專利名稱：用環(huán)介導等溫擴增方法檢測創(chuàng)傷弧菌的試劑盒及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用環(huán)介導等溫擴增方法檢測創(chuàng)傷弧菌的試劑盒，進一步涉及一種使用該種試劑盒快速檢測創(chuàng)傷弧菌的方法。
背景技術：
創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)是一種廣泛分布于海洋與鹽湖中的嗜鹽性革蘭氏陰性致病菌。該菌是引起食源性疾病的主要病原之一，人通過進食生牡蠣等海產(chǎn)品經(jīng)胃腸道黏膜或破損的皮膚接觸海水而感染該菌，可引起原發(fā)性敗血癥、下肢創(chuàng)傷感染，出現(xiàn)皰性皮膚損害、皮膚淤斑壞死、蜂窩組織炎等，同時伴高熱、低血壓、休克，最終發(fā)展為感染性休克、多器官衰竭甚至死亡，致死率可高達70％，是食品安全和水產(chǎn)品進出口重要的微生物檢疫對象。創(chuàng)傷弧菌也是魚、蝦、貝類等的重要病原菌，可引起魚類皮膚潰爛病和敗血癥、養(yǎng)殖對蝦的紅腿病和爛鰓病以及貝類膿皰病等，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失，也是水產(chǎn)養(yǎng)殖病害檢驗檢疫的重要對象。
以往檢測創(chuàng)傷弧菌主要有三種辦法1.生化鑒定法，該法費時，操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要；2.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，該法具有敏感性高、檢測快速等特點，可用于大批標本的檢測，但對新鮮樣品進行檢測時出現(xiàn)的假陽性問題在一定程度上還限制著該方法的廣泛應用；3.聚合酶鏈式反應法(PCR法)，該法較前兩種方法快速、靈敏，但需要昂貴的PCR儀。目前尚未見用環(huán)介導等溫擴增方法檢測創(chuàng)傷弧菌的試劑盒及方法報道。
發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種快速、特異性強、靈敏度高且成本低的用環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法檢測創(chuàng)傷弧菌的試劑盒，并提供一種使用該試劑盒快速檢測創(chuàng)傷弧菌的方法，從而為水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品安全提供科學的依據(jù)和指導作用。
本發(fā)明的主要原理為(1)特殊設計一組可識別靶DNA六個不同序列的兩個內(nèi)引物(上游內(nèi)引物和下游內(nèi)引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外引物)，內(nèi)引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內(nèi)引物首先與靶DNA雜交，隨后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外引物啟動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內(nèi)引物和一個外引物啟動的DNA合成的模板，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA；(3)內(nèi)引物以原始的莖環(huán)DNA為模板，啟動鏈置換DNA的合成，產(chǎn)生一個原始的莖環(huán)DNA和一個新的有兩倍莖長度的莖環(huán)DNA；(4)在等溫條件下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶DNA反復重復序列的莖環(huán)DNA，在一小時內(nèi)該循環(huán)反應可使靶DNA累積到109拷貝，可通過熒光染料來觀察擴增結果。
本發(fā)明涉及的一種用環(huán)介導等溫擴增方法檢測創(chuàng)傷弧菌的試劑盒，其試劑包括(1)環(huán)介導等溫擴增(LAMP)反應液A含有10×Thermopol反應緩沖液、300-500uM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、2-4mM硫酸鎂(MgSO4)、0.8-1.2uM上游內(nèi)引物(vul-FIP)、0.8-1.2uM下游內(nèi)引物(vul-BIP)、0.2-0.3uM上游外引物(vul-F3)、0.2-0.3uM下游外引物(vul-B3)和1-1.5M甜菜堿；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、100mM氯化鉀(KCl)、100mM硫酸銨((NH4)2SO4)、20mM硫酸鎂(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；上游內(nèi)引物(vul-FIP)為tgccactcggctacgataacgtttttgagctgtcacggcagttg；下游內(nèi)引物(vul-BIP)為acgcagacaaaacgctcacagtttttgagcttatcgccttcccaat；上游外引物(vul-F3)為tggttcggttaacggctg；下游外引物(vul-B3)為gccatcaacatagcggctaa；(2)Bst DNA聚合酶B每微升含8個活性單位(8U/uL)；(3)顯色劑C為10％的熒光染料SYBR GREEN I。
上面所述環(huán)介導等溫擴增(LAMP)反應液A每管23uL的最佳組成為2.5uL 10×Thermopol反應緩沖液、1.0uL 10mM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游內(nèi)引物(vul-FIP)、1.0uL 20uM下游內(nèi)引物(vul-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(vul-F3)、0.25uL20uM下游外引物(vul-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜堿和4uL ddH2O(滅菌雙蒸水)。
使用上述環(huán)介導等溫擴增方法檢測創(chuàng)傷弧菌的試劑盒檢測創(chuàng)傷弧菌的方法，依次包括下列步驟(1)細菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，棄上清液；B.加入1.0-1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，棄上清液；
C.加入100-150uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10-15分鐘；D.用臺式離心機10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA；(2)創(chuàng)傷弧菌的環(huán)介導等溫擴增A.在裝有23uLLAMP反應液A的反應管中加入1uL待檢模板DNA，于恒溫金屬浴上95℃放置3-5分鐘，立即置于冰上1-3分鐘；B.在反應管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.于恒溫金屬浴上60-65℃放置45-90分鐘；D.將金屬浴調(diào)到80-95℃中止反應，3-5分鐘后取出；(3)顯色檢測在每個反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是創(chuàng)傷弧菌，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品為創(chuàng)傷弧菌。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明建立了創(chuàng)傷弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法，本試劑盒根據(jù)創(chuàng)傷弧菌的基因保守區(qū)的六個序列設計了兩個特異性內(nèi)引物和兩個特異性外引物，以保證檢測不同來源創(chuàng)傷弧菌株的可靠性。本發(fā)明采用環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術，該技術特異性強，與PCR檢測方法有相同的高靈敏度，但不需昂貴的PCR儀，只需普通的金屬浴或水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀察即可，簡單而快速?？捎糜趧?chuàng)傷弧菌的檢測，特別適合于基層醫(yī)療機構以及養(yǎng)殖現(xiàn)場應用。
