專利名稱：創(chuàng)傷弧菌核酸定量檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于上轉(zhuǎn)換磷光(UPT)核酸層析技術(shù)的水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌基因診斷定量檢測試紙條，特別涉及對創(chuàng)傷弧菌特定基因片段具有特異性的引物及探針；還涉 及將上述引物及探針用PCR擴增法檢測水產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌的上轉(zhuǎn)換磷光核酸層析檢測方法 和檢測試劑盒。該檢測方法用以靈敏、快速、定量檢測水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷弧菌是海洋和鹽湖中廣泛分布的一種嗜鹽性病原菌，該菌對于糖尿病、酒精 性肝病、肝硬化、肝炎及原因不明的肝功能障礙，艾滋病或其它重病患者的危害相當(dāng)嚴(yán)重， 特別是對原發(fā)性敗血癥病例，死亡率超過50%。目前世界上大部分沿海國家都有創(chuàng)傷孤菌 感染的病例報告。創(chuàng)傷弧菌的感染途徑有兩個一是經(jīng)口感染，引起原發(fā)性敗血癥，這主要 是由于食用生的或未經(jīng)充分加工的貝類引起的；二是通過皮膚傷口侵入，在原皮膚傷口處 形成紅腫、紅斑和劇烈疼痛，發(fā)展迅速，最終引起敗血癥，這主要是由于傷口接觸存在創(chuàng)傷 弧菌的貝類或海水引起的。歐盟已要求對從我國進(jìn)口的水產(chǎn)品檢測創(chuàng)傷弧菌，因此，開展水 產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的污染情況調(diào)查，研究快速檢測和分離創(chuàng)傷弧菌的方法顯得尤為重要。創(chuàng)傷弧菌傳統(tǒng)的檢測方法是通過首先使用創(chuàng)傷弧菌增菌培養(yǎng)基堿性蛋白胨水 (APff)或添加多粘菌素B的APW增菌12 16h，改良纖維二糖多粘菌素B多粘菌素E瓊脂或 纖維二糖多粘菌素E瓊脂劃線培養(yǎng)18h 24h，挑取可疑菌落以3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊 脂接種，挑菌后進(jìn)行生化實驗，或選用API 20E診斷試劑條。傳統(tǒng)方法經(jīng)過多個篩選步驟， 需要多種培養(yǎng)基，耗時較長；另有利用vvh單克隆抗體檢測的方法，該方法要求挑取單一的 菌落大量增菌后利用免疫學(xué)方法鑒定，特異性較高，但兩種方法檢測所需時間均較長，為了 盡量減少人類因接觸或食用創(chuàng)傷弧菌污染的水產(chǎn)品，建立靈敏、特異的檢測方法對保護(hù)人 類健康極為重要。創(chuàng)傷弧菌基因檢測技術(shù)為病原菌的快速檢測提供了有力的工具，也是未來創(chuàng)傷弧 菌檢測方法研究的一個重點。本發(fā)明將創(chuàng)傷弧菌基因檢測技術(shù)與核酸擴增產(chǎn)物層析檢測法 相結(jié)合，建立了快速、靈敏度高的創(chuàng)傷弧菌基因診斷定量檢測試紙條。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于，提供一種對創(chuàng)傷弧菌特定基因片段具有特異性的引物。上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的?！N創(chuàng)傷弧菌檢測用引物，其特征在于，能擴增靶基因特異性堿基序列，所述靶基 因為創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素結(jié)構(gòu)基因vvhA。所述引物與vvhA的350位 800位的核苷酸的一 部分或其互補鏈互補。所述引物由下列引物組成正向弓IilJvvhAl :ccgcacttacattggtcc反向弓 I 物 vvhA2 tagggttgaacttcgtctta
特別地，VVhAl正向引物或vvhA2反向引物以生物素或地高辛標(biāo)記，可以擴增vvhA 的350位 800位的核苷酸。為增加反應(yīng)的特異性，本發(fā)明還提供一條探針，此探針與vvhA的350位 800位的核苷酸的一部分或其互補鏈互補，該探針的序列為vvp :gccgtctttgttcacttccgc并且，該探針標(biāo)記了 FITC。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種利用上述引物和探針基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法 檢測創(chuàng)傷弧菌的檢測方法及檢測試劑盒。上述目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種創(chuàng)傷弧菌的檢測方法該方法用于檢測水產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌，其特征在于，以 創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素結(jié)構(gòu)基因whA350位 800位的核苷酸的一部分或其互補鏈互補為靶， 通過PCR法用上述引物選擇性擴增上述靶區(qū)域，確認(rèn)是否存在有擴增產(chǎn)物。