專利名稱：應(yīng)用腫瘤特異性啟動子表達(dá)報告基因來檢測循環(huán)血中腫瘤細(xì)胞的方法和試劑的制作方法
應(yīng)用腫瘤特異性啟動子表達(dá)報告基因來檢測循環(huán)血中腫瘤
細(xì)胞的方法和試劑大多數(shù)癌癥患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞通過循環(huán)系統(tǒng)從原發(fā)部位擴(kuò)散到遠(yuǎn)離部位，并在新的器官中繁殖生長成新的轉(zhuǎn)移瘤(Ecclesand Welch，2007)。據(jù)估計，每克腫瘤組織每天約有106細(xì)胞進(jìn)入血液(Chang et al. ,2000 ；Butler and Gullino，1975)， 不過這其中的大部分很快會清除(Butler and Gullino, 1975 ；Luzzi et al.，1998)。但是，眾所周知，腫瘤細(xì)胞的侵入和轉(zhuǎn)移在早期就會發(fā)生，甚至在癌癥確診前的很多年就會發(fā)生。因此，檢測血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞是癌癥早期診斷的有效方法(Husemarmet al.,
2008；Gray, 2003 ；Kohn and Liotta，1995)。另外，最近一項(xiàng)研究表明手術(shù)前的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)水平與癌癥患者的總存活期存在相關(guān)性，而且術(shù)前術(shù)后循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量的比較可能是治療反應(yīng)的指示劑(Scher et al. ,2009 ；de Bono et al.，2008)。因此，有效的檢測循環(huán)血中腫瘤細(xì)胞不僅有益于癌癥的早期診斷，而且對預(yù)后和治療反應(yīng)很有幫助。目前檢測循環(huán)血中腫瘤細(xì)胞的方法有三種1)檢測上皮細(xì)胞特異性蛋白的免疫測定；幻基于分子測定的檢測腫瘤或上皮細(xì)胞特異性mRNA的PCR方法；幻檢測與癌癥有關(guān)的染色體畸變或基因擴(kuò)增的熒光原位雜交。免疫測定是通過使用固定在磁性顆粒上的抗體來捕獲表達(dá)某些組織、器官或腫瘤特異性抗原的細(xì)胞。由于大多數(shù)實(shí)體瘤來自上皮細(xì)胞源的細(xì)胞，因此在上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)的蛋白(如角蛋白 cytokeratins(19，8，18and 20)和 EpCam(Litvinov et al.， 1994))已經(jīng)被用作區(qū)分上皮細(xì)胞病和有核血細(xì)胞的生物標(biāo)志物。但是，這個方法可能會導(dǎo)致一些假陽性或假陰性結(jié)果。第一，因?yàn)槿肭值哪[瘤細(xì)胞因上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變， 而丟失原有的上皮抗原，這將導(dǎo)致假陰性結(jié)果(ffillipinski-Stapelfeldt et al. ,2005 ； Went et al.，2004)。第二，非腫瘤上皮細(xì)胞可能會存在于血液中，或者抗體可能會非特異性地與血細(xì)胞結(jié)合，這將導(dǎo)致假陽性結(jié)果。據(jù)估計，在正常對照中，約0% -20%的角蛋白 cytokeratin陽性細(xì)胞是白細(xì)胞(Goeminne etal. ,2000)。同時用血細(xì)胞特異性的抗體(如 CD45)對染可能會減少假陽性?？蛊鞴偬禺愋詷?biāo)志物的抗體，如前列腺特異抗原(PSA)，癌胚抗原(CEA)，mucin-l (MUC-I)，表皮生長因子受體(EGFR)，癌胚蛋白(AFP)，HER-2，也被用來檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞，不過由于不是所有的腫瘤細(xì)胞都表達(dá)那些生物標(biāo)志物，所以經(jīng)常會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。但是此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以用別的方法，如形態(tài)學(xué)、mRNA或基因擴(kuò)增測定， 來富集和分析磁性顆粒捕獲的循環(huán)血腫瘤細(xì)胞。循環(huán)血腫瘤細(xì)胞也可以通過其物理特性 (如大小和密度)富集。大部分血白細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)的大小是8 llum， 而乳腺癌患者血液中腫瘤細(xì)胞的平均直徑是四 35um(Meng et al.，2004)。使用熒光原位雜交(FISH)，比較基因組雜交(CGH)和突變分析等染色體組學(xué)分析可以進(jìn)一步證明癌癥是相關(guān)的染色體畸變、基因擴(kuò)增、突變的存在(Swermenhuis et al. ,2009 ；Leversha et al. ,2009) 但是這些方法通常費(fèi)用昂貴，而且耗時。反轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)，尤其是實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄PCR，是一種敏感的、實(shí)際的，用來檢測某些組織或器官(如上面提及的上皮細(xì)胞和器官特異性蛋白)的mRNAs特異性的方法(Kitago et al.，
2009； Iakovlevet al.，2008)。此方法可以與免疫測定法結(jié)合使用。例如，與免疫磁珠富集的循環(huán)血腫瘤細(xì)胞可以被進(jìn)一步分析它們的組織或腫瘤特異性mRNAs的含量。雖然PCR方法在檢測信號方面靈敏度高，但是需要采取嚴(yán)格的控制，避免過程中可能會產(chǎn)生的污染。由于缺乏高腫瘤特異性分子，免疫測定法和定量反轉(zhuǎn)錄PCR法的應(yīng)用受到限制， 因此測定循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的存在需要分析多種分子標(biāo)志物。我們研發(fā)出一種新的檢測血標(biāo)本和骨髓標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞的方法。此方法使用由組織或腫瘤特異性啟動子驅(qū)使報告基因表達(dá)，達(dá)到腫瘤細(xì)胞的檢測目的。由報告基因驅(qū)使的腫瘤特異性啟動子的表達(dá)盒被轉(zhuǎn)染到血標(biāo)本和骨髓標(biāo)本中有核細(xì)胞中。然后培養(yǎng)細(xì)胞 12-48小時。隨后用不同的方法和試劑檢測報告基因的表達(dá)。表達(dá)盒運(yùn)載所用的載體會在腫瘤細(xì)胞中，而不是在有核血細(xì)胞中有選擇性地擴(kuò)增或表達(dá)，所以檢測出的信號對腫瘤細(xì)胞的特異性更高?；谒玫姆椒ê陀脕頇z測報告基因的信號強(qiáng)度可以測定血標(biāo)本和骨髓標(biāo)本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。此方法可靠，簡單，在檢測血標(biāo)本和骨髓標(biāo)本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞方面特異性高，并且對癌癥患者的早期診斷，治療反應(yīng)的預(yù)測及其預(yù)后非常有益。可用于此目的的報告基因包括編碼各種熒光蛋白(如綠色、紅色、藍(lán)色、黃色、 紫色熒光蛋白)的基因，螢火蟲熒光素酶基因，海腎熒光素酶基因，細(xì)菌半乳糖苷酶 (LacZ)基因等。上述報告基因的表達(dá)可以由不同的方法檢測。熒光蛋白的表達(dá)可以由熒光顯微鏡和熒光激活流式細(xì)胞分析法(FACQ檢測。觀察熒光顯微鏡下的細(xì)胞可以對細(xì)胞的大小和形狀進(jìn)行分析，這可能有益于進(jìn)一步區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。熒光激活流式細(xì)胞分析法可以富集熒光陽性細(xì)胞，并進(jìn)一步采用傳統(tǒng)方法驗(yàn)證，如用免疫測定法和PCR測定法，進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞。生物發(fā)光測定法可以檢測螢火蟲熒光素酶基因，海腎熒光素酶基因，細(xì)菌半乳糖苷酶(LacZ)基因的表達(dá)。啟動子是調(diào)控細(xì)胞表達(dá)的順式序列。有些啟動子不論其組織類型，生物種類，發(fā)育階段，在大多數(shù)細(xì)胞中有活性。這種啟動子叫做泛在啟動子 (ubiquitous promoter)，如巨細(xì)胞病毒早期啟動子(CMV)，勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)序列 (RSV)，SV40病毒啟動子，PGK和EFl α啟動子。有些啟動子僅在某些類型的細(xì)胞中有活性。 例如，白蛋白啟動子主要在肝細(xì)胞中有活性，probasin和前列腺特異性抗原啟動子在前列腺組織中有活性。有些基因只在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是腫瘤特異性的。但是， 盡管可能這些啟動子在腫瘤細(xì)胞中的活性比在正常細(xì)胞中的活性高一些，大多數(shù)啟動子是組織或細(xì)胞型特異性的，而不是腫瘤特異性的。它們僅在一些腫瘤細(xì)胞中有活性。如肝癌的甲胎蛋白α，前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA)，胃癌的癌胚抗原(CEA)就是這樣的例子。酪氨酸酶啟動子在黑色素瘤中有活性，mucin-1啟動子在粘膜細(xì)胞中有活性。相反，人 survivin基因，端粒體反轉(zhuǎn)錄酶基因(TERT)，midkine基因在很多種癌癥中有活性。組織或腫瘤特異性啟動子已經(jīng)被用來在一些細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中的基因特異性表達(dá)。例如，這些啟動子已經(jīng)被用于癌癥基因療法中治療基因的腫瘤特異性表達(dá)。有時這些啟動子也用于轉(zhuǎn)基因動物，控制某些特定組織中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。端粒酶是一種特別的反轉(zhuǎn)錄酶，它負(fù)責(zé)染色體末端或端粒的復(fù)制(Morin，1989 ； Blackburn, 1992)。它在永生化細(xì)胞系和85 %人癌細(xì)胞中活性很高，但是在分化的正常人體細(xì)胞中是沉默的(Kim et al.，1994 ；Counter etal.，1992 ；Shay and Bacchetti，1997)。 