專利名稱：Dna光修復(fù)酶的純化制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)的純化制備技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及DNA光修復(fù)酶的親和層析純化制備及其活性檢測技術(shù)。
背景技術(shù)：
美國《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.1984，259，6028-6032)指出，DNA光修復(fù)酶是一種分子量約55kD的蛋白質(zhì)，其主要作用是修復(fù)生物體基因組DNA因紫外輻射作用形成的嘧啶二聚體。美國《核酸研究》(Nucleic Acids Res.1994，22，4119-4124)指出，DNA光修復(fù)酶首先在細(xì)菌、昆蟲等一些低等動物體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，隨后又在高等植物、脊椎動物和低等有袋類哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了光修復(fù)酶及其基因，但在高等哺乳動物包括人體內(nèi)，至今為止尚未發(fā)現(xiàn)DNA光修復(fù)酶的存在。
已有文獻(xiàn)報(bào)道不同來源的DNA光修復(fù)酶的純化方法，包括基因克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)、純化制備、活性檢測。現(xiàn)有的DNA光修復(fù)酶純化制備方法，多采用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化方法，即利用該蛋白質(zhì)的溶解度、等電點(diǎn)、帶電荷數(shù)、疏水性等理化特征進(jìn)行分步純化。例如美國《生物化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.1984，259，6028-6032)報(bào)道，在制備大腸桿菌的DNA光修復(fù)酶時(shí)，采用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化方法用基因克隆方法，將大腸桿菌DNA光修復(fù)酶基因構(gòu)建到重組質(zhì)粒，并使該重組質(zhì)粒能在表達(dá)菌株中過量表達(dá)；將過量表達(dá)后的菌液進(jìn)行菌體破碎，離心去除菌體碎片，可溶上清液用硫酸銨沉淀，初步分離蛋白質(zhì)；隨后依次用苯基-瓊脂糖柱層析、羥基磷灰石柱層析、二乙氨乙基-瓊脂糖柱層析、DNA-纖維素柱層析和苯基-瓊脂糖柱層析進(jìn)行分步純化，其分步純化分別依據(jù)的是DNA光修復(fù)酶的疏水性、和羥基結(jié)合能力、帶電荷數(shù)、DNA的結(jié)合能力、以及疏水性。這種純化方法雖然能得到很純的樣品，但其純化步驟繁雜，純化周期長，因純化過程中要多次更換層析柱，使樣品處理過程復(fù)雜、蛋白質(zhì)回收率低，不適合規(guī)?；恐苽涞鞍踪|(zhì)。
據(jù)美國《突變研究》(Mutation Research，1996，363，97-104)報(bào)道，在純化果蠅DNA光修復(fù)酶時(shí)，構(gòu)建一種DNA光修復(fù)酶基因重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，在表達(dá)菌株中過量表達(dá)，菌液經(jīng)破碎、離心后，取可溶性上清液經(jīng)硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，隨后經(jīng)過藍(lán)色-瓊脂糖柱層析和DNA-纖維素柱層析進(jìn)行兩步親和層析純化蛋白質(zhì)，其分離的依據(jù)是，藍(lán)色-瓊脂糖柱基質(zhì)與黃素嘌呤二核苷酸有結(jié)合能力，而DNA-纖維素柱基質(zhì)中的DNA可以與DNA光修復(fù)酶有很強(qiáng)的結(jié)合能力。但是藍(lán)色-瓊脂糖和DNA-纖維素柱基質(zhì)其價(jià)格非常昂貴，在分離過程中也會存在一些非特異性吸附蛋白質(zhì)的影響。
