jié)晶，得到豐度和純度大于98%的13C葡萄糖產(chǎn)品，此工藝簡(jiǎn)單，原料來源容易，可獲得高豐度和純度的13C葡萄糖產(chǎn)品。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1將畢赤酵母一環(huán)接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)基包括(IL)=13C甲醇5mg,酵母氮堿(無氨基酸)13.4g，生物素5mg，磷酸氫二鉀1.32g，其余為蒸餾水，115°C滅菌20min。28°C,150rpm/min搖瓶培養(yǎng)16h，得到種子液。以10%V/V的接種量將種子液接入裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括(IL)0.05gCaSO4·2H20，1.92gMgSO4·7H20，13.4g磷酸氫二鉀，115°C滅菌20min，然后用膜滅菌的30%濃氨水調(diào)節(jié)ρΗ4·0，加入膜滅菌的IOml甲醇和4ml微量元素，微量元素包括(IL):65gFeSO4·7H20，3gMnS04·Η20，0·2gNa2MoO4,.2H20，0.2gH3BO3,0.5gCoCl2,20gZnCl2,0.2g生物素，6gCuSO4·5Η20，0·8gΚΙ，0·3g肌醇，0.8g煙酰胺，0.06g對(duì)氨基苯甲酸，0.8mg維生素&，0.02mg維生素B2。28°C，150rpm/min發(fā)酵48h后，升溫到40°C，維持0.5h。采用_5°C，4000rpm/min離心20min，將IOOg菌體用蒸餾水洗滌，繼續(xù)離心。將菌體采用60wt%乙醇、90°C提取4h，提取液經(jīng)10000分子量的納濾膜過濾、DOOl樹脂脫色，無水乙醇結(jié)晶，得到1.5g13C海藻糖。將1.5g13C海藻糖放入硫酸中95°C酸解8h，加入碳酸鋇中和到pH7.0后，離心，上清液經(jīng)DOOl樹脂脫色，濃縮、結(jié)晶，得到0.93g13C葡萄糖產(chǎn)品。純度不少于98%，豐度大于98%。實(shí)施例2將畢赤酵母一環(huán)接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)基包括(IL)=13C甲醇30mg，酵母氮堿(無氨基酸)3.4g，生物素20mg，磷酸氫二鉀0.10g，其余為蒸餾水，115°C滅菌20min。37°C，240rpm/min搖瓶培養(yǎng)24h，得到種子液。以10%V/V的接種量將種子液接入裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括(IL)0.93gCaSO4·2H20,1.5gMgSO4·7H20,Ig磷酸氫二鉀，115°C滅菌20min，然后用膜滅菌的30%濃氨水調(diào)節(jié)pH4.5，加入膜滅菌的IOml甲醇和Iml微量元素，微量元素包括(IL):65gFeSO4·7Η20,3gMnSO4-H2O,0.2gNa2MoO4,·2Η20，0·2gH3BO3,0.5gCoCl2,20gZnCl2,0.2g生物素，6gCuS04·5Η20，0·8gKI，0.3g肌醇，0.8g煙酰胺，0.06g對(duì)氨基苯甲酸，0.8mg維生素B1,0.02mg維生素B2。37°C，240rpm/min發(fā)酵24h后，升溫到40°C，維持3h。采用5°C，4000rpm/min離心20min，將80g菌體用蒸餾水洗滌，繼續(xù)離心。將菌體采用40wt%乙醇、30°C提取lh，提取液經(jīng)10000分子量的納濾膜過濾、DOOl樹脂脫色，無水乙醇結(jié)晶，得到1.42g13C海藻糖。將1.42g13C海藻糖放入硫酸中105°C酸解5h，加入碳酸鋇中和到pH7.0后，離心，上清液經(jīng)DOOl樹脂脫色，濃縮、結(jié)晶，得到0.78g13C葡萄糖產(chǎn)品。純度不少于98%，豐度大于98%。實(shí)施例3將畢赤酵母一環(huán)接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)基包括(IL)=13C甲醇IOmg,酵母氮堿(無氨基酸)6.Sg,生物素15mg，磷酸氫二鉀3.24g，其余為蒸餾水，115°C滅菌20min。37°C,200rpm/min搖瓶培養(yǎng)16h，得到種子液。以10%V/V的接種量將種子液接入裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括(IL)0.23gCaSO4·2H20，14.9gMgSO4·7H20,22.5g磷酸氫二鉀，115°C滅菌20min，然后用膜滅菌的30%濃氨水調(diào)節(jié)ρΗ6·0，加入膜滅菌的IOml甲醇和IOml微量元素，微量元素包括(IL):65gFeSO4·7H20，3gMnS04·Η20，0·2gNa2MoO4,.2H20，0.2gH3BO3,0.5gCoCl2,20gZnCl2,0.2g生物素，6gCuSO4·5Η20，0·8gΚΙ，0·3g肌醇，0.8g煙酰胺，0.06g對(duì)氨基苯甲酸，0.8mg維生素&，0.02mg維生素B2。