越來越多的事實(shí)表明端粒體反轉(zhuǎn)錄酶催化亞基基因(TERT)在活化端粒酶方面扮演重要角色，并且端粒體反轉(zhuǎn)錄酶基因在原發(fā)性腫瘤細(xì)胞、多種癌細(xì)胞系和端粒酶陽性細(xì)胞中的基因表達(dá)水平很高(Nakamura et al. , 1997 ；Nakayama et al. , 1998 ；Meyerson et al., 1997)。因此，人端粒體反轉(zhuǎn)錄酶基因啟動子可以作為廣泛適用的腫瘤特異性啟動子。體外研究表明人端粒體反轉(zhuǎn)錄酶基因啟動子在人和鼠的肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、 腦癌的癌細(xì)胞中活性很高(Gu et al. ,2000 ；Gu et al. ,2002a ；Gu et al. ,2002b ；Huang et al.，2002 ；Lin et al. ,2002a ；Lin etal.，2002b)，在正常人纖維母細(xì)胞中(Gu et al.， 2000)、正常人氣管(Gu et al.，2000)、乳房(Lin et al.，2002b)、卵巢(Huang et al.， 2002)的上皮細(xì)胞中、正常人原代肝細(xì)胞中(Lin et al.，200 )、正常人⑶34+祖細(xì)胞中 (Gu et al.，200 )、正常鼠纖維母細(xì)胞(Gu et al. ,2002a)中沒有活性。端粒酶啟動子也被用來控制條件復(fù)制型病毒(包括溶瘤腺病毒)所需的病毒基因表達(dá)(Daviset al.，2006 ； Huang et al. ,2004 ；Irving et al.，2004)。端粒酶特異性溶瘤腺病毒可在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，于是會增加報告基因的拷貝量或表達(dá)水平，增加檢測信號。通常組織特異啟動子的活性較弱。為了提高啟動子的轉(zhuǎn)錄激活性，同時保留其細(xì)胞特異性，研究者可以通過組合不同啟動子的序列來設(shè)計啟動子，從而形成混合型或嵌合型的啟動子。使用最為廣泛的是CAG啟動子，它是結(jié)合了巨細(xì)胞病毒早期基因的增強(qiáng)子，雞肌動蛋白基因啟動子和兔子球蛋白基因剪接受體序列。這種混合型的啟動子通過一些病毒或非病毒載體，驅(qū)使了許多基因在各種組織中的高表達(dá)。巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子的另一個運(yùn)用是結(jié)合了組織特異啟動子以加強(qiáng)目的基因的組織特異性的表達(dá)。例如，把巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子加入到端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子中，將會加強(qiáng)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子的活性并且保留它的特異性。我們使用的基因工程的啟動子包括端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子序列和巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子，用于驅(qū)使報告基因的表達(dá)。甚至是任何一種的組織和腫瘤特異性啟動子，或者是他們的嵌合型啟動子都能被用來代替端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶/巨細(xì)胞病毒嵌合啟動子。組織或腫瘤特異性啟動子的活性也可以通過二元表達(dá)系統(tǒng)來加強(qiáng)，其中的弱腫瘤特異性啟動子被用來表達(dá)強(qiáng)活性轉(zhuǎn)錄因子，例如GAL4-VP16融合蛋白，該轉(zhuǎn)錄因子接著啟動第二個啟動子來驅(qū)使目的基因表達(dá)。這種方法可以在不減少啟動子特異性的情況下，增加弱腫瘤特異性啟動子活性，有時可超過100多倍(Koch et al 2001)。GAL4-VP16體系已經(jīng)成功地用于增強(qiáng)癌胚抗原和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子的活性。這些二元體系也將提高報道基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，有助于檢驗(yàn)循環(huán)血中腫瘤細(xì)胞。啟動子，基因和多聚腺苷酸信號序列，這三個要素是報告基因和其他任何靶基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)成功的必要因素。這三個部分在單一 DNA片段中順序排列叫做“表達(dá)盒”。多聚腺苷酸信號序列對組織細(xì)胞通常是非特異性的。因此，理論上來說，來自于任何基因的多聚腺苷酸信號序列都可用在表達(dá)盒中。通常使用的多聚腺苷酸信號序列來自于牛生長素基因，猿猴病毒40大T抗原基因，球蛋白基因和一些病毒基因。一個表達(dá)盒通常會和一個載體DNA連在一起，轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，用于基因表達(dá)，例如在循環(huán)血腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。一個能被用來轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用于表達(dá)核酸序列的載體核酸分子，被稱之為載體。載體包括質(zhì)粒，粘粒(cosmid)，病毒(噬菌體，動物病毒，植物病毒)和人工染色體，例如酵母人工染色體。表達(dá)盒能通過標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)克隆到載體。質(zhì)粒能通過不同的方法轉(zhuǎn)染到哺乳動物的細(xì)胞，例如，物理性的電穿孔法，和化學(xué)性的類脂和轉(zhuǎn)染試劑。質(zhì)粒，粘粒和人工染色體屬于非病毒載體。某些病毒通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有效地轉(zhuǎn)染或者進(jìn)入細(xì)胞，并表達(dá)報告基因，這使得它們成為了轉(zhuǎn)移外來核酸進(jìn)入細(xì)胞(例如哺乳動物的細(xì)胞)的常用載體。用來轉(zhuǎn)染報告基因或者其他任何基因進(jìn)入細(xì)胞的病毒叫做病毒載體。通常使用的病毒載體來自腺病毒，腺相關(guān)病毒(AAV)，逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒(特定類型)，牛痘病毒，巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒等。有些病毒載體只能在包裝(制備)細(xì)胞中復(fù)制，并不能在其它靶細(xì)胞中復(fù)制。這些病毒稱為復(fù)制缺陷型載體。大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，和El缺失腺病毒載體都屬于有復(fù)制缺陷型載體。有些病毒載體，能夠在某些種類的靶細(xì)胞中復(fù)制， 但是不能在其他種類的細(xì)胞中復(fù)制。他們被稱為有條件復(fù)制能力的載體。舉例來說，溶瘤病毒能夠在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，但不能在其他正常的細(xì)胞中復(fù)制。溶瘤病毒之所以有這種細(xì)胞特異性復(fù)制能力，是因?yàn)橐恍┎《净虬l(fā)生突變，或腫瘤特異性啟動子取代了病毒啟動子， 從而使一些病毒復(fù)制必需基因只能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。用端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子代替腺病毒El啟動子，能導(dǎo)致溶瘤腺病毒在具有高端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性的癌細(xì)胞中復(fù)制(Davis et al. ,2006 ；Huang et al. ,2004 ；Irving et al.，2004)。復(fù)制缺陷型和條件復(fù)制型病毒載體，只要它們帶有一個被腫瘤特異性啟動子驅(qū)使的報告基因，就能夠被用于循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的檢驗(yàn)。有些病毒載體被進(jìn)一步進(jìn)行了修改，改變了其表面的蛋白，使其具有靶向性和轉(zhuǎn)染某些特定的細(xì)胞。更改病毒細(xì)胞表面蛋白，能加強(qiáng)它們在一些腫瘤細(xì)胞中的傳染性。例如，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列能夠和腺病毒纖維蛋白整合在一起，因此，腺病毒可以不通過腺病毒受體來傳染細(xì)胞(Wiclcham 2000)。這些被更改過的載體能有效地檢驗(yàn)循環(huán)血腫瘤細(xì)胞和低腺病毒受體水平的細(xì)胞。為了通過對報告基因的表達(dá)的分析，來檢驗(yàn)循環(huán)血腫瘤細(xì)胞，報告基因應(yīng)該僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，或者在被檢驗(yàn)的細(xì)胞中表達(dá)，而不能在正常的血細(xì)胞中表達(dá)。例如不能在中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和血小板中表達(dá)。兩種方法可以用來實(shí)現(xiàn)這種選擇性報告基因的表達(dá)，1)定向性的基因轉(zhuǎn)染和2、選擇性基因的表達(dá)。定向性的基因轉(zhuǎn)染是通過選擇特定類型的載體和轉(zhuǎn)染方法來實(shí)現(xiàn)的，所以載體只能進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，上皮細(xì)胞和被檢驗(yàn)的細(xì)胞。一些病毒載體就具有此類細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)染能力。舉例來說，腺病毒通常不會感染白血細(xì)胞，因此，報告基因不會進(jìn)入白血細(xì)胞。當(dāng)分析報告基因表達(dá)時，這些細(xì)胞會保持陰性。選擇性基因表達(dá)能通過使用腫瘤啟動子或者特定細(xì)胞類型啟動子來實(shí)現(xiàn)。因此，即使報告基因被轉(zhuǎn)染到正常的血細(xì)胞中，其也不會被表達(dá)，并且，正常血細(xì)胞會保持陰性。腫瘤細(xì)胞，上皮細(xì)胞的特定啟動子就可用于報告基因在腫瘤細(xì)胞或上皮細(xì)胞中表達(dá)，而不在血細(xì)胞中表達(dá)。