在蛋白質(zhì)的純化研究過程中，逐漸趨向于采用特異性高的親和層析方法。DNA光修復(fù)酶的純化方法也不例外，據(jù)美國《生物化學(xué)雜志》(J.Bio.Chem.1997，272，32591-32598)報(bào)道，在純化非洲爪蛙屬(6-4)光修復(fù)酶時(shí)，是將其基因重組構(gòu)建到一個(gè)含谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的重組質(zhì)粒中，在表達(dá)菌株中過量表達(dá)，其蛋白質(zhì)表達(dá)的產(chǎn)物為羧基端帶有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白質(zhì)，其純化方法可簡單概括如下1、谷胱甘肽-瓊脂糖親和層析柱一步純化得到很純的融合蛋白質(zhì)，2、用凝血酶切除谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，3、用DNA親和柱純化。由于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的分子量約為27kD，嚴(yán)重影響DNA光修復(fù)酶的正常結(jié)構(gòu)和功能，所以必須采用后處理方法將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶去除，后處理即用凝血酶將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶從融合蛋白質(zhì)中切除，而所用的凝血酶價(jià)格昂貴，不利于該蛋白質(zhì)規(guī)?；a(chǎn)。
在現(xiàn)有DNA光修復(fù)酶的活性檢測方法中，電泳檢測方法已是很成熟的一種，如美國《生物化學(xué)》(Biochemistry 1990，29，7715-7727)報(bào)道的電泳檢測方法，其基本過程是先合成一段約50bp的雙鏈DNA片段作為酶底物，該片段必須具備兩個(gè)條件第一，在片段全長中僅有一個(gè)核酸內(nèi)切酶作用位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)一般位于片段中間位置而且包含兩個(gè)相鄰的胸腺嘧啶堿基，第二，相臨的胸腺嘧啶堿基形成嘧啶二聚體。該DNA底物經(jīng)同位素標(biāo)記、DNA光修復(fù)酶修復(fù)，核酸內(nèi)切酶酶切，然后對產(chǎn)物進(jìn)行電泳膠分析，根據(jù)射線計(jì)數(shù)檢測酶切的片段和未酶切的片段的量以測定DNA光修復(fù)酶的活性。這種方法對酶底物要求嚴(yán)格，底物合成困難；同位素標(biāo)記也增加了環(huán)境污染的可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種DNA光修復(fù)酶的純化制備方法，以克服現(xiàn)有方法步驟多、純化層析柱基質(zhì)價(jià)格昂貴、純化后處理繁雜、活性檢測困難、不適宜于規(guī)?；恐苽銬NA光修復(fù)酶的缺陷。
本發(fā)明的DNA光修復(fù)酶的純化制備方法，包括設(shè)計(jì)擴(kuò)增DNA光修復(fù)酶基因的引物、構(gòu)建克隆、菌液培養(yǎng)、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白的親和層析純化以及酶活性檢測；其特征在于以含有DNA光修復(fù)酶基因的生物體的基因組DNA作為模板，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增DNA光修復(fù)酶基因的兩端引物，運(yùn)用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將DNA光修復(fù)酶基因進(jìn)行體外擴(kuò)增，并構(gòu)建到帶有組氨酸-標(biāo)簽的載體質(zhì)粒中；在表達(dá)菌株中用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)2-10個(gè)小時(shí)，收集菌液，將菌液于4000個(gè)重力加速度條件下離心沉淀菌體，用溶菌緩沖液重懸菌體后得到的重懸液于1.4×108帕斯卡高壓破碎菌體，破碎后的菌體液在15000-30000個(gè)重力加速度條件下冷凍離心去除菌體碎片；將離心分離出的上清液加入已結(jié)合鎳離子并用含0.005-0.05mol/l咪唑的緩沖液平衡過的鎳離子親和層析柱內(nèi)，用含0.005-0.05mol/l咪唑的緩沖液洗去不能結(jié)合或非特異性結(jié)合的雜蛋白，再用含0.5-1.0mol/l咪唑的緩沖液或者鎳離子螯合劑洗脫，收集洗脫樣品，透析，冷凍干燥，即得到DNA光修復(fù)酶。
然后對所得到的DNA光修復(fù)酶進(jìn)行活性檢測。
所述的活性檢測，可采用現(xiàn)有的活性檢測方法，如上面已提及的美國《生物化學(xué)》(Biochemistry 1990，29，7715-7727)報(bào)道的電泳檢測方法；也可以采用本發(fā)明特別提出的一種高效液相色譜檢測方法。