PCR擴增產(chǎn)物本實驗選取了快速定量檢測核酸擴增產(chǎn)物的檢測試紙條，包括由樣 品吸收區(qū)、結(jié)果掃描窗和終點指示窗構(gòu)成的檢測試紙和反應(yīng)緩沖液，快速定量檢測核酸擴 增產(chǎn)物試紙條分為底板、玻璃纖維層、抗體吸附膜及吸水紙，快速定量檢測核酸擴增產(chǎn)物的 方法包括包被標(biāo)記物抗體、核酸擴增標(biāo)記上轉(zhuǎn)磷光檢測。試紙由樣品墊、抗體吸附膜、吸水紙、粘性底襯、試紙條外殼組成，其中生物素或地 高辛抗體吸附于抗體吸附膜，樣品經(jīng)上轉(zhuǎn)磷光標(biāo)記試劑標(biāo)記，過程包括標(biāo)記生物素或地高 辛特異性引物擴增，標(biāo)記FITC特異性探針與擴增產(chǎn)物雜交，上轉(zhuǎn)磷光顆粒標(biāo)記FITC抗體特 異性結(jié)合FITC，加樣于加樣區(qū)，標(biāo)記實驗結(jié)果由UPT生物傳感器分析判讀。具體檢測方法為(1)樣品處理和模板提取取水產(chǎn)品除殼組織高速勻漿處理，取勻漿物增菌液增菌12h，取1. 5M1增菌液 IOOOOrpm離心5min后棄上清，加入30 μ L雙蒸水煮沸5min，12000rpm離心IOmin后取上清 2PL做為待檢模板DNA。(2)創(chuàng)傷桿菌目的片段的擴增取擴增反應(yīng)液，依次加入反應(yīng)緩沖液、vvhAl、vvhA2、模板、酶，最后雙蒸水，形成總 體積20-100 μ L的反應(yīng)體系，混勻，瞬時離心后反應(yīng)程序為94°C 5min，94°C 30s,55°C 30s、 72°C 30s 30個循環(huán)，72°C 6min，最后置于100滅活酶5min。(3)探針雜交在上述擴增產(chǎn)物中加入探針，終濃度為ΙμΜ，加入后反應(yīng)程序為98°C 30s, 58 °C 20min。(4)將上步雜交產(chǎn)物加入反應(yīng)緩沖液混勻，加入試紙條樣品吸收區(qū)中，與UCP標(biāo)記 物結(jié)合。(5)5 15min后，觀察終點指示窗確定反應(yīng)結(jié)束，以UPT生物傳感器掃描結(jié)果掃描 窗，得到相應(yīng)檢測結(jié)果。一種創(chuàng)傷弧菌檢測試劑盒。其特征在于，試劑盒包括引物vvhAl，vvhA2，探針 vvp，PCR反應(yīng)緩沖液，探針雜交緩沖液，含有UCP標(biāo)記的FITC抗體、抗生物素或地高辛抗體、 陽性對照抗體的試紙條。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有突出的優(yōu)點和實用性1.檢測快速與傳統(tǒng)分離后生化鑒定的方法相比，縮短到24h內(nèi)，檢測快速。2.檢測準(zhǔn)確率高、特異性強由于上轉(zhuǎn)磷光技術(shù)的特殊性，其發(fā)光不受外界環(huán)境 的影響，最大限度上保證檢測的穩(wěn)定性，基于分子雜交技術(shù)的基因探針能特異性識別目標(biāo) DNA片段。3.靈敏度高，最低檢測限為5pg DNA。4.結(jié)果為機器自動判讀，減少了人為誤差。本發(fā)明通過提供一種對創(chuàng)傷弧菌特點基因片段具有特異性的引物組及探針，結(jié)合 快速定量檢測核酸擴增產(chǎn)物的檢測試檢測水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌特定基因片段，本發(fā)明檢測試 劑和檢測方法具有敏感性高、快速、特異性高的優(yōu)點，可解決水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌快速檢測的 問題。


附圖為核酸擴增產(chǎn)物定量檢測試紙條外觀；上述附圖序號為1、樣品吸收區(qū)，2、UCP標(biāo)記物，3、結(jié)果掃描窗，4、檢測線，5、質(zhì)控 線，6、終點指示窗。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本實用新型作進(jìn)一步詳細(xì)描述(1)樣品處理和模板提取取水產(chǎn)品除殼組織高速勻漿處理，取勻漿物增菌液增菌12h，取1. 5M1增菌液 IOOOOrpm離心5min后棄上清，加入30 μ L雙蒸水煮沸5min，12000rpm離心IOmin后取上清 2yL做為待檢模板DNA。(2)創(chuàng)傷桿菌目的片段的擴增取擴增反應(yīng)液，依次加入反應(yīng)緩沖液、vvhAl、vvhA2、模板、酶，最后雙蒸水，形成總 體積20-100 μ L的反應(yīng)體系，混勻，瞬時離心后反應(yīng)程序為94°C 5min，94°C 30s,55°C 30s、 72°C 30s 30個循環(huán)，72°C 6min，最后置于100滅活酶5min。(3)探針雜交在上述擴增產(chǎn)物中加入探針，終濃度為ΙμΜ，加入后反應(yīng)程序為98 °C 30s, 58 °C 20min。(4)將100 μ 1反應(yīng)緩沖液和10 μ 1待檢測樣品(雜交產(chǎn)物)混合均勻；將100μ 1 混合液加于試紙條樣品吸收區(qū)1中，與UCP標(biāo)記物2進(jìn)行反應(yīng)(5)5 15min后，觀察終點指示窗6確定反應(yīng)結(jié)束，以UPT生物傳感器掃描結(jié)果掃 描窗3，得到相應(yīng)檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
