專利名稱：一種無氧環(huán)境中分離純化綠藻氫酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離純化綠藻氫酶的方法，即在無氧操作袋及層析柱構(gòu)成的無氧環(huán)境中，經(jīng)硫酸銨沉淀，凝膠過濾層析和離子交換層析等步驟分離純化綠藻氫酶。
背景技術(shù)：
綠藻制氫是目前制氫領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。綠藻在光合作用II過程中能將水分解成氧氣、質(zhì)子和電子，電子經(jīng)過光合系統(tǒng)I的電子傳遞鏈及鐵氧化還原蛋白傳遞給氫酶，氫酶將質(zhì)子還原為氫氣。氫酶在這個(gè)過程中起著關(guān)鍵作用，但氫酶對(duì)氧氣非常敏感，在有微量氧氣存在時(shí)就會(huì)失活。近年來，國際上包括美國、德國、荷蘭、法國和日本等國家已經(jīng)從淡水綠藻萊茵衣藻、小球藻、斜生柵藻及海水綠藻綠球藻中分離純化得到幾種鐵氫酶蛋白，對(duì)其進(jìn)行生化、分子遺傳、定向進(jìn)化和活性誘導(dǎo)機(jī)制的研究，已經(jīng)并取得了明顯進(jìn)展。例如aiang 等發(fā)現(xiàn)淡水萊茵衣藻在缺硫連續(xù)光照條件下，由于硫元素的缺乏，使半胱氨酸合成受阻，進(jìn)而導(dǎo)致PS II上的Dl蛋白無法及時(shí)修復(fù)，降低PS II的光化學(xué)活性及產(chǎn)氧量。當(dāng)體系中的產(chǎn)氧速率和呼吸耗氧速率相等時(shí)，就造成了一個(gè)厭氧的環(huán)境，使衣藻的氫酶得以表達(dá)，實(shí)現(xiàn)連續(xù)產(chǎn)氫。但以上氫酶的提取工藝是在巨大的無氧操作裝置中完成，存在以下缺點(diǎn)所有儀器、試劑集中在無氧裝置內(nèi)，導(dǎo)致全部操作步驟均需通過手套進(jìn)行操作，很不方便；每次放入或取出物品均需要通入大量保護(hù)氣，成本很高；若裝置出現(xiàn)泄露現(xiàn)象，里面的氫酶將很快接觸氧氣，無法立即得到有效保護(hù)，會(huì)導(dǎo)致氫酶失活。而將小型無氧操作袋與層析柱串聯(lián)的提取工藝，在國內(nèi)外均未報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種工藝簡單，操作方便，能有效構(gòu)建無氧環(huán)境，用于綠藻氫酶分離純化的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為將小型無氧操作袋與層析柱串聯(lián)起來，構(gòu)建無氧環(huán)境。將試劑、器皿放入無氧操作袋中，所有試劑均加入連二亞硫酸鈉以除去溶氧，用高速珠磨法破碎綠藻細(xì)胞，粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析和離子交換層析純化后，獲得純氫酶。具體操作步驟如下1)取生長對(duì)數(shù)后期，鮮重為IOg藻細(xì)胞，重新懸浮于50_200mL滅菌海水或磷酸緩沖液中，得藻液，置于密閉玻璃瓶中；通氮?dú)?-15min，排除容器中氧氣后，在黑暗中誘導(dǎo) 3-12h ；2)取玻璃瓶于無氧操作袋中，反復(fù)充N2、抽真空三次后，將藻液分裝于密封離心管中，離心濃縮，去上清后重懸于10-15mL Tris-Hcl緩沖液中；在重懸液中加入 5-15g、-20-4°C預(yù)冷玻璃珠，用渦旋震蕩器混旋3-5次破碎綠藻細(xì)胞，每次l-2min，兩次之間在冰上靜置l-2min，然后在0-4°C下離心，取上清棄沉淀；
3)將10-15mL上清液用1Tris-Hcl緩沖液稀釋至15_30mL，緩慢加固體(NH4)2SO4沉淀蛋白，在0-4°C下離心，取上清棄沉淀；4)在步驟(3)離心后獲取的上清液中緩慢加入固體(NH4)2SO4沉淀蛋白，在0-4°C 下離心，收集沉降下的蛋白，重新懸浮于4-8mL Tris-Hcl緩沖液中；5)將4_8mL酶液用蠕動(dòng)泵打入填裝有kphacryl S-100HR的凝膠過濾層析柱中， 用150-300mL Tris-Hcl緩沖液沖洗，采用氣相色譜檢測有氫酶活性的組分；6)將步驟(5)中的有氫酶活性的組分用蠕動(dòng)泵打入填裝有DEAE-khparose CL-6B的離子交換層析柱中，用200-400mL Tris-Hcl緩沖液沖洗，采用氣相色譜檢測收集有氫酶活性的組分，即純綠藻氫酶。