本發(fā)明提出的DNA光修復(fù)酶的高效液相色譜法的活性檢測方法，包括先制備含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物，然后將含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物與DNA光修復(fù)酶混合于反應(yīng)緩沖液中用近紫外光照射，得到各不同照射時(shí)間的相應(yīng)產(chǎn)物；其特征在于將DNA光修復(fù)酶與含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物經(jīng)近紫外照射不同時(shí)間的相應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分子-排阻高效液相色譜分析，在線檢測底物單峰的260nm紫外吸收，根據(jù)底物所出的峰，計(jì)算峰面積的變化值，即胸腺嘧啶二聚體的解聚程度，根據(jù)胸腺嘧啶二聚體解聚程度和時(shí)間的比確定DNA光修復(fù)酶的活性。
本發(fā)明制備DNA光修復(fù)酶方法的分離純化原理為利用基因克隆方法將DNA光修復(fù)酶基因構(gòu)建到帶有組氨酸-標(biāo)簽的載體質(zhì)粒中，該重組質(zhì)粒表達(dá)出的DNA光修復(fù)酶比天然DNA光修復(fù)酶的末端多出一段6-10個(gè)組氨酸的結(jié)構(gòu)，稱做組氨酸-標(biāo)簽，這一組氨酸-標(biāo)簽結(jié)構(gòu)可以牢固結(jié)合鎳離子，用含0.5-1.0mol/l咪唑的緩沖液或者鎳離子螯合劑洗脫時(shí)又可以被拆開。根據(jù)這一原理，可以先將鎳離子充分結(jié)合到親和層析柱的基質(zhì)中，將含具有組氨酸-標(biāo)簽的DNA光修復(fù)酶的細(xì)胞破碎上清液與柱基質(zhì)結(jié)合，用含0.005-0.05mol/l咪唑的緩沖液充分沖洗，以洗去不能結(jié)合鎳離子或非特異性結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，然后用含0.5-1.0mol/l咪唑的緩沖液或者鎳離子螯合劑進(jìn)行洗脫，便可以得到非常純的DNA光修復(fù)酶樣品。這段組氨酸-標(biāo)簽的分子量不超過1000道爾頓，它并不影響到DNA光修復(fù)酶的結(jié)構(gòu)和功能。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)過一次親和層析純化可以得到純度達(dá)90％的DNA光修復(fù)酶；經(jīng)DNA光修復(fù)酶的光譜性質(zhì)分析及活性檢測，表明DNA光修復(fù)酶末端連有組氨酸-標(biāo)簽，并不影響其光譜性質(zhì)和功能。
本發(fā)明提出的DNA光修復(fù)酶的高效液相色譜法的活性檢測方法，其原理是以含胸腺嘧啶二聚體的DNA作為底物，無論其胸腺嘧啶二聚體是否被解聚，其分子量是不變的，所以進(jìn)行分子-排阻高效液相色譜檢測時(shí)，它們的分子-排阻效應(yīng)是相同的，即在相同高效液相色譜條件下它們的出峰時(shí)間是相同的；胸腺嘧啶二聚體在260nm處沒有吸收峰，而解聚成胸腺嘧啶單體在260nm處有吸收峰，可利用高效液相色譜的操作和分析軟件計(jì)算底物吸收峰的峰面積，該峰面積的變化值反映了胸腺嘧啶二聚體的解聚程度，故可根據(jù)胸腺嘧啶二聚體解聚程度和時(shí)間的比來確定DNA光修復(fù)酶的活性。
與現(xiàn)有DNA光修復(fù)酶的純化制備方法相比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、采用親和層析方法純化DNA光修復(fù)酶，可以減少分離步驟，一步純化就能達(dá)90％的純度，克服了傳統(tǒng)方法純化方法的步驟繁雜、周期長，純化過程中蛋白質(zhì)易丟失或時(shí)間長引起蛋白質(zhì)變性的缺陷。
2、現(xiàn)有谷胱甘肽-瓊脂糖柱層析方法在一步純化得到帶有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的DNA光修復(fù)酶后，因?yàn)楣入赘孰?S-轉(zhuǎn)移酶分子量大，影響到DNA光修復(fù)酶的結(jié)構(gòu)和功能，必須用凝血酶切除谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，而組氨酸-標(biāo)簽分子量小，不會影響到DNA光修復(fù)酶的結(jié)構(gòu)和功能，故本發(fā)明中經(jīng)過一步親和層析純化后不需要類似的后處理，全程操作簡單。