30°C，200rpm/min發(fā)酵24h后，升溫到50°C，維持4h。采用0°C，4000rpm/min離心20min，將112g菌體用蒸餾水洗滌，繼續(xù)離心。將菌體采用70wt%乙醇、50°C提取3h，提取液經(jīng)10000分子量的納濾膜過濾、DOOl樹脂脫色，無水乙醇結(jié)晶，得到1.62g13C海藻糖。將1.62g13C海藻糖放入硫酸中100°C酸解6h，加入碳酸鋇中和到pH7.0后，離心，上清液經(jīng)DOOl樹脂脫色，濃縮、結(jié)晶，得到1.38g13C葡萄糖產(chǎn)品。純度不少于98%，豐度大于98%。實(shí)施例4將畢赤酵母一環(huán)接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)基包括(IL)=13C甲醇15mg，酵母氮堿(無氨基酸)10.2g，生物素10mg，磷酸氫二鉀2.76g，其余為蒸餾水，115°C滅菌20min。再于30°C，180rpm/min搖瓶培養(yǎng)20h，得到種子液。以10%V/V的接種量將種子液接入裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括(IL)0.57gCaSO4·2H20，8.3gMgSO4·7H20，37.8g磷酸氫二鉀，115°C滅菌20min，然后用膜滅菌的30%濃氨水調(diào)節(jié)ρΗ5·0，加入膜滅菌的IOml甲醇和7ml微量元素，微量元素包括(IL):65gFeSO4·7H20，3gMnSO4‘H20,0.2gNa2MoO4,.2H20，0.2gH3BO3,0.5gCoCl2,20gZnCl2,0.2g生物素，6gCuSO4·5Η20，0·8gΚΙ，0·3g肌醇，0.8g煙酰胺，0.06g對(duì)氨基苯甲酸，0.8mg維生素&，0.02mg維生素B2。30°C，180rpm/min發(fā)酵48h后，升溫到45°C，維持3h。采用0°C，4000rpm/min離心20min，將123g菌體用蒸餾水洗滌，繼續(xù)離心。將菌體采用50wt%乙醇、75°C提取5h，提取液經(jīng)10000分子量的納濾膜過濾、DOOl樹脂脫色，無水乙醇結(jié)晶，得到1.36g13C海藻糖。將1.36g13C海藻糖放入硫酸中95°C酸解8h，加入碳酸鋇中和到pH7.O后，離心，上清液經(jīng)DOOl樹脂脫色，濃縮、結(jié)晶，得到0.88g13C葡萄糖產(chǎn)品。純度不少于98%，豐度大于98%。實(shí)施例5將畢赤酵母一環(huán)接入裝有50ml種子培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)基包括(IL)=13C甲醇20mg，酵母氮堿(無氨基酸)5.lg，生物素12.5mg，磷酸氫二鉀0.76g，其余為蒸餾水，115°C滅菌20min。37°C200rpm/min搖瓶培養(yǎng)16h，得到種子液。以10%V/V的接種量將種子液接入裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml搖瓶中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括(IL)0.74gCaSO4·2H20，6.7gMgSO4·7H20，53.4g磷酸氫二鉀，115°C滅菌20min，然后用膜滅菌的30%濃氨水調(diào)節(jié)ρΗ5·8，加入膜滅菌的IOml甲醇和5ml微量元素，微量元素包括(IL):65gFeSO4·7H20，3gMnSO4‘H20,0.2gNa2MoO4,.2H20，0.2gH3BO3,0.5gCoCl2,20gZnCl2，0.2g生物素，6gCuS04·5H20,0.8gKI,0.3g肌醇，0.8g煙酰胺，0.06g對(duì)氨基苯甲酸，0.8mg維生素B1,0.02mg維生素B2。30°C，200rpm/min發(fā)酵24h后，升溫到43°C，維持2h。采用0°C，4000rpm/min離心20min，將147g菌體用蒸餾水洗滌，繼續(xù)離心。將菌體采用30wt%乙醇、40°C提取0.5h，提取液經(jīng)10000分子量的納濾膜過濾、DOOl樹脂脫色，無水乙醇結(jié)晶，得到1.45g13C海藻糖。將1.45g13C海藻糖放入硫酸中100°C酸解6h，加入碳酸鋇中和到pH7.0后，離心，上清液經(jīng)DOOl樹脂脫色，濃縮、結(jié)晶，得到1.13g13C葡萄糖產(chǎn)品。