Tris-Hcl 緩沖液濃度為 50mM，pH7. 5-8. 5 ；磷酸緩沖液濃度為 50mM，pH7. 0-8. 0。取生長對(duì)數(shù)后期，濃度約l-6X106cells/mL的綠藻，1500_4000r/min離心濃縮 2-5min，倒掉上層海水后，得步驟(1)所用的藻細(xì)胞。步驟(1)中海水綠藻采用滅菌海水重懸，淡水綠藻采用磷酸緩沖液重懸；步驟O)中第一步離心條件為1500-4000r/min，2-5min ；玻璃珠的直徑為 0. 5-lmm ；0-4°C下的離心條件為 10000_12000r/min，IOmin ；步驟(3)中加入固體(NH4)2SO4至30% -50%飽和度；離心條件為13000_16000r/ min,IOmin ；步驟中加入固體(NH4)2SO4至60% -80%飽和度；離心條件為13000_16000r/ min,IOmin ；步驟(6)中先用100-200mL 50mM ρΗ7· 5-8. 5 的 Tris-Hcl 緩沖液沖洗，再用 100-200mL 含有 0. 1-0. 3M Kcl 的 50mM pH7. 5-8. 5 的 Tris-Hcl 緩沖液沖洗。所述試劑滅菌海水或磷酸緩沖液、Tris-Hcl緩沖液均用高純氮?dú)夤臍?-15min， 再加入終濃度20-60mM連二亞硫酸鈉除去溶氧。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1.使用小型無氧操作袋與層析柱串聯(lián)系統(tǒng)，盡量減少使用手套操作的步驟，使操作更加簡易方便。2.縮小了無氧系統(tǒng)的總體積，因而每次取出或放入物品所需沖入的高純氮?dú)怏w積也相應(yīng)減少，降低了分離純化工藝的運(yùn)行成本。3.如果某個(gè)組件發(fā)生泄露，可以迅速斷開與其他組件的連接，及時(shí)避免整個(gè)系統(tǒng)混入氧氣，有利于保護(hù)氫酶活性。4.采用高速珠磨法破碎綠藻細(xì)胞，比超聲法破碎條件溫和，防止超聲功率過大導(dǎo)致蛋白破損；且珠磨法能避免氫酶蛋白因與系統(tǒng)中的微量氧氣接觸而失活。5.先用凝膠過濾層析再用離子交換層析，可以省去透析過夜的步驟，在保證分離效率的前提下，節(jié)省了氫酶的純化時(shí)間。


圖1為本發(fā)明中使用的小型無氧操作袋與層析柱串聯(lián)系統(tǒng)簡圖，其中1.高純氮?dú)馄浚?.真空泵；3.真空閥；4.厭氧操作袋；5.渦旋震蕩器；6.蠕動(dòng)泵；7.層析柱。
具體實(shí)施例方式如無特殊說明，所有步驟均在無氧環(huán)境中進(jìn)行。所建立的小型無氧操作袋與層析柱串聯(lián)系統(tǒng)如圖1所示，將所需儀器、試劑放入?yún)捬醪僮鞔鼉?nèi)后，用真空泵抽除袋內(nèi)空氣，然后通入高純氮?dú)?，反?fù)三次。所有用到的試劑均用高純氮?dú)夤臍?-15min，再加入 20-60mM連二亞硫酸鈉除去溶氧。需要離心的樣品放在配有密封蓋的離心管中，拿出厭氧體系離心。需要層析的樣品用蠕動(dòng)泵打入層析柱中，分離后的組分在另一個(gè)小型無氧操作袋中收集，并檢測活性。氫酶活性的測定方法以50mM磷酸緩沖液(pH6. 8)作為緩沖液，以被連二亞硫酸鈉(Naj2O4)還原的甲基紫精(Methyl viologen,MV)作為電子供體。反應(yīng)系統(tǒng)包括終濃度為IOmM的MV和IOOmM的連二亞硫酸鈉及500 μ 1酶液。在55°C水浴中振蕩孵育20min后， 用氣相色譜檢測氫氣含量。有氫氣生成即證明酶液具有氫酶活性。實(shí)施例1海水亞心形四另藻氫酶分離純化步驟1取生長對(duì)數(shù)后期，濃度約2X IO6ceIlsAiL的亞心形四另藻3L，1500r/min離心濃縮aiiin。倒掉海水后，取鮮重為IOg藻細(xì)胞，重新懸浮于IOOmL滅菌海水中，置于密閉玻璃瓶中。通氮?dú)鈒Omin，排除容器中氧氣后，在黑暗中誘導(dǎo)4h。步驟2將玻璃瓶拿入無氧操作袋中，反復(fù)充N2、抽真空三次后，將藻液分裝于密封離心管中，1500r/min離心3min,去上清后重懸于IOmL 50mM ρΗ7· 9的Tris-Hcl緩沖液中。 在重懸液中加入IOg預(yù)冷玻璃珠(直徑Imm)，用渦旋震蕩器最大強(qiáng)度混旋5次，每次lmin， 兩次之間在冰上靜置lmin。然后在4°C下，10000r/min離心lOmin，取上清棄沉淀。步驟3將上清液稀釋至20mL，緩慢加入固體(NH4)2SO4至50%飽和度，在4°C下， 13000r/min離心lOmin，取上清棄沉淀。