3、本發(fā)明制備方法采用的鎳離子親和層析柱基質(zhì)價(jià)格相對便宜，與帶有組氨酸-標(biāo)簽的DNA光修復(fù)酶結(jié)合能力強(qiáng)，分離效果好，更適用于DNA光修復(fù)酶產(chǎn)業(yè)化制備。
4、若采用本發(fā)明提出的高效液相色譜法對DNA光修復(fù)酶進(jìn)行活性檢測，其優(yōu)點(diǎn)是對酶底物要求簡單，只要10-20聚的脫氧胸腺嘧啶核苷酸，高效液相色譜儀是非常精密的儀器，根據(jù)樣品的色譜檢測圖的變化能準(zhǔn)確檢測其活性，克服了現(xiàn)有的活性檢測方法對酶底物要求高、步驟繁雜、實(shí)驗(yàn)操作難、同位素操作會造成環(huán)境污染等缺陷。


圖1為大腸桿菌DNA光修復(fù)酶的蛋白質(zhì)電泳檢測圖。
圖2為大腸桿菌DNA光修復(fù)酶的紫外-可見光掃描光譜圖(350-550nm)。
圖3為大腸桿菌DNA光修復(fù)酶的紫外-可見光掃描光譜圖(520-620nm)。
圖4為大腸桿菌DNA光修復(fù)酶的熒光發(fā)射光譜圖。
圖5為16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物經(jīng)紫外照射不同時(shí)間所得產(chǎn)物的紫外-可見掃描光譜圖。
圖6為70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物被光修復(fù)酶解聚不同時(shí)間產(chǎn)物的紫外-可見掃描光譜圖。
圖7為光照聚合前的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物標(biāo)樣的高效液相色譜圖。
圖8為70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物標(biāo)樣的高效液相色譜圖。
圖9為70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物隨DNA光修復(fù)酶解聚1分鐘的反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相色譜圖。
圖10為70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物隨DNA光修復(fù)酶解聚1小時(shí)的反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相色譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1大腸桿菌DNA光修復(fù)酶的純化制備一、帶有組氨酸-標(biāo)簽的大腸桿菌DNA光修復(fù)酶的獲得以大腸桿菌k12菌株的基因組DNA為模板，按照DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物設(shè)計(jì)的一般原理，設(shè)計(jì)出大腸桿菌DNA光修復(fù)酶基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物。
1類引物5’cg cat atg aca act cac cta gtt tgg ttc cgc 3’5’cg cat atg acg aca cat ctc gta tgg ttt cgc 3’5’cg cat atg act acc cat ctg gtc tgg ttt cgc 3’5’cg cat atg acc acg cac ctt gtg tgg ttc cgc 3’2類引物5’gtg ctc gag ttt ccc ctt ccg cgc cgc ctc a 3’5’gtg ctc gag ttc cct tta cca cgt cgt tta g 3’5’gtg ctc gag ttc cca cta ccc cgg cgt ttc t 3’5’gtg ctc gag ttt ccg tta cct cga cgc cta c 3’利用這兩類中各-個(gè)引物形成一對引物對k12大腸桿菌的基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增，根據(jù)重組基因的構(gòu)建一般原理構(gòu)建到pET-22b(+)載體質(zhì)粒中，該重組質(zhì)粒表達(dá)的DNA光修復(fù)酶比天然DNA光修復(fù)酶羧基端多出6個(gè)組氨酸的組氨酸-標(biāo)簽。