純度不少于98%，豐度大于98%。實(shí)施例6一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法，該方法包括以下步驟(1)將畢赤酵母一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基以蒸餾水為溶液，包括以下組分及含量=13C甲醇10mg/L，無氨基酸的酵母氮堿lg/L，生物素10mg/L，磷酸氫二鉀2g/L，115°C滅菌20min，再于37°C，控制轉(zhuǎn)速為200rpm搖瓶培養(yǎng)16h，得到種子液。以10%V/V的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分及含量=CaSO4·2H200.5g/L，MgSO4·7H2010.9g/L，磷酸氫二鉀53.4g/L，滅菌后用30%的濃氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH至4.0-6.0，加入滅菌的甲醇和微量元素，發(fā)酵培養(yǎng)基、甲醇和微量元素的重量比為100051，微量元素包括以下組分及含量=FeSO4·7H2065g/L，MnSO4·H2O3g/L，Na2MoO4·2H200.2g/L,H3BO3O.2g/L,CoCl2O.5g/L,ZnCl220g/L,生物素0.2g/L,CuSO4·5H206g/L，KI0.8g/L，肌醇0.3g/L，煙酰胺0.8g/L，對(duì)氨基苯甲酸0.06g/L，維生素B1O.8mg/L,維生素B2O.02mg/L,控制溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為200rpm搖瓶發(fā)酵24h，升溫至40V，維持3h得到菌體，再控制溫度為0°C，轉(zhuǎn)速為4000rpm離心20min，將菌體用蒸餾水洗滌，繼續(xù)離心20min，控制溫度70°C，采用50wt%乙醇提取菌體5h，得到的提取液經(jīng)10000分子量的納濾膜過濾、市售DOOl樹脂脫色及無水乙醇結(jié)晶步驟，即得到13C海藻糖；(2)將13C海藻糖放入硫酸中于100°0酸解61!，加入碳酸鋇中和到？!1為6.8后，離心，上清液經(jīng)市售DOOl樹脂脫色，最后經(jīng)過濃縮、結(jié)晶，得到13C標(biāo)記的葡萄糖。實(shí)施例7一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法，該方法包括以下步驟(1)將畢赤酵母一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基以蒸餾水為溶液，包括以下組分及含量=13C甲醇10mg/L，無氨基酸的酵母氮堿lg/L，生物素10mg/L，磷酸氫二鉀2g/L，115°C滅菌20min，再于37°C，控制轉(zhuǎn)速為200rpm搖瓶培養(yǎng)16h，得到種子液。以10%V/V的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分及含量=CaSO4·2Η200.5g/L，MgSO4·7H2010.9g/L，磷酸氫二鉀53.4g/L，滅菌后用30%的濃氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的PH至4.0-6.0，加入滅菌的甲醇和微量元素，發(fā)酵培養(yǎng)基、甲醇和微量元素的重量比為100301，微量元素包括以下組分及含量=FeSO4·7H2065g/L，MnSO4·H2O3g/L，Na2MoO4·2H200.2g/L,H3BO3O.2g/L,CoCl2O.5g/L,ZnCl220g/L,生物素0.2g/L,CuSO4·5H206g/L，KI0.8g/L，肌醇0.3g/L，煙酰胺0.8g/L，對(duì)氨基苯甲酸0.06g/L，維生素B1O.8mg/L,維生素B2O.02mg/L,控制溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為200rpm搖瓶發(fā)酵24h，升溫至40V，維持3h得到菌體，再控制溫度為0°C，轉(zhuǎn)速為4000rpm離心20min，將菌體用蒸餾水洗滌，繼續(xù)離心20min，控制溫度70°C，采用50wt%乙醇提取菌體5h，得到的提取液經(jīng)10000分子量的納濾膜過濾、市售DOOl樹脂脫色及無水乙醇結(jié)晶步驟，即得到13C海藻糖；(2)將13C海藻糖放入硫酸中于100°0酸解61!，加入碳酸鋇中和到？!1為6.8后，離心，上清液經(jīng)市售DOOl樹脂脫色，最后經(jīng)過濃縮、結(jié)晶，得到13C標(biāo)記的葡萄糖。