步驟4在上清液中緩慢加入固體(NH4)2SO4至80%飽和度，在4°C下，13000r/min 離心lOmin，收集沉降下的蛋白，重新懸浮于5mL 50mmol/LpH7. 9 Tris-Hcl緩沖液中。步驟5將5mL酶液用蠕動(dòng)泵打入填裝有kphacryl S-100HR的凝膠過濾層析柱 ((1.8X90cm)中，用200mL 50mM pH7. 9的Tris-Hcl緩沖液沖洗，按流出液的流出時(shí)間分成 15管進(jìn)行收集，采用氣相色譜檢測有氫酶活性的組分。步驟6將有氫酶活性的凝膠過濾組分用蠕動(dòng)泵打入填裝有DEAE-khparose CL-6B的離子交換層析柱((2 X 13cm)中，先用IOOmL 50mM ρΗ7· 9的Tris-Hcl緩沖液沖洗， 再用IOOmL含有0. IM Kcl的50mM pH7. 9的Tris-Hcl緩沖液沖洗，采用氣相色譜檢測收集有氫酶活性的組分。經(jīng)SDS-PAGE檢測，該組分中含有單一條帶，確定其為亞心形四另藻氫酶。實(shí)施例2淡水萊茵衣藻cclM氫酶分離純化步驟1取生長對(duì)數(shù)后期，濃度約2. 5X IO6ceIlsAiL的萊茵衣藻ccl24 3L,4000r/ min離心濃縮5min。倒掉上清后，取鮮重為IOg藻細(xì)胞，重新懸浮于IOOmL 50mM pH7. 2磷酸緩沖液中，置于密閉玻璃瓶中。通氮?dú)鈒Omin，排除容器中氧氣后，在黑暗中誘導(dǎo)池。步驟2將玻璃瓶拿入無氧操作袋中，反復(fù)充隊(duì)、抽真空三次后，將藻液分裝于密封離心管中，4000r/min離心5min，去上清后重懸于IOmL 50mM pH8. 5的iTris-Hcl緩沖液中。在重懸液中加入IOg預(yù)冷玻璃珠(直徑0. 8mm)，用渦旋震蕩器最大強(qiáng)度混旋5次，每次 lmin，兩次之間在冰上靜置lmin。然后在4°C下，12000r/min離心lOmin，取上清棄沉淀。步驟3將上清液稀釋至20mL，緩慢加入固體(NH4)2SO4至35%飽和度，在4°C下， 16000r/min離心lOmin，取上清棄沉淀。步驟4在上清液中緩慢加入固體(NH4)2SO4至70%飽和度，在4°C下，16000r/min 離心lOmin，收集沉降下的蛋白，重新懸浮于5mL 50mM pH8. 5Tris_Hcl緩沖液中。步驟5將5mL酶液用蠕動(dòng)泵打入填裝有kphacryl S-100HR的凝膠過濾層析柱 ((1.8X90cm)中，用200mL 50mM pH8. 5的Tris-Hcl緩沖液沖洗，按流出液的流出時(shí)間分成 20管進(jìn)行收集，采用氣相色譜檢測有氫酶活性的組分。步驟6將有氫酶活性的凝膠過濾組分用蠕動(dòng)泵打入填裝有DEAE-khparose CL-6B的離子交換層析柱((2 X 13cm)中，先用IOOmL 50mM ρΗ8· 5的Tris-Hcl緩沖液沖洗， 再用IOOmL含有0. 25Μ Kcl的50mMpH8. 5的Tris-Hcl緩沖液沖洗，采用氣相色譜檢測收集有氫酶活性的組分，即萊茵衣藻cclM氫酶。國外相似方法是將所有用到的儀器、裝置放入巨大的無氧裝置中，占地面積大，保護(hù)氣成本高，且操作困難；國內(nèi)尚無相關(guān)技術(shù)報(bào)道。本發(fā)明將無氧操作袋與層析柱串聯(lián)起來，操作簡單易行，且成本較低。
權(quán)利要求
1.一種綠藻氫酶分離純化的方法，其特征在于此分離純化過程始終在無氧環(huán)境中進(jìn)行，采用無氧操作袋與層析柱串聯(lián)系統(tǒng)，將試劑、器皿放入無氧操作袋中，層析柱置于無氧操作袋外部，無氧操作袋與層析柱通過管路串聯(lián)；具體操作步驟如下1)取生長對(duì)數(shù)后期，鮮重為IOg綠藻藻細(xì)胞，重新懸浮于50-200mL滅菌海水或磷酸緩沖液中，得藻液，置于密閉玻璃瓶中；通氮?dú)?