該重組質(zhì)?？梢栽诋惐?β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)下在大腸桿菌表達(dá)菌株中高效表達(dá)，蛋白質(zhì)表達(dá)可以通過菌液總蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺蛋白質(zhì)凝膠電泳進(jìn)行檢測。電泳檢測結(jié)果如圖1，其電泳方向是從上至下，其中，第1列是14-97kD的低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品，其六條帶表示的分子量分別是14、20、31、43、66、97kD，第3列是含空載體質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)總蛋白質(zhì)的樣品，第4列是含重組質(zhì)粒的大腸桿菌不經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)總蛋白質(zhì)的樣品，第5列是含重組質(zhì)粒的大腸桿菌經(jīng)過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)總蛋白質(zhì)的樣品?？梢钥闯龊蛰d體質(zhì)粒的表達(dá)菌株不表達(dá)DNA光修復(fù)酶，含重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株在沒有經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)時(shí)只很少量表達(dá)DNA光修復(fù)酶，但經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)能大量表達(dá)DNA光修復(fù)酶。
二、親和層析法純化DNA光修復(fù)酶1.實(shí)驗(yàn)操作含重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)3個(gè)小時(shí)，收集菌液，4000g離心沉淀菌體，用溶菌緩沖液重懸菌體，20000psi高壓破碎菌體，16000g冷凍離心去除菌體碎片，離心后的上清便可以用于親和層析分離，其中溶菌緩沖液為0.05M NaCl、0.02M Tris-HCl(PH7.4)、0.01M巰基乙醇、10％甘油。
親和層析柱的準(zhǔn)備和重組蛋白質(zhì)的純化1)親和層析柱基質(zhì)1ml，裝填于5ml層析柱中，用5ml雙蒸水沖洗膠。
2)加入1ml 0.1M硫酸鎳，使鎳離子與膠充分結(jié)合。
3)用5ml雙蒸水洗去未結(jié)合的硫酸鎳。
4)用5ml的含0.01M咪唑的起始緩沖液平衡膠，該起始緩沖液的組成為0.01M咪唑、0.5M NaCl、0.02M Tris-HCl(PH7.4)、0.01M巰基乙醇、10％甘油。
5)加入10ml菌液破碎上清于膠面上，搖勻或讓上清液過柱，使DNA光修復(fù)酶充分結(jié)合膠，流出液體。
6)用20ml含0.01mol/l咪唑的起始緩沖液洗膠去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)。
7)用含0.5mol/l咪唑的洗脫緩沖液洗脫蛋白質(zhì)，分管收集洗脫樣品，洗脫緩沖液的組成為0.5M咪唑、0.5M NaCl、0.02M Tris-HCl(PH7.4)、0.01M巰基乙醇、10％甘油。
8)洗脫的樣品對樣品緩沖液透析，樣品緩沖液的組成為0.05M NaCl、0.02M Tris-HCl(PH7.4)、0.01M二硫蘇糖醇、0.001M EDTA、10％甘油。
2.DNA光修復(fù)酶的純度及分子量測定將純化的DNA光修復(fù)酶進(jìn)行聚丙烯酰胺蛋白質(zhì)凝膠電泳檢測，其檢測結(jié)果圖見附圖1，其電泳方向是從上至下，第1列是低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)樣，其中六條帶表示的分子量分別是14、20、31、43、66、97kD，第2列是經(jīng)親和層析一步純化得到的DNA光修復(fù)酶，其分子量約為55kDa。根據(jù)密度掃描分析結(jié)果，可以看出經(jīng)過親和層析一步純化可得到85-95％純度的DNA光修復(fù)酶。
三、帶有組氨酸標(biāo)簽的大腸桿菌DNA光修復(fù)酶的光譜性質(zhì)分析1.實(shí)驗(yàn)儀器美國貝克曼公司(Beckman Du600 ultraspectrometer)生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì)；美國熱電公司生產(chǎn)的熒光分光光度計(jì)。
2.實(shí)驗(yàn)樣品DNA光修復(fù)酶樣品，1mg/ml；對照樣品樣品緩沖液3.測定方法按照儀器使用說明書進(jìn)行操作.