例如端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子，生存素啟動子，probasin啟動子，MUCl啟動子，癌胚抗原啟動子，甲胎蛋白啟動子，酪氨酸酶啟動子，和其嵌合性的啟動子都可用于此目的。通過腫瘤和組織特異性啟動子驅(qū)動的報告基因的表達(dá)，來檢驗(yàn)循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的方法包括以下一些步驟，每一步驟應(yīng)該采取保護(hù)措施來防止樣本污染和保持樣本無菌。1.用抗凝血劑采集血液樣本(5毫升-10毫升)，放入無菌管中。通常使用的抗凝血劑是乙二胺四乙酸和肝素。任何抗凝血劑，只要可以防止血液凝固的都可以使用，只要他們不會對以后的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生副作用。2.對血液樣本進(jìn)行處理，除去紅細(xì)胞。這可以通過梯度離心分離法，穿過聚蔗糖的方案解決，或用75-200毫摩爾氯化銨來溶解紅細(xì)胞等，包括用其他藥劑來減少對有核細(xì)胞的危害?？芍貜?fù)溶解的過程以達(dá)到紅細(xì)胞的完全溶解。用此兩種方法分離的有核細(xì)胞應(yīng)該用磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ或培養(yǎng)基清洗2-3次。3.用攜帶有腫瘤或者組織特異性啟動子驅(qū)動的報告基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，接著將細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)時間取決于所用的表達(dá)載體和所用的報告基因表達(dá)和檢測方法。有時，基因轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)可同時進(jìn)行。4.任何用于培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)基都可用于此項(xiàng)用途。例如RPMI-1640， MEM, DMEM等培養(yǎng)基。培養(yǎng)基常常會被補(bǔ)充以5%-20%胎牛血清或小牛血清。培養(yǎng)基還可以補(bǔ)充以抗生素，如氨芐青霉素(50-200單位/毫升)和/或鏈霉素(50-200微克/毫升)。培養(yǎng)基能夠被直接添加到含表達(dá)載體的溶液中。細(xì)胞被置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜， 或24-48小時。5.分析檢測細(xì)胞樣本中表達(dá)報告基因的細(xì)胞。取決于報告基因的性質(zhì)，用不同分析方法檢測表達(dá)報告基因的細(xì)胞。對于熒光蛋白，熒光顯微鏡，熒光激活流式細(xì)胞分析儀可用于檢測表達(dá)熒光蛋白的陽性細(xì)胞。對熒光素酶和半乳糖苷酶檢測，可使用生物發(fā)光和酶活性測定。至關(guān)重要的是，在正常值建立之前，對照組應(yīng)該包括在測定中。陽性對照樣品和陰性對樣品都應(yīng)在測試開始時就使用。具體地，本發(fā)明提供下列技術(shù)方案在一個方面中，本發(fā)明提供一種腫瘤特異性啟動子，其在腫瘤細(xì)胞中的活性比其在正常細(xì)胞中的活性要高。在第一方面的一個實(shí)施方案中，所述腫瘤特異性啟動子包括人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子，survivin啟動子，medkine啟動子，癌胚抗原啟動子，MUC-I啟動子和probasin基因啟動子。在第一方面的一個實(shí)施方案中，所述端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子序列如SEQ ID NO :1所顯示。在第一個方面的一個實(shí)施方案中，所述腫瘤特異性啟動子可以是組織或者細(xì)胞型特異性基因的原啟動子，也可以是經(jīng)改造的組合啟動子。在第一個方面的一個實(shí)施方案中，所述所述組合啟動子是含有源自組織或細(xì)胞型特異性啟動子的序列和源自其他啟動子的增強(qiáng)子的嵌合型啟動子。在第一方面的一個實(shí)施方案中，所述嵌合型啟動子是TC嵌合啟動子，其包含人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子和巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子。在第一個方面的一個實(shí)施方案中，其中所述嵌合啟動子序列如SEQ IDNO :8所顯示。在第二個方面中，本發(fā)明提供一種載體，其是包括由第一方面的腫瘤特異性啟動子驅(qū)使表達(dá)的報告基因基因表達(dá)載體。在第二個方面的一個實(shí)施方案中，其中提及的報告基因是一種通常作為啟動子活性指示劑的基因。在第二個方面的一個實(shí)施方案中，其中所述報告基因包括熒光蛋白(綠色，紅色，黃色和藍(lán)色熒光蛋白)的基因，螢火蟲熒光素酶基因，海腎熒光素酶基因，細(xì)菌半乳糖苷酶(LacZ)基因。在第二個方面的一個實(shí)施方案中，其中所述基因表達(dá)載體指任何一種用于基因轉(zhuǎn)染的載體。在第二個方面的一個實(shí)施方案中，其中所述基因表達(dá)載體包括質(zhì)粒，質(zhì)粒/脂質(zhì)復(fù)合物以及病毒載體。在第二個方面的一個實(shí)施方案中，其中提及的病毒載體是指復(fù)制缺陷型病毒載體和可復(fù)制型病毒載體，例如腺病毒載體，可復(fù)制型腺病毒載體，皰疹病毒載體，牛痘病毒載體等。在第二方面的一個實(shí)施方案中，所述腺病毒載體是第5型人腺病毒。本發(fā)明提及的腺病毒載體是在穩(wěn)定腺病毒載體活性的緩沖液中配制的。緩沖液含Tris，NaCl, EDTA，乙醇，組氨酸，蔗糖。在第二個方面的一個實(shí)施方案中，其中所述病毒載體是經(jīng)過病毒纖維改進(jìn)后的。在第二個方面的一個實(shí)施方案中，其中所述病毒纖維改進(jìn)是通過將編碼精氨酸-甘油酸-天冬氨酸(RGD)序列插入到位于圖距單位86-91的腺病毒基因組中，從而使病毒纖維蛋白含RGD序列，改變其受體特異性，改進(jìn)后的載體可經(jīng)整合素蛋白進(jìn)入靶細(xì)胞。在第二個方面的一個實(shí)施方案中，其中組織或腫瘤特異性啟動子的活性通過二元表達(dá)系統(tǒng)來加強(qiáng)。 在第二個方面的一個實(shí)施方案中，所述二元表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用綠色熒光蛋白/TRAIL融合基因。 在第二個方面的一個實(shí)施方案中，所述綠色熒光蛋白/TRAIL融合基因如SEQ ID NO :5所顯示。在第二個方面的一個實(shí)施方案中，其中提及的基因表達(dá)載體包括可復(fù)制型腺病毒載體 Ad/El-GFP 和 Ad/El-GFP-RGD，復(fù)制缺陷型腺病毒載體 Ad/TERT_GFP，Ad/TERT-LacZ, Ad/ GFP-TRAIL 和 Ad/TERT-Luciferase。在第三個方面中，本發(fā)明提供一種試劑盒，其用于癌癥患者的早期診斷，治療反應(yīng)的預(yù)測及其預(yù)后，其包含第一方面的腫瘤特異性啟動子和/或第二個方面的載體。在第三個方面中的一個實(shí)施方案中，所述試劑盒用于檢測血標(biāo)本和骨髓標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞。在第四個方面中，本發(fā)明提供一種診斷劑，其用于癌癥患者的早期診斷，治療反應(yīng)的預(yù)測及其預(yù)后，包含第一方面的腫瘤特異性啟動子和第二個方面的載體。在第四個方面的一個實(shí)施方案中，所述診斷劑用于檢測血標(biāo)本和骨髓標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞。在第五個方面中，本發(fā)明提供第一方面的腫瘤特異性啟動子用于制備第二個方面的載體以及第三方面的試劑盒和第四方面的診斷劑的應(yīng)用。


圖1，比較LacZ基因在正常細(xì)胞(NHBE，NHLF，⑶;34+)，正常組織(脾和肝)及癌細(xì)胞(H1299，AM9，UV-2237M)中的表達(dá)。細(xì)胞或小鼠用相同劑量的腺病毒載體(Ad/CMV_GFP， Ad/CMV-LacZ, Ad/hTERT-LacZ))轉(zhuǎn)染。用Χ-gal染色法檢測LacZ基因(β -半乳糖苷酶) 活性。陽性細(xì)胞為藍(lán)色。細(xì)胞名稱列于左側(cè)。上方為所用載體，右方提示細(xì)胞(組織)屬性，正?；虬┘?xì)胞。圖2，癌細(xì)胞(HU99，A549，L0V0，DLD1)和正常細(xì)胞(OKM+，NHFB，NHBE)用相同劑量的腺病毒載體(Ad/CMV-GFP，Ad/CMV-LadZ，Ad/hTERT-LacZ)轉(zhuǎn)染后，用發(fā)光法分析β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶活性用相對光強(qiáng)度(relative light units (RLU) / μ g蛋白)表示。所示值為三次分析的均值+標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。圖3.由腺病毒載體Ad/hTERT-gBax介導(dǎo)的GFP-Bax融合基因在腫瘤中的特異表達(dá)。左側(cè)，腫瘤細(xì)胞(H1299，AM9，H322，H358)和正常成纖維細(xì)胞(NHFB)用相同劑量的Ad/ CMV-GFP或Ad/TERT-GFP/Bax (2000病毒顆粒/細(xì)胞)轉(zhuǎn)染，48小時后在熒光顯微鏡下觀察 GFP或GFP/Bax的表達(dá)。CMV驅(qū)動的GFP在所有細(xì)胞中都表達(dá)，而TERT驅(qū)動的GFP-Bax僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而不在NHFB中表達(dá)。右側(cè)，帶瘤小鼠用Ad/CMV-GFP或Ad/TERT_GFP/ Bax治療后腫瘤和肝GFP和GFP-Bax，Bax的表達(dá)。Bax表達(dá)用免疫組化法檢測。細(xì)胞調(diào)亡用TUNEL法檢測。GFP-Bax和Bax僅在腫瘤中表達(dá)并引起調(diào)亡，但不在正常肝組織中表達(dá)。圖4.上方，腺病毒載體Ad/gTRAIL示意圖.腺病毒El區(qū)(map unit 1. 3-9. 3)被由GT啟動子表達(dá)GFP/TRAIL的表達(dá)盒和由TERT啟動子表達(dá)Gal4/GV16的表達(dá)盒取代。下方，腫瘤細(xì)胞(DLD-I)和正常細(xì)胞(NHFB)用相同劑量的Ad/CMV-GFP或Ad/gTRAIL轉(zhuǎn)染，48 小時后觀察GFP或GFP-TRAIL的表達(dá)及細(xì)胞狀態(tài)。GFP-TRAIL僅在DLDl細(xì)胞中表達(dá)并殺死細(xì)胞。圖5。TERT/CMV(TC)融合啟動子示意圖。本圖含TC-GFP表達(dá)盒。TC啟動子序列見SEQ ID NO:8。