一種水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌基因診斷定量檢測方法，其特征是(1)待測菌株的特異性引物的設(shè)計、篩選和制備；(2)與特異性擴增產(chǎn)物能夠特異性結(jié)合的探針序列的設(shè)計、篩選和制備；(3)核酸擴增后利用上轉(zhuǎn)換磷光技術(shù)進(jìn)行定量檢測的核酸層析檢測試紙條。
2.權(quán)利要求1中所述創(chuàng)傷弧菌特異性引物，其特征在于，該引物的靶基因為創(chuàng)傷弧菌 溶細(xì)胞素結(jié)構(gòu)基因vvhA。所述引物與vvhA的350位 800位的核苷酸的一部分或其互補 鏈互補。
3.權(quán)利要求1中所述引物的組成正向弓丨物 vvhAl :ccgcacttacattggtcc反向引物vvhA2 :tagggttgaacttcgtctta，并且vvhAl正向引物或vvhA2反向引物以生 物素或地高辛標(biāo)記，可以擴增vvhA的350位 800位的核苷酸。
4.權(quán)利要求1中所述探針，其特征在于，該探針與利用權(quán)利要求2中vvhA的350位 800位的核苷酸的一部分或其互補鏈互補，該探針的序列為vvp :gccgtctttgttcacttccgc
5.權(quán)利要求4中所述探針，標(biāo)記了FITC。
6.權(quán)利要求1中所述核酸擴增產(chǎn)物定量檢測試紙條，包括檢測試紙和反應(yīng)緩沖液，其 特征在于所述的標(biāo)記物為上轉(zhuǎn)磷光顆粒(UCP)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸擴增產(chǎn)物定量檢測試紙條，其特征在于試紙條檢測線上 固定了生物素或地高辛抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸擴增產(chǎn)物定量檢測試紙條，其特征在于UCP標(biāo)記的為 FITC抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的創(chuàng)傷弧菌檢測方法，其特征在于，其具體檢測方法為(1)樣品處理和模板提取取水產(chǎn)品除殼組織高速勻漿處理，取勻漿物增菌液增菌12h，取1. 5M1增菌液IOOOOrpm 離心5min后棄上清，加入30 μ L雙蒸水煮沸5min，12000rpm離心IOmin后取上清2 μ L做 為待檢模板DNA。(2)創(chuàng)傷桿菌目的片段的擴增取擴增反應(yīng)液，依次加入反應(yīng)緩沖液、vvhAl, vvhA2、模板、酶，最后雙蒸水，形成總體 積20-100 μ L的反應(yīng)體系，混勻，瞬時離心后反應(yīng)程序為94°C 5min，94°C 30s,55°C 30s、 72°C 30s 30個循環(huán)，72°C 6min,最后置于100滅活酶5min。(3)探針雜交在上述擴增產(chǎn)物中加入探針，終濃度為ι μ Μ,加入后反應(yīng)程序為98°C 30s, 58°C 20min。(4)將上步雜交產(chǎn)物加入反應(yīng)緩沖液混勻，加入試紙條樣品吸收區(qū)中，與UCP標(biāo)記物結(jié)合O(5)5 15min后，觀察終點指示窗確定反應(yīng)結(jié)束，以UPT生物傳感器掃描結(jié)果掃描窗， 得到相應(yīng)檢測結(jié)果。
10.一種檢測創(chuàng)傷弧菌核酸定量檢測試劑盒，試劑盒包括引物vvhAl，vvhA2，探針 vvp，PCR反應(yīng)緩沖液，探針雜交緩沖液，含有UCP標(biāo)記的FITC抗體、抗生物素或地高辛抗體、 陽性對照抗體的試紙條。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌檢測用引物及探針、創(chuàng)傷弧菌檢測方法及檢測試劑盒。引物及探針結(jié)合位點的靶基因為創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素結(jié)構(gòu)基因vvhA350位～800位。本發(fā)明通過創(chuàng)傷弧菌核酸定量檢測試紙條定量檢測水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌，包括檢測試紙和反應(yīng)緩沖液，所述的檢測試紙由樣品吸收區(qū)、結(jié)果掃描窗和終點指示窗構(gòu)成，其特征在于其標(biāo)記物為上轉(zhuǎn)磷光顆粒；具有定量檢測，良好的靈敏性、穩(wěn)定性和安全性的優(yōu)點，能夠定量檢測水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌。
文檔編號C12Q1/06GK101818200SQ20101013121
公開日2010年9月1日 申請日期2010年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日
發(fā)明者宋超霞, 游玉容, 范建忠, 范翠翠, 黃寶福 申請人:寧波博奧生物工程有限公司