4.結(jié)果分析圖2和圖3分別給出了DNA光修復(fù)酶在350-550nm和520-620nm波長范圍的吸收掃描譜，圖中的橫坐標(biāo)是波長，縱坐標(biāo)是光吸收值，由其紫外-可見掃描光譜可觀察到樣品在379、444、465、582nm處存在吸收峰值，379nm的吸收光譜主要是由次甲基四氫葉酸發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生，444、465、582nm處的吸收峰是由黃素腺嘌呤二核苷酸提供，這與美國《生物化學(xué)雜志》報(bào)道的結(jié)果相同(J.Biol.Chem.1987，262，486-491)。圖4給出了DNA光修復(fù)酶的熒光發(fā)射光譜，其橫坐標(biāo)是發(fā)射波長，縱坐標(biāo)為熒光發(fā)射相對強(qiáng)度，可以看出，在366nm波長激發(fā)，得到的熒光發(fā)射光譜在438nm和535nm處有明顯的峰尖，400-500nm寬區(qū)域的峰是由次甲基四氫葉酸產(chǎn)生，535nm處的激發(fā)峰由黃素腺嘌呤二核苷酸產(chǎn)生，這與美國《生物化學(xué)》雜志報(bào)道的結(jié)果相同(Biochemistry.1990，29，552-561)。
四、帶有組氨酸標(biāo)簽的大腸桿菌DNA光修復(fù)酶的活性測定1.寡聚核苷酸底物的制備采用由上海生工生物工程有限公司合成的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物，用無菌雙蒸水將底物配成濃度為100μM的儲備液，儲存于-20℃。
將儲備液放置于玻璃核磁管中，用高純氬氣充氣鼓泡，使其達(dá)到飽和氬氣狀態(tài)，封緊管口；在水浴中用300瓦高壓汞燈以5厘米燈距對底物進(jìn)行光照，分別光照0、30、60、180、300分鐘；將光照不同時(shí)間的底物做紫外-可見掃描光譜分析。
圖5給出了16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物經(jīng)紫外照射不同時(shí)間所得產(chǎn)物的紫外-可見光掃描光譜圖，其橫坐標(biāo)是波長，縱坐標(biāo)是光吸收值，圖中掃描峰a、b、c、d、e分別表示16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物紫外光照0、30、60、180、300分鐘后產(chǎn)物的吸收峰?？梢钥闯?，按以上條件，16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物隨著高壓汞燈紫外照射時(shí)間的延長，272nm吸光值不斷下降，表明其經(jīng)紫外照射，底物分子不斷發(fā)生胸腺嘧啶聚合，生成沒有紫外吸收的環(huán)丁烷胸腺嘧啶聚合體，隨著照射時(shí)間的延長，底物發(fā)生胸腺嘧啶堿基聚合程度增加。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，紫外光照的結(jié)果并不是所有的胸腺嘧啶都形成二聚體，而是或多或少存在沒有聚合的胸腺嘧啶單體，而單體是有吸收峰的，在光照5個(gè)小時(shí)后，其吸收峰基本穩(wěn)定，即胸腺嘧啶堿基聚合基本達(dá)到飽和狀態(tài)，高效液相色譜檢測結(jié)果表明該狀態(tài)下胸腺嘧啶的聚合程度是70％，下面的實(shí)驗(yàn)就是以這種狀態(tài)的底物作為DNA光修復(fù)酶修復(fù)的底物，并稱作70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物。
2.DNA光修復(fù)酶的活性測定反應(yīng)體系由0.05M NaCl、0.02M Tris-HCl、0.01M二硫蘇糖醇、5％甘油、0.001M EDTA組成的PH為7.4的反應(yīng)緩沖液中，加入1-10μM的DNA光修復(fù)酶和1-5μM70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物。
將3.5毫升的反應(yīng)體系，放置于4毫升石英比色皿中，高純氬氣充氣達(dá)飽和氬氣狀態(tài)，封緊管口，分別在近紫外燈(365nm波長為主)以5厘米燈距，照射不同時(shí)間，并以反應(yīng)緩沖液為對照，做紫外-可見光譜分析。圖6給出了70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物被光修復(fù)酶解聚不同時(shí)間產(chǎn)物的紫外-可見掃描光譜圖，其橫坐標(biāo)是波長，縱坐標(biāo)是光吸收值，圖中峰f、g、h、i、j、k分別表示相同反應(yīng)體系在近紫外光照射0、1、2、3、4、5分鐘。從該圖中可看出，隨著近紫外光照射時(shí)間的增長，反應(yīng)體系在272nm處光吸收值連續(xù)增加，表明DNA光修復(fù)酶在近紫外光的激活下，對70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物有解聚功能，能打開胸腺嘧啶二聚體，使其重新恢復(fù)正常的胸腺嘧啶單體，從而使272nm吸收峰增加。