圖6，條件復(fù)制型腺病毒(Ad/GFP-El)示意圖(上方)及其El基因在正常細(xì)胞 (NHFB)和腫瘤細(xì)胞(MiaPaca2, H1299, DLD1)中的表達(dá)。Ad/GFP-El由TC啟動子驅(qū)動GFP 和El。El蛋白表達(dá)用蛋白印跡法(Western blot)檢測。圖7。條件復(fù)制型腺病毒(Ad/ GFP-E1)攜帶的GFP基因在腫瘤細(xì)胞(HU99)和正常細(xì)胞(NHFB)中的表達(dá)(左側(cè))，圖上方為轉(zhuǎn)染劑量。右側(cè)，條件復(fù)制型腺病毒(Ad/GFP-El)攜帶的GFP基因在實(shí)體腫瘤中的表達(dá)。圖8，纖維蛋白修飾后的條件復(fù)制型腺病毒(Ad/GFP-El-RGD)。上方，病毒載體示意圖，與圖6所示相同，由TC啟動子驅(qū)動GFP和E1。但病毒的纖維蛋白含RGD序列。下方，比較Ad/CMV-GFP，Ad/GFP-El, Ad/GFP-El-RGD在實(shí)體瘤中的表達(dá)。將病毒載體注射到實(shí)體瘤中，兩周后觀察GFP表達(dá)。Ad/GFP因不能在腫瘤中復(fù)制，隨腫瘤增長而表達(dá)消失。 Ad/GFP-El, Ad/GFP-El-RGD均有GFP在腫瘤中表達(dá)，而不在周圍正常細(xì)胞中表達(dá)。但Ad/ GFP-El-RGD的GFP表達(dá)更高。圖9，正常血樣，加腫瘤細(xì)胞(上方)與不加腫瘤細(xì)胞(下方)，分別用Ad/GFP-El， 和Ad/GFP-El-RGD轉(zhuǎn)染，24小時后在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)。GFP陽性細(xì)胞僅在加腫瘤細(xì)胞的血樣中，而不在無腫瘤細(xì)胞的血樣中。圖10。比較正常人(normal)與腫瘤(肺癌)患者的血樣。各取5毫升血，分離白細(xì)胞，并用Ad/GFP-El轉(zhuǎn)染白細(xì)胞二4小時后在鏡下觀察細(xì)胞。左側(cè)，熒光鏡(黑白照)，右側(cè)，普通鏡，但相通視野。正常血樣中無GFP陽性細(xì)胞，而肺癌患者血中則有GFP陽性細(xì)胞 (腫瘤細(xì)胞)。圖11是Ad/CMV-LacZ的圖譜。第5型人腺病毒的El基因G56bp-322m3p，圖譜單位1.3-9. 3)被刪除，并在該區(qū)域插入一基因表達(dá)盒(如圖所示).AD/TERT-LacZ的表達(dá)盒含有TERT啟動子，LacZ基因(LacZ)和牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpA)。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。圖12是Ad/TERT-LacZ的圖譜。第5型人腺病毒的El基因056bp-3228bp，圖譜單位1.3-9. 3)被刪除，并在該區(qū)域插入一基因表達(dá)盒(如圖所示).AD/TERT-LacZ的表達(dá)盒含有TERT啟動子，LacZ基因(LacZ)和牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpA)。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。圖13是Ad/TERT-Bax的圖譜。第5型人腺病毒的El基因056bp-3228bp，圖譜單位1. 3-9. 3)被刪除，并在該區(qū)域插入雙基因表達(dá)盒(如圖所示).AD/TERT-Bax的雙表達(dá)盒含有TERT啟動子，TetR-GV16基因(TetR_GV16)，牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpA)， TRE 啟動子，GFP/Bax 基因(GFP/Bax)，和 SV40 多聚 A 信號序列(sv40polyA)。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。TERT =人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動子TRE =四環(huán)素反應(yīng)因子啟動子TetR =四環(huán)素抑制蛋白圖14是Ad/TERT-gTRAIL的圖譜。第5型人腺病毒的El基因056bp-3228bp，圖譜單位1.3-9. 3)被刪除，并在該區(qū)域插入雙基因表達(dá)盒(如圖所示).AD/TERT-gTRAIL的雙表達(dá)盒含有TERT啟動子，GAL4-GV16基因(GAL4-GV16)，牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpA)，GT 啟動子，GFP/TRAIL 基因(GFP-TRAIL)，禾口 SV40 多聚 A 信號序列(sv40polyA)。TERT =人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動子GT = GT 啟動子，含 GAL4/TATA 序列第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。圖15是Ad/GFP-El的圖譜。第5型人腺病毒的El基因啟動子(45 - ,圖譜單位1.3-1。5)被刪除，并在該區(qū)域插入一基因表達(dá)盒(如圖所示).AD/GFP-E1的表達(dá)盒含有TC啟動子，GFP基因(GFP)，牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpolyA)。接著又是TC啟動子，并由它控制El基因的表達(dá)。TC = TC啟動子，含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動子和CMV增強(qiáng)子序列。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。圖16是AD/CMV-GFP的圖譜。第5型人腺病毒的El基因G56bp-322m3p，圖譜單位1.3-9. 3)被刪除，并在該區(qū)域插入一基因表達(dá)盒(如圖所示).AD/CMV-GFP的表達(dá)盒含有CMV啟動子，綠色熒光蛋白基因(GFP)和牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpA)。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方圖17是Ad/GFP-El-R⑶的圖譜。第5型人腺病毒的El基因啟動子(45 - , 圖譜單位1.3-1。5)被刪除，并在該區(qū)域插入一基因表達(dá)盒(如上圖所示).AD/GFP-E1-RGD 的表達(dá)盒含有TC啟動子，GFP基因(GFP)，牛生長素基因的多聚A信號序列(BGHpolyA)。接著又是TC啟動子，并由它控制El基因的表達(dá)。本載體的病毒纖維蛋白被改進(jìn)，含RGD序列。TC = TC啟動子，含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因啟動子和CMV增強(qiáng)子序列RGD = Arg-Gly-Asp氨基酸序列，它被插入到圖譜單位約86-91的腺病毒纖維蛋白基因中，這使表達(dá)的纖維蛋白含⑶CRGDCFC氨基酸序列。第5型人腺病毒的圖譜單位顯示在圖的上方。本發(fā)明將通過下列具體實(shí)施方式
進(jìn)一步舉例說明，但需要注意的是本發(fā)明并不限于所述實(shí)施例。本發(fā)明的范圍僅由后附的權(quán)利要求限定。
實(shí)施例材料與方法本發(fā)明所用的具體的腺病毒載體為第5型人腺病毒(human adenovirustype 5)， 構(gòu)建腺病毒載體的質(zhì)粒可以購自Stratagene公司(http://www. stratagene. com/lit/ vector, aspx) (catalog#240010)或 CellBiolabs, Inc.公司(http://www. cellbiolabs. com)(catalog#VPK-250)。下述實(shí)施例中所述的腺病毒載體(構(gòu)建腺病毒載體的質(zhì)粒來自Mratagene 公司，catalog#240010)構(gòu)建方法與文獻(xiàn)報道相同，(見文獻(xiàn)FangB，Eisensmith RC, Li XHC, Finegold MJ, Shedlovsky A, Dove W, Woo SLC. Gene Therapy for Phenylketonuria :phenotypic correction in a geneticallydficient mouse model by adenovirus-mediated hepatic gene transfer. GeneTherapy 1; 1994)。 一般先用分子克隆技術(shù)將目的基因的表達(dá)盒，如TERT-GFP，插入到一穿梭質(zhì)粒中(shuttle plasmid)。使該表達(dá)盒的倆端分別含有一小段來自重組腺病毒的DNA序列。再將穿梭質(zhì)粒和另一含有幾乎全部或極大部分重組腺病毒載體序列的質(zhì)粒(如PJM17，pBHGlO)，共轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 2周。穿梭質(zhì)粒與PJM17或pBHGlO會在四3細(xì)胞中發(fā)生同源重組，形成重組的腺病毒載體。再用多聚酶鏈反應(yīng)法或檢測目的基因表達(dá)的方法來檢測所得到腺病毒是否是所需要的重組腺病毒載體。最后，提取腺病毒的DNA進(jìn)行序列分析，進(jìn)一步驗(yàn)證重組腺病毒載體重組部位的序列。實(shí)施例1.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子(端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)驅(qū)動腫瘤特異性報告基因 LacZ的表達(dá)。圖1顯示，比較人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子和巨細(xì)胞病毒啟動子驅(qū)動報告基因 LacZ的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)中，我們用載有378bp長的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核心啟動子(SEQID NO 1)驅(qū)動的LacZ基因(SEQ ID NO 2)的復(fù)制缺陷型人腺病毒載體(Ad/TERT-LacZ)(該載體是經(jīng)重組DNA技術(shù)而構(gòu)建(Gu et al,2000)構(gòu)建的載體圖譜見圖12)感染(具體的感染方法見Gu J et al,2000)正?；蚰[瘤細(xì)胞。將載有CMV啟動子(SEQ ID NO 9)驅(qū)動的LacZ 基因的腺病毒載體(Ad/CMV-LacZ)(其構(gòu)建方法見Gu et al，2000，啟動子、LacZ基因在載體上的排列見所附載體圖譜圖11)用作陽性對照。病毒感染單位為1000顆粒/細(xì)胞。