權(quán)利要求一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)以畢赤酵母作為出發(fā)菌株，13C甲醇作為碳源，經(jīng)發(fā)酵、離心獲得菌體，經(jīng)乙醇溶液提取、脫色、結(jié)晶，獲得13C標(biāo)記的海藻糖；(2)將13C標(biāo)記的海藻糖酸解，然后，中和、脫色、結(jié)晶，獲得13C標(biāo)記的葡萄糖。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟(1)將畢赤酵母一環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，115°C滅菌20min，再于28-37°C，控制轉(zhuǎn)速為150-240rpm搖瓶培養(yǎng)16_24h，得到種子液，以10%V/V的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，滅菌后用30%的濃氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH至4.0-6.0，加入滅菌的甲醇和微量元素，控制溫度為28-37°C，轉(zhuǎn)速為150-240rpm搖瓶發(fā)酵24_48h，升溫至40_50°C，維持0.5_4h得到菌體，再控制溫度為_55°C，轉(zhuǎn)速為4000rpm離心20min，將菌體用蒸餾水洗滌，繼續(xù)離心20min，控制溫度30-90°C，采用30_70wt%乙醇提取菌體0.5_5h，得到的提取液經(jīng)10000分子量的納濾膜過濾、市售DOOl樹脂脫色及無水乙醇結(jié)晶步驟，即得到13C海藻糖；(2)將13C海藻糖放入硫酸中于95-105°C酸解5-8h，加入碳酸鋇中和到pH為6.8-7.0后，離心，上清液經(jīng)市售DOOl樹脂脫色，最后經(jīng)過濃縮、結(jié)晶，得到13C標(biāo)記的葡萄糖。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的種子培養(yǎng)基以蒸餾水為溶液，包括以下組分及含量=13C甲醇，5-30mg/L，無氨基酸的酵母氮堿1-13.4g/L，生物素5-20mg/L，磷酸氫二鉀0.10-3.24g/L。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下組分及含量=CaSO4·2Η200.05-0.93g/L,MgSO4·7Η201.5-14.9g/L，磷酸氫二鉀1-53.4g/L。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的微量元素包括以下組分及含量=FeSO4·7H2065g/L，MnSO4·H2O3g/L，Na2MoO4·2H200.2g/L,H3BO30.2g/L,CoCl2O.5g/L,ZnCl220g/L,生物素0.2g/L,CuSO4·5H206g/L,KI0.8g/L，肌醇0.3g/L，煙酰胺0.8g/L，對(duì)氨基苯甲酸0.06g/L,維生素B1O.8mg/L,維生素B2O.02mg/Lo6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法，其特征在于，所述步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基、甲醇和微量元素的重量比為1000(5-30)(1-10)。全文摘要本發(fā)明涉及一種制備13C標(biāo)記葡萄糖的方法，以畢赤酵母作為出發(fā)菌株，13C甲醇作為碳源，經(jīng)發(fā)酵、離心獲得菌體，經(jīng)乙醇溶液提取、脫色、結(jié)晶，獲得13C標(biāo)記的海藻糖；將13C標(biāo)記的海藻糖酸解，然后，中和、脫色、結(jié)晶，獲得13C標(biāo)記的葡萄糖。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用13C甲醇作為同位素原料，經(jīng)發(fā)酵，將獲得的菌體用乙醇溶液提取、脫色、結(jié)晶獲得13C海藻糖，再經(jīng)酸解，脫色、結(jié)晶，得到豐度和純度大于98％的13C葡萄糖產(chǎn)品，此工藝簡(jiǎn)單，原料來源容易，可獲得高豐度和純度的13C葡萄糖產(chǎn)品。文檔編號(hào)C12P19/02GK101824444SQ201010144928公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年4月9日優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日發(fā)明者任征,劉占峰,李良君,杜曉寧,王偉申請(qǐng)人:上?；ぱ芯吭?