-15min，排除玻璃瓶中氧氣后，在黑暗中誘導(dǎo) 3-12h ；2)取玻璃瓶于無氧操作袋中，反復(fù)充隊(duì)抽真空2-6次后，將藻液分裝于密封離心管中， 離心濃縮，去上清后重懸于10-15mL Tris-Hcl緩沖液中；在重懸液中加入5_15g、-20-4°C 預(yù)冷玻璃珠，用渦旋震蕩器混旋3-5次破碎綠藻細(xì)胞，每次l-2min，兩次之間在冰上靜置1-2min，然后在0-4°C下離心，取上清棄沉淀；3)將10-15mL上清液用Tris-Hcl緩沖液稀釋至15_30mL，緩慢加固體(NH4)#04沉淀蛋白，在0-4°C下離心，取上清棄沉淀；4)在步驟(3)離心后獲取的上清液中緩慢加入固體(NH4)2SO4沉淀蛋白，在0-4°C下離心，收集沉降下的蛋白，重新懸浮于4-8mL Tris-Hcl緩沖液中；以上步驟2)-4)均于無氧操作袋中進(jìn)行，所用試劑、器皿均放入無氧操作袋中；5)將4-8mL酶液用蠕動(dòng)泵打入填裝有kphacrylS-100HR的凝膠過濾層析柱中，用 150-300mL Tris-Hcl緩沖液沖洗，采用氣相色譜檢測有氫酶活性的組分；6)將步驟(5)中的有氫酶活性的組分用蠕動(dòng)泵打入填裝有DEAE-khparoseCL-6B的離子交換層析柱中，用200-400mL Tris-Hcl緩沖液沖洗，采用氣相色譜檢測收集有氫酶活性的組分，即純綠藻氫酶。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于取生長對(duì)數(shù)后期，濃度約1-6X IO6ceIlsAiL的綠藻，1500-4000r/min離心濃縮2-5min，倒掉上層海水后，得藻細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)中綠藻為海水綠藻采用滅菌海水重懸，為淡水綠藻采用磷酸緩沖液重懸。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中第一步離心條件為 1500-4000r/min,2-5min ；玻璃珠的直徑為 0. 5-lmm ；0-4°C下的離心條件為 10000_12000r/ min,IOrnin0
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(3)中加入固體(NH4)2SO4至 30% -50%飽和度；離心條件為 13000-16000r/min，lOmin。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中加入固體(NH4)2SO4至 60% -80%飽和度；離心條件為 13000-16000r/min，lOmin。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于Tris-Hcl緩沖液濃度為50mM， pH7. 5-8. 5 ；磷酸緩沖液濃度為 50mM，pH7. 0-8. 0。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(6)中先用100-200mL50mM pH7. 5-8. 5 的 Tris-Hcl 緩沖液沖洗，再用 100_200mL含有 0. 1-0. 3M Kcl 的 5OmM pH7. 5-8. 5 的Tris-Hcl緩沖液沖洗。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述試劑滅菌海水或磷酸緩沖液、Tris-Hcl緩沖液均用高純氮?dú)夤臍?-15min，再加入終濃度20_60mM連二亞硫酸鈉除去溶氧。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種綠藻氫酶分離純化的方法。該方法始終在無氧環(huán)境中進(jìn)行，采用無氧操作袋與層析柱串聯(lián)系統(tǒng)。將試劑、器皿放入無氧操作袋中，所有試劑均加入連二亞硫酸鈉以除去溶氧，用高速珠磨法破碎綠藻細(xì)胞，粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀、凝膠過濾層析和離子交換層析純化后，獲得純氫酶，經(jīng)SDS-PAGE檢測顯示單一條帶。國外相似方法是將所有用到的儀器、裝置放入巨大的無氧裝置中，占地面積大，保護(hù)氣成本高，且操作困難；國內(nèi)尚無相關(guān)技術(shù)報(bào)道。本發(fā)明將無氧操作袋與層析柱串聯(lián)起來，操作簡單易行，且成本較低。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102199577SQ20101013125
公開日2011年9月28日 申請(qǐng)日期2010年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日
發(fā)明者張衛(wèi), 彥飛, 曹旭鵬, 薛松, 陸洪斌, 陳兆安 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所