培養(yǎng)的人體肺癌細(xì)胞株(H1299和A549)，小鼠纖維肉瘤細(xì)胞(UV-2237)，正常的人體成纖維細(xì)胞(NHLF)，⑶34+間質(zhì)主細(xì)胞，正常的人體支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)(購自American Type CultureCollection或Clonetics Corp (San Diego, CA)，用相同劑量的腺病毒顆粒感染細(xì)胞M小時后，用X-gal染色法分析半乳糖苷酶活性(具體方法見Gu J etal，2000)。X-gal 染色法分析顯示，在所有癌細(xì)胞株中，CMV啟動子和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子都能驅(qū)動較強(qiáng)的 β -半乳糖苷酶表達(dá)。而在兩個正常的細(xì)胞株里，只有感染了 Ad/CMV-LacZ病毒的細(xì)胞產(chǎn)生了高水平的LacZ基因表達(dá)(將近100% )(圖1)。用同樣藥劑量的Ad/TERT-LacZ病毒感染的正常細(xì)胞僅僅產(chǎn)生了非常少的LacZ-陽性細(xì)胞。在所有細(xì)胞的檢測中，在癌細(xì)胞里的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子的活性顯著高于在正常細(xì)胞中的(P ^ 0. 05)。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在對小鼠的實(shí)驗(yàn)中。將^clOici腺病毒載體注入小鼠尾靜脈，兩天后將小鼠處死，并取各器官進(jìn)行半乳糖苷酶活性分析。注射生理鹽水的小鼠用作背景對照品。在注射Ad/CMV-LacZ病毒的小鼠肝臟和脾臟里檢測(具體方法見Gu J et al, 2000)到了高水平的β-半乳糖苷酶活性。在用Ad/CMV-LacZ病毒處理的小鼠的其他器官里，酶的活性和背景對照品(即注射生理鹽水的小鼠)保持一致。在對比后可發(fā)現(xiàn)，在注入 Ad/TERT-LacZ的小鼠肝臟，脾臟和其他小鼠的器官中的酶的活性，都在背景對照品所見的范圍之內(nèi)。說明Ad/TERT-LacZ的報道基因表達(dá)與經(jīng)磷酸鹽緩沖液，對照載體處理的小鼠相同。(結(jié)果詳見圖1)實(shí)施例2.端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子和巨細(xì)胞病毒啟動子活性的比對用磷酸鹽緩沖液，對照載體(Ad/CMV-GFP)(構(gòu)建方法見Gu et al. ,2000.載體圖譜見附圖16),Ad/TERT-LacZ(圖12)或Ad/CMV-LacZ.(圖11)轉(zhuǎn)染(即在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入磷酸鹽緩沖液或重組腺病毒顆粒(1000病毒顆粒/細(xì)胞))癌細(xì)胞(HU99，A549, Lovo, 和DLD1)和正常細(xì)胞(人體成纖維細(xì)胞(NHFB)，CD34+間質(zhì)主細(xì)胞，正常的人體支氣管上皮細(xì)胞(NHBE))(購自Clonetics Corp (San Diego, CA))。用β -半乳糖苷酶活性分析法檢驗(yàn)LacZ表達(dá)(具體方法見Gu et al，2000)。來自于巨細(xì)胞病毒或端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子的半乳糖苷酶活性，在癌細(xì)胞中只相差了 2-10倍。但是，在正常的細(xì)胞中，它們卻相差超過500倍。結(jié)果詳見圖2。
實(shí)施例3. CMV啟動子和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子驅(qū)使綠色熒光融合蛋白的表達(dá)同樣的結(jié)果也在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子驅(qū)使綠色熒光融合蛋白的實(shí)驗(yàn)中獲得。 用Ad/CMV-綠色熒光蛋白(Ad/CMV-GFP)(圖16)或Ad/TERT-綠色熒光蛋白/ Bax (Ad/TERT-GFP/Bax)(圖 13)轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞(H1299, A549, H322 和 H!358)，即在細(xì)胞培養(yǎng)液(MEM或DMEM)中加入1000病毒顆粒/細(xì)胞。Ad/CMV-GFP(圖16)禾口 Ad/TERT-GFP/ Bax (具體構(gòu)建方法見Gu etal.，2002b.載體圖譜見附圖1 均為復(fù)制缺陷型腺病毒載體， 由它們各自的表達(dá)盒(CMV-GFP (GFP基因序列見SEQ ID NO 3)或TERT_GFP/Bax (GFP/Bax 基因融合序列見SEQ ID NO :4))插入并取代腺病毒El區(qū)(見所附在圖譜)而構(gòu)建的，表達(dá)盒的啟動子見基因所附序列(TetR和TRE序列，編號為SEQ ID NO 11和12)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)(37°C，5% CO2，培養(yǎng)液為含10%小牛血清的DMEM) 24-48小時，可在熒光顯微鏡(Olympus)下檢測到綠色熒光蛋白和綠色熒光蛋白-Bax融合蛋白的表達(dá)。圖3顯示，巨細(xì)胞病毒-綠色熒光蛋白能在所有癌細(xì)胞(H1299，AM9，H322和H358)和正常細(xì)胞(NHFB) 中表達(dá)。但是，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶-綠色熒光蛋白只能在癌癥細(xì)胞里表達(dá)，而不能在正常的 NHFB細(xì)胞里表達(dá)。在小鼠體內(nèi)的測試也得到了同樣的結(jié)果(具體的測試方法見Gu et al., 2002b)。將切101(1腺病毒載體注入小鼠尾靜脈或小鼠的腫瘤中，兩天后將小鼠處死，取其肝臟組織或腫瘤組織，冷凍切片后熒光顯微鏡(Olympus)下觀察。CMV-GPF在腫瘤組織和正常的肝臟組織里得到表達(dá)。但是，TERT-GFP/Bax只在腫瘤組織里得到表達(dá)。這些結(jié)果表明腫瘤特異的報告基因或目的基因表達(dá)是通過端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子獲得的，結(jié)果如圖3。實(shí)施例4.用二元表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤特異性基因表達(dá)應(yīng)用綠色熒光蛋白/TRAIL融合基因(GFP/TRAIL其序列見SEQ IDNO 5)觀察腫瘤細(xì)胞特異性基因表達(dá)。這顯示說明書中提到的二元表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤特異性基因表達(dá)。在這種情況下，Gal4/VP16融合轉(zhuǎn)錄因子(其序列如SEQ ID NO 6所示)被用來增強(qiáng)腫瘤特異性基因表達(dá)。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子被用來驅(qū)動fel4/VP16表達(dá)。被表達(dá)的 Gal4/VP16再激活它的靶啟動子Gal4/TATA(GT)(其序列如SEQ ID NO 7所示)啟動子，后者用于驅(qū)使綠色熒光蛋白-TRAIL的表達(dá)。這個二元表達(dá)系統(tǒng)的好處是，轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平可顯著增強(qiáng)(超過100倍)，但啟動子的特異性卻被保留(Koch et al 2001)。如圖4所見，將由GT啟動子表達(dá)GFP/TRAIL的表達(dá)盒和由TERT啟動子表達(dá)feil4/ GV16的表達(dá)盒一起插入腺病毒El區(qū)，構(gòu)建成載體Ad/gTRAIL(具體的載體圖譜見圖4和圖14。這兩個表達(dá)盒以頭尾方式相連接。從右到左，依次為GT啟動子-GFP/TRAIL融合基因-SV40多聚A信號-TERT啟動子-GAL4/GV16轉(zhuǎn)錄因子基因-牛生長基因多聚A信號)。 用Ad/gTRAIL和Ad/CMV-GFP (對照載體)分別轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染劑量為500 2000moi)結(jié)腸癌細(xì)胞DLDl和正常成纖維細(xì)胞(NHFB)，培養(yǎng)M-48小時后觀察綠色熒光蛋白(GFP或GFP/ TRAIL)的表達(dá)及細(xì)胞形態(tài)。CMV-GFP在癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中均表達(dá)，但不引起細(xì)胞死亡。 而Ad/gTRAIL僅在癌細(xì)胞DLDl得到表現(xiàn)并將細(xì)胞殺死，卻不在成纖維細(xì)胞中表現(xiàn)。實(shí)施例5.構(gòu)建TC嵌合啟動子TC嵌合啟動子包含人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子和巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子(其具體序列如SEQ ID N0:8所示)。這種嵌合式啟動子具有端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子的特異性，并且啟動子的活性也比野生型的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子要強(qiáng)很多。嵌合啟動子包括了相應(yīng)的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的起始密碼子之前的堿基對(-456到-2(基因庫編號僅2192幻)和巨細(xì)胞病毒啟動子的小片段增強(qiáng)子序列，即人體巨細(xì)胞病毒早期蛋白起始密碼子的-1017到-901序列(基因庫編號M21925)。這種嵌合式啟動子被命名為TC啟動子(SEQ ID NO :8)。圖5 中顯示的是質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，其包括了驅(qū)使于綠色熒光蛋白表達(dá)盒的TC啟動子。實(shí)施例6.條件復(fù)制型腺病毒表達(dá)報告基因綠色熒光蛋白(Ad/GFP-El)。綠色熒光蛋白基因和腺病毒El基因均由TC嵌合性啟動子(見實(shí)施例幻驅(qū)使。Ad/GFP-El的構(gòu)建是將TC-GFP表達(dá)盒(表達(dá)盒具體的構(gòu)建見Davis JJet al， 2006)插入到腺病毒El區(qū)之前，用TC啟動子取代腺病毒El啟動子(即將TC啟動子序列插入到El基因的上游，圖譜見附圖15)。用同樣劑量(IOOOmoi)的Ad/GFP-El轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞(NHFB)和癌細(xì)胞(MiaPaca2(購自ATCC. ORG)，DLDl和HU99，M-48小時后用蛋白印跡法 (Western blot)檢測El蛋白的表達(dá)(具體方法見Davis JJ et al.