具體實施例方式
下列實例進一步說明本發(fā)明，但不應該當作對本發(fā)明的限制。
按下列配方制作創(chuàng)傷弧菌的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒(1)LAMP反應液A2.5uL 10×Thermopol反應緩沖液、1.0uL 10mM dNTP(四種脫氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游內(nèi)引物(vul-FIP)、1.0uL 20uM下游內(nèi)引物(vul-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(vul-F3)、0.25uL 20uM下游外引物(vul-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜堿和4uL ddH2O(滅菌雙蒸水)。
(2)Bst DNA聚合酶B濃度為8U/uL。
(3)顯色劑C10％的SYBR GREEN I。
按照以下程序進行檢測
(1)細菌DNA的提取A.取1.0mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液；B.加入1.0mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液；C.加入100uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10分鐘；D.用臺式離心機12000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA。
(2)創(chuàng)傷弧菌的環(huán)介導等溫擴增A.在裝有23uLLAMP反應液A的反應管中加入1uL待檢模板DNA，于恒溫金屬浴上95℃放置5分鐘，立即置于冰上1分鐘；B.在反應管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.于恒溫金屬浴上65℃放置1小時；D.將金屬浴調(diào)到80℃中止反應，3分鐘后取出。
(3)顯色檢測在反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是創(chuàng)傷弧菌，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品為創(chuàng)傷弧菌。
本法快速、特異性強、靈敏度高且成本低。
權利要求
1.一種用環(huán)介導等溫擴增方法檢測創(chuàng)傷弧菌的試劑盒，其試劑包括(1)環(huán)介導等溫擴增反應液A含有10×Thermopol反應緩沖液、300-500uM dNTP、2-4mM硫酸鎂、0.8-1.2uM上游內(nèi)引物、0.8-1.2uM下游內(nèi)引物、0.2-0.3uM上游外引物、0.2-0.3uM下游外引物和1-1.5M甜菜堿；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mM pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mM氯化鉀、100mM硫酸銨、20mM硫酸鎂和1％曲拉通X-100；上游內(nèi)引物為tgccactcggctacgataacgtttttgagctgtcacggcagttg；下游內(nèi)引物為acgcagacaaaacgctcacagtttttgagcttatcgccttcccaat；上游外引物為tggttcggttaacggctg；下游外引物為gccatcaacatagcggctaa；(2)Bst DNA聚合酶B每微升含8個活性單位；(3)顯色劑C為10％的熒光染料SYBR GREEN I。
2.根據(jù)權利要求1中所述用環(huán)介導等溫擴增方法檢測創(chuàng)傷弧菌的試劑盒，其特征是環(huán)介導等溫擴增反應液A每管23uL的組成為2.5uL 10×Thermopol反應緩沖液、1.0uL 10mMdNTP、1.0uL 20uM上游內(nèi)引物、1.0uL 20uM下游內(nèi)引物、0.25uL 20uM上游外引物、0.25uL20uM下游外引物、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜堿和4uL ddH2O。
3.一種使用權利要求1或2中所述的用環(huán)介導等溫擴增方法檢測創(chuàng)傷弧菌的試劑盒檢測創(chuàng)傷弧菌的方法，依次包括下列步驟(1)細菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液，置于1.5mL離心管中，用臺式離心機10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，棄上清液；B.加入1.0-1.5mL滅菌雙蒸水，混勻，用臺式離心機10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，棄上清液；C.加入100-150uL滅菌雙蒸水，混勻，100℃沸水浴10-15分鐘；D.用臺式離心機10000-12000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，取上清液至一個新的1.5mL離心管中，即為待檢模板DNA。(2)創(chuàng)傷弧菌的環(huán)介導等溫擴增A.在裝有23uLLAMP反應液A的反應管中加入1uL待檢模板DNA，于恒溫金屬浴上95℃放置3-5分鐘，立即置于冰上1-3分鐘；B.在反應管中加入1uL Bst DNA聚合酶B；C.于恒溫金屬浴上60-65℃放置45-90分鐘；D.將金屬浴調(diào)到80-95℃中止反應，3-5分鐘后取出；(3)顯色檢測在每個反應管中加入1uL顯色劑C，直接用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢細菌不是創(chuàng)傷弧菌，如顏色變?yōu)榫G色，則說明樣品為創(chuàng)傷弧菌。
全文摘要
涉及一種用環(huán)介導等溫擴增方法檢測創(chuàng)傷弧菌的試劑盒及方法，試劑盒包括環(huán)介導等溫擴增反應液A、Bst DNA聚合酶B、顯色劑C；其中反應液A含有反應緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內(nèi)引物tgccactcggctacgataacgtttttgagctgtcac-ggcagttg、下游內(nèi)引物acgcagacaaaacgctcacagtttttgagcttatcgccttcc-caat、上游外引物tggttcggttaacggctg、下游外引物gccatcaacatagcggctaa和1－1.5M甜菜堿；檢測方法包括細菌DNA的提取、環(huán)介導等溫擴增、顯色檢測等。其優(yōu)點是快速、特異性強、靈敏度高且成本低。
文檔編號C12P19/00GK101020927SQ20071002710
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月9日 優(yōu)先權日2007年3月9日
發(fā)明者任春華, 胡超群, 王青柏, 羅鵬 申請人:中國科學院南海海洋研究所