，2006)，或在熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)?？梢姉l件復(fù)制型腺病毒能在癌細(xì)胞里表達(dá)綠色熒光蛋白和E1A，但是不能在正常的細(xì)胞里表達(dá)這些基因，例如不能在正常的纖維原細(xì)胞(NHFB)表達(dá)這些基因(見圖6和圖7)。當(dāng)細(xì)胞被載有CMV-GFP的病毒載體(Ad/CMV-GFP，CMV啟動子驅(qū)動綠色熒光蛋白的表達(dá))感染時，癌細(xì)胞(HU99)和正常細(xì)胞(NHFB)都表達(dá)綠色熒光蛋白。但是，當(dāng)細(xì)胞被Ad/GFP-El感染時，只有H1299細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白。NHFB細(xì)胞不表達(dá)綠色熒光蛋白(圖7)。同樣的，當(dāng)Ad/GFP-El被注入到腫瘤里，只有腫瘤能表達(dá)綠色熒光蛋白，而腫瘤周圍的正常的組織卻不能表達(dá)(圖7)。實(shí)施例7.纖維蛋白修飾的條件復(fù)制型腺病毒載體病毒纖維改進(jìn)后的條件復(fù)制型腺病毒表達(dá)報告基因綠色熒光蛋白(Ad/ GFP-E1-RGD)(圖 17)。在圖8中的條件復(fù)制型腺病毒和在圖6里的是(見上述實(shí)施例6) —樣的，但是它的表面纖維蛋白被修改。編碼精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列被插入到位于圖距單位86-91的腺病毒基因組中，從而使病毒纖維蛋白頭部(knob)含有(RGD)序列(見所附腺病毒纖維蛋白基因序列，如SEQID N0:10所顯示)。這種腺病毒能感染含低水平的腺病毒受體或不含腺病毒受體的腫瘤細(xì)胞。圖8就是對照載體(Ad/CMV-GFP)，Ad/GFP-El和Ad/ GFP-El-RGD在腫瘤中的綠色熒光蛋白的表達(dá)。先將小鼠纖維肉瘤細(xì)胞(UV-2237)接種在小鼠腿部，在其形成腫瘤后(約一周左右)，將相同劑量(5xl09病毒顆粒/小鼠)的Ad/CMV-GFP (對照載體)，Ad/GFP-El和Ad/ GFP-El-RGD注射到腫瘤內(nèi)，兩周后觀察GFP在腫瘤和腫瘤周圍正常組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，在被Ad/GFP-El-RGD感染的腫瘤里，綠色熒光蛋白比較強(qiáng)。注，周圍正常組織沒有報告基因能表達(dá)。實(shí)施例8.在血液樣本中檢驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞。測試腺病毒能否通過嵌合式的TC啟動子表達(dá)綠色熒光蛋白被用來檢測腫瘤細(xì)胞。把100個人體腫瘤細(xì)胞(培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞HU99)加入到5毫升正常的人體血液樣本里。血液樣本用低滲氯化銨溶液溶解去除紅血細(xì)胞。用磷酸鹽緩沖液把白血細(xì)胞清洗三次，然后用IxlO4病毒顆粒的Ad/GFP-El或Ad/GFP-El-RGD感染細(xì)胞(即在0. 5ml培養(yǎng)液中加入IxlO4病毒顆粒，直接加到上述白細(xì)胞中，混勻)，在37°C下，將轉(zhuǎn)染后的白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞在RPMI 1640培養(yǎng)基里培養(yǎng)M小時。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。沒有添加腫瘤細(xì)胞的血液樣本也用同樣量的Ad/GFP-El或Ad/GFP-El-RGD進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，只有添加了腫瘤細(xì)胞的血液樣本出現(xiàn)綠細(xì)胞(圖幻。沒有腫瘤細(xì)胞的血液樣本沒有出現(xiàn)任何綠細(xì)胞。 這樣的結(jié)果表明腫瘤特性啟動子能用于檢驗(yàn)血液樣本里腫瘤細(xì)胞的報告基因表達(dá)。實(shí)施例9.癌癥患者血樣本檢測。從一例肺癌患者及一例正常對照取血5毫升，用Ficoll梯度離心方法分離有核細(xì)胞后，加10000病毒感染單位的Ad/GFP-El于白細(xì)胞中。再將白細(xì)胞培養(yǎng)于一 48孔板的培養(yǎng)板(購自Fisher kientific)，每孔一個樣品，培養(yǎng)兩天后在熒光顯微鏡下觀察。在正常樣品中未見綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞，而在肺癌患者的樣品中，一個視野就有幾個陽性細(xì)胞 (圖10)。圖10左側(cè)在熒光顯微鏡下；右側(cè)，與左側(cè)相同視野，但在普通顯微鏡下。注，熒光蛋白在黑白照中顯白色。附錄1，所述啟動子或基因序列人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶核心啟動子序列(SEQ ID NO 1)accctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggcccagacccccgggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccgcgctccccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagccctggccccggccacccccgccLacZ 基因序列(SEQ ID NO 2)atgtcgtttactttgaccaacaagaacgtgattttcgttgccggtctgggaggcattggtctggacaccagcaaggagctgctcaagcgcgatcccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgatactgtcgtcgtcccctcaaactggcagatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttcatctgtggtgcaacgggcgctgggtcggttacggccaggacagtcgtttgccgtctgaatttgacctgagcgcatttttacgcgccggagaaaaccgcctcgcggtgatggtgctgcgttggagtgacggcagttatctggaagatcaggatatgtggcggatgagcggcattttccgtgacgtctcgttgctgcataaaccgactacacaaatcagcgatttccatgttgccactcgctttaatgatgatttcagccgcgctgtactggaggctgaagttcagatgtgcggcgagttgcgtgactacctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggcaccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtgcggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcagaagcctgcgatgtcggtttccgcgaggtgcggattgaaaatggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctgattcgaggcgttaaccgtcacgagcatcatcctctgcatggtcaggtcatggatgagcagacgatggtgcaggatatcctgctgatgaagcagaacaactttaacgccgtgcgctgttcgcattatccgaaccatccgctgtggtacacgctgtgcgaccgctacggcctgtatgtggtggatgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatgaatcgtctgaccgatgatccgcgctggctaccggcgatgagcgaacgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacccgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatcaggccacggcgctaatcacgacgcgctgtatcgctggatcaaat
ctgtcgatccttcccgcccggtgcagtatgaaggcggcggagccgacaccacggccaccgatattatttgcccgatgtacgcgcgcgtggatgaagaccagcccttcccggctgtgccgaaatggtccatcaaaaaatggctttcgctacctggagagacgcgcccgctgatcctttgcgaatacgcccacgcgatgggtaacagtcttggcggtttcgctaaatactggcaggcgtttcgtcagtatccccgtttacagggcggcttcgtctgggactgggtggatcagtcgctgattaaatatgatgaaaacggcaacccgtggtcggcttacggcggtgattttggcgatacgccgaacgatcgccagttctgtatgaacggtctggtctttgccgaccgcacgccgcatccagcgctgacggaagcaaaacaccagcagcagtttttccagttccgtttatccgggcaaaccatcgaagtgaccagcgaatacctgttccgtcatagcgataacgagctcctgcactggatggtggcgctggatggtaagccgctggcaagcggtgaagtgcctctggatgtcgctccacaaggtaaacagttgattgaactgcctgaactaccgcagccggagagcgccgggcaactctggctcacagtacgcgtagtgcaaccgaacgcgaccgcatggtcagaagccgggcacatcagcgcctggcagcagtggcgtctggcggaaaacctcagtgtgacgctccccgccgcgtcccacgccatcccgcatctgaccaccagcgaaatggatttttgcatcgagctgggtaataagcgttggcaatttaaccgccagtcaggctttctttcacagatgtggattggcgataaaaaacaactgctgacgccgctgcgcgatcagttcacccgtgcaccgctggataacgacattggcgtaagtgaagcgacccgcattgaccctaacgcctgggtcgaacgctggaaggcggcgggccattaccaggccgaagcagcgttgttgcagtgcacggcagatacacttgctgatgcggtgctgattacgaccgctcacgcgtggcagcatcaggggaaaaccttatttatcagccggaaaacctaccggattgatggtagtggtcaaatggcgattaccgttgatgttgaagtggcgagcgatacaccgcatccggcgcggattggcctgaactgccagctggcgcaggtagcagagcgggtaaactggctcggattagggccgcaagaaaactatcccgaccgccttactgccgcctgttttgaccgctgggatctgccattgtcagacatgtataccccgtacgtcttcccgagcgaaaacggtctgcgctgcgggacgcgcgaattgaattatggcccacaccagtggcgcggcgacttccagttcaacatcagccgctacagtcaacagcaactgatggaaaccagccatcgccatctgctgcacgcggaagaaggcacatggctgaatatcgacggtttccatatggggattggtggcgacgactcctggagcccgtcagtatcggcggaattacagctgagcgccggtcgctaccattaccagttggtctggtgtcaaaaataaGFP 基因序列(SEQ ID NO 3)atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccaccggatGFP/Bax 基因融合序列(SEQ ID NO 4)atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcag
ccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtactcagatatggacgggtccggggagcagcccagaggcggggggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcgagcagggcgaatggggggggaggcacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcgagtgtctcaagcgcatcggggacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgattgccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctactttgccagcaaactggtgctcaaggccctgtgcaccaaggtgccggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggctggatccaagaccagggtggttgggacggcctcctctcctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcgctcaccatctggaagaagatgggctgaGFP/TRAIL 基因融合序列(SEQ ID NO 5)atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtactcagatctcgagctcaagcttcgaattcctgcagcccggcgaaggagggccaccatggccatgatggaggtccaggggggacccagcctgggacagacctgcgtgctgatcgtgatcttcacagtgctcctgcagtctctctgtgtggctgtaacttacgtgtactttaccaacgagctgaagcagatgcaggacaagtactccaaaagtggcattgcttgtttcttaaaagaagatgacagttattgggaccccaatgacgaagagagtatgaacagcccctgctggcaagtcaagtggcaactccgtcagctcgttagaaagatgattttgagaacctctgaggaaaccatttctacagttcaagaaaagcaacaaaatatttctcccctagtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaagGal4/VP16 融合轉(zhuǎn)錄因子序列(SEQ ID NO 6)
AtgaagctactgtcttctatcgaacaagcatgcgatatttgccgacttaaaaagctcaagtgctccaaagaaaaaccgaagtgcgccaagtgtctgaagaacaactgggagtgtcgctactctcccaaaaccaaaaggtctccgctgactagggcacatctgacagaagtggaatcaaggctagaaagactggaacagctatttctactgatttttcctcgagaagaccttgacatgattttgaaaatggattctttacaggatataaaagcattgttaacaggattatttgtacaagataatgtgaataaagatgccgtcacagatagattggcttcagtggagactgatatgcctctaacattgagacagcatagaataagtgcgacatcatcatcggaagagagtagtaacaaaggtcaaagacagttgactgtatcgccggaattcccggggatcaccgcccccattaccgacgtcagcctgggagacgaactccgcctggacggcgaggaggtggatatgacgcccgccgacgccctggacgacttcgacttggagatgctgggggacgtggagtcccccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtagGal4/TATA(GT)啟動子序列(SEQ ID NO 7)gtcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagtactgtcctccgagcggagactctagagggtatataatTC嵌合啟動子序列(劃線部份來自CMV啟動子，其余來自TERT啟動子)(SEQ ID NO 8)accctgggagcgcgagcggcgcgcgggcggggaagcgcggcccagacccccgggtccgcccggagcagctgcgctgtcggggccaggccgggctcccagtggattcgcgggcacagacgcccaggaccgcgctccccacgtggcggagggactggggacccgggcacccgtcctgccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtcccgacccctcccgggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctttaccgcggccccgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgcacgtgggaagcCctRRccccRRccacccccRccaRatctRatctRtaRRcRtRtaCRRtRRRaRRCCtatataaRCaRaRCtCRtttaRtRaaccRtcaRatcRcctRRaRacRccatccacRctRttttRacctccataRaaRacaccRRRaccRatccaCMV 啟動子序列(SEQ ID NO 9)Gcccggttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctccgcggccgggaacggtgcattggaacggacctgc腺病毒纖維蛋白序列(劃線部分為插入序列，含RGD序列)(SEQ ID NO 10)atgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtatccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcccccaatgggtttcaagagagtccccctggggtactctctttgcgcctatccgaacctctagttacctccaatggcatgcttgcgctcaaaatgggcaacggcctctctctggacgaggccggcaaccttacctcccaaaatgtaaccactgtgagcccacctctcaaaaaaaccaagtcaaacataaacctggaaatatctgcacccctcacagttacctcagaagccctaactgtggctgccgccgcacctctaatggtcgcgggcaacacac
tcaccatgcaatcacaggccccgctaaccgtgcacgactccaaacttagcattgccacccaaggacccctcacagtgtcagaaggaaagctagccctgcaaacatcaggccccctcaccaccaccgatagcagtacccttactatcactgcctcaccccctctaactactgccactggtagcttgggcattgacttgaaagagcccatttatacacaaaatggaaaactaggactaaagtacggggctcctttgcatgtaacagacgacctaaacactttgaccgtagcaactggtccaggtgtgactattaataatacttccttgcaaactaaagttactggagccttgggttttgattcacaaggcaatatgcaacttaatgtagcaggaggactaaggattgattctcaaaacagacgccttatacttgatgttagttatccgtttgatgctcaaaaccaactaaatctaagactaggacagggccctctttttataaactcagcccacaacttggatattaactacaacaaaggcctttacttgtttacagcttcaaacaattccaaaaagcttgaggttaacctaagcactgccaaggggttgatgtttgacgctacagccatagccattaatgcaggagatgggcttgaatttggttcacctaatgcaccaaacacaaatcccctcaaaacaaaaattggccatggcctagaatttgattcaaacaaggctatggttcctaaactaggaactggccttagttttgacagcacaggtgccattacagtaggaaacaaaaataatgataagctaactttgtggaccacaccagctccatctcctaactgtagactaaatgcagagaaagatgctaaactcactttggtcttaacaaaatgtggcagtcaaatacttgctacagtttcagttttggctgttaaaggcagtttggctccaatatctggaacagttcaaagtgctcatcttattataagatttgacgaaaatggagtgctactaaacaattccttcctggacccagaatattggaactttagaaatggagatcttactgaaggcacagcctatacaaacgctgttggatttatgcctaacctatcagcttatccaaaatctcacggtaaaactgccaaaagtaacattgtcagtcaagtttacttaaacggagacaaaactaaacctgtaacactaaccattacactaaacggtacacaggaaacaggagacacaacttgtgactgccgcggagactgtttctgcccaagtgcatactctatgtcattttcatgggactggtctggccacaactacattaatgaaatatttgccacctcgagttacactttttcata cattgcccaagaataagTRE sequence(SEQ ID NO :11)TttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagtttaccactccctatcagtgatagagaaaagtgaaagtcgagctcggtacccgggtcgagtaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctTetR sequence (SEQ ID NO 12)atgtctagattagataaaagtaaagtgattaacagcgcattagagctgcttaatgaggtcggaatcgaaggtttaacaacccgtaaactcgcccagaagctaggtgtagagcagcctacattgtattggcatgtaaaaaataagcgggctttgctcgacgccttagccattgagatgttagataggcaccatactcacttttgccctttagaaggggaaagctggcaagattttttacgtaataacgctaaaagttttagatgtgctttactaagtcatcgcgatggagcaaaagtacatttaggtacacggcctacagaaaaacagtatgaaactctcgaaaatcaattagcctttttatgccaacaaggtttttcactagagaatgcattatatgcactcagcgctgtggggcattttactttaggttgcgtattggaagatcaagagcatcaagtcgctaaagaagaaagggaaacacctactactgatagtatgccgccattattacgacaagctatcgaattatttgatcaccaaggtgcagagccagccttcttattcggccttgaattgatcatatgcggattagaaaaacaacttaaatgtgaaagtgggtccgcgtacagccgcgcgcgtacgaaaaacaattacgggtctaccatcgagggcctgctcgatctcccggacgacgacgcccccgaagaggcggggctggcggctccgcgcctgtcctttctccccgcgggacacacgcgcagactgtcgacggcccccccgaccgatgtcagcctgggggacgagctccacttagacggcgaggacgtggc
gatggcgcatgccgacgcgctagacgatttcgatctggacatgttgggggacggggattccccgggtccgggatttaccccccacgactccgccccctacggcgctctggatatggccgacttcgagtttgagcagatgtttaccgatgcccttggaattgacgagtacggtgggtag參考文獻(xiàn)Blackburn，Ε. H. (1992). Telomerases. Annual Review of Biochemistry 61， 113-129.Butler, T. P. and Gullino, P.M. (1975). Quantitation of cell shedding into efferentblood of mammary adenocarcinoma. Cancer Res. 35,512-516.Chang，Y. S.，di Tomaso, Ε.，McDonald，D. Μ.，Jones，R.，Jain, R. K.，andMunn， LL (2000). Mosaic blood vessels in tumors :frequency of cancercells in contact with flowing blood. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97，14608—14613.Counter，C. M.，Avilion，A. A.，LeFeu vre , C. E.，Stewart, N. G.， Greider, C. W.，Harley, C. B.，and Bacchetti, S. (1992). Telomere shortening associated withchromosome instability is arrested in immortal cells which expresstelomerase activity. EMBO Journal 11，1921—1929·Davis, J. J.，Wang, L，Dong，F(xiàn).，Zhang，L，Guo, W.，Teraishi，F(xiàn).，Xu, K.，Ji，L， andFang，B. (2006). 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權(quán)利要求
1.一種腫瘤特異性啟動子，其在腫瘤細(xì)胞中的活性比其在正常細(xì)胞中的活性要高。
2.權(quán)利要求1的腫瘤特異性啟動子，其包括人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子，survivin啟動子，medkine啟動子，癌胚抗原啟動子，MUC-I啟動子和probasin基因啟動子。
3.權(quán)利要求1的腫瘤特異性啟動子，其可以是組織或者細(xì)胞型特異性基因的原啟動子，也可以是經(jīng)改造的組合啟動子，例如含有源自組織或細(xì)胞型特異性啟動子的序列和源自其他啟動子的增強(qiáng)子的嵌合型啟動子。
4.權(quán)利要求3的腫瘤特異性啟動子，其中所述腫瘤特異性啟動子是改造的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子，其含有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子序列以及源自CMV啟動子的增強(qiáng)子序列。
5.權(quán)利要求4的腫瘤特異性啟動子，所述啟動子序列如SEQID N0:8所示。
6.一種載體，其是包括由權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的腫瘤特異性啟動子驅(qū)使表達(dá)的報告基因的基因表達(dá)載體。
7.權(quán)利要求6的載體，其中提及的報告基因是一種通常作為啟動子活性指示劑的基因。
8.權(quán)利要求7的載體，其中所述報告基因包括熒光蛋白(綠色，紅色，黃色和藍(lán)色熒光蛋白)的基因，螢火蟲熒光素酶基因，海腎熒光素酶基因，細(xì)菌半乳糖苷酶(LacZ)基因。
9.權(quán)利要求7的載體，其中所述基因表達(dá)載體指任何一種用于基因轉(zhuǎn)染的載體。
10.權(quán)利要求7的載體，其中所述基因表達(dá)載體包括質(zhì)粒，質(zhì)粒/脂質(zhì)復(fù)合物以及病毒載體。
11.權(quán)利要求10的載體，其中提及的病毒載體是指復(fù)制缺陷型病毒載體和可復(fù)制型病毒載體，例如腺病毒載體，可復(fù)制型腺病毒載體，皰疹病毒載體，牛痘病毒載體等。
12.權(quán)利要求11的載體，其中所述病毒載體是經(jīng)過病毒纖維改進(jìn)后的。
13.權(quán)利要求12的載體，其中所述病毒纖維改進(jìn)是通過將編碼精氨酸-甘油酸-天冬氨酸(RGD)編碼序列插入到位于圖距單位86-91的腺病毒基因組中，從而使病毒纖維蛋白含RGD序列，改變其受體特異性，改進(jìn)后的載體可經(jīng)整合素蛋白(integrin)進(jìn)入靶細(xì)胞。
14.權(quán)利要求7的載體，其中組織或腫瘤特異性啟動子的活性通過二元表達(dá)系統(tǒng)來加強(qiáng)。
15.權(quán)利要求7的載體，其中提及的基因表達(dá)載體包括可復(fù)制型腺病毒載體Ad/El-GFP 和 Ad/El-GFP-RGD，復(fù)制缺陷型腺病毒載體 Ad/TERT_GFP，Ad/TERT-LacZ, Ad/GFP-TRAIL 和 Ad/TERT-Luciferase.。
16.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的腫瘤特異性啟動子和/或權(quán)利要求 6-15任一項(xiàng)的載體，用于癌癥患者的早期診斷，治療反應(yīng)的預(yù)測及其預(yù)后。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其用于檢測血標(biāo)本和骨髓標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞。
18.—種診斷劑，其包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的腫瘤特異性啟動子和/或權(quán)利要求 6-15任一項(xiàng)的載體，用于癌癥患者的早期診斷，治療反應(yīng)的預(yù)測及其預(yù)后。
19.權(quán)利要求18的診斷劑，其用于檢測血標(biāo)本和骨髓標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞。
20.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的腫瘤特異性啟動子用于制備權(quán)利要求7-15任一項(xiàng)的載體以及權(quán)利要求16-17任一項(xiàng)的試劑盒和權(quán)利要求18-19任一項(xiàng)的診斷劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供用于檢測循環(huán)血樣本和骨髓樣本中腫瘤細(xì)胞的方法與試劑，即應(yīng)用腫瘤特異性啟動子驅(qū)使報告基因表達(dá)，來檢測血樣本和骨髓樣本中的腫瘤細(xì)胞。腫瘤特異性啟動子，如人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子(TERT)，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中有很高的活性，但是在正常細(xì)胞中沒有活性。用含有腫瘤特異性啟動子驅(qū)使的報告基因表達(dá)盒的基因載體，例如腺病毒載體，轉(zhuǎn)染血樣本或骨髓樣本中的有核細(xì)胞，然后檢測樣本中是否存在報告基因高表達(dá)的細(xì)胞，從而確認(rèn)樣本中是否存在腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明提供包含所述啟動子，報告基因和載體的診斷試劑盒，可用于癌癥患者的早期診斷及治療反應(yīng)的預(yù)測。
文檔編號C12Q1/02GK102191245SQ20101013175
公開日2011年9月21日 申請日期2010年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月15日
發(fā)明者方效良 申請人:浙江東方基因生物制品有限公司