3.高效液相色譜對反應(yīng)產(chǎn)物的分析1)以沃特斯600泵、沃特斯2487雙波長紫外檢測器及Millennium32操作和分析軟件構(gòu)成高效液相色譜體系。層析柱采用沃特斯公司生產(chǎn)的型號為WAT084601，Protein PAK125的凝膠柱，該柱的分子截留范圍是2000-80000Da 7.8×300mm Column。分離條件洗脫液為0.02M醋酸銨(PH6.0)，流速為0.75ml/min；進(jìn)行260nm單波長紫外在線檢測，得到高效液相色譜圖。
2)聚合前后16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物標(biāo)樣的高效液相色譜分析圖7給出了16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物的高效液相色譜圖譜，其橫坐標(biāo)是時(shí)間，縱坐標(biāo)是260nm光吸收值，樣品于9.2分鐘出峰，為峰l。
圖8給出了70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物的高效液相色譜圖譜，其橫坐標(biāo)是時(shí)間，縱坐標(biāo)是260nm光吸收值，樣品于9.2分鐘出峰，為峰m。
從上述高效液相色譜圖可以看出①光照聚合前后的底物的出峰時(shí)間是一致的，表明二者的分子量是一致的。②光照聚合前底物的260nm吸收峰面積明顯大于光照聚合后的底物，利用Millennium32分析軟件可計(jì)算出光照前后底物的峰面積之間比例，從而能計(jì)算出單體變成二聚體的轉(zhuǎn)化率，約為70％左右。③光照前后底物的出峰時(shí)間的一致性和峰高、峰面積的明顯差異，可以作為檢測DNA光修復(fù)酶作用活性的依據(jù)，即加入DNA光修復(fù)酶作用不同時(shí)間，樣品用同樣條件做高效液相色譜圖分析，觀察在9.2分鐘位置的峰高和峰面積的變化趨勢，該峰面積的變化值代表了胸腺嘧啶二聚體經(jīng)DNA光修復(fù)酶解聚的程度，根據(jù)解聚程度和反應(yīng)時(shí)間的比來確定DNA光修復(fù)酶的活性。
3)有了以上標(biāo)樣的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，便可以對DNA光修復(fù)酶解聚不同時(shí)間的底物進(jìn)行分析，并可以根據(jù)圖譜變化趨勢來直觀判斷和檢測DNA光修復(fù)酶的活性。
將0.4毫升的反應(yīng)體系，放置于2.5毫升核磁玻璃管中，高純氬氣充氣達(dá)飽和氬氣狀態(tài)，封緊管口，在近紫外燈(365nm波長為主)以5厘米燈距，分別照射不同時(shí)間；隨后沸水浴5分鐘，15000g離心10分鐘，上清用來做高效液相色譜分析。
圖9給出了70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物隨DNA光修復(fù)酶解聚1分鐘反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相色譜圖，其橫坐標(biāo)是時(shí)間，縱坐標(biāo)是260nm光吸收值，樣品同樣在9.2分鐘出現(xiàn)峰，為峰n。
圖10給出了70％聚合的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物隨DNA光修復(fù)酶解聚1小時(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的高效液相色譜圖，其橫坐標(biāo)是時(shí)間，縱坐標(biāo)是260nm光吸收值，樣品同樣在9.2分鐘出現(xiàn)峰，為峰o。
4)結(jié)果分析因?yàn)榉錶是沒有光照聚合的底物，故可以認(rèn)為是完全解聚狀態(tài)。利用Millennium32分析軟件分別對峰l、m、n、o進(jìn)行面積積分，并以峰l認(rèn)為100％解聚，可得到峰m、n、o分別為30％、47％、85％解聚，從而可以看出DNA光修復(fù)酶作用前后和不同作用時(shí)間對底物解聚程度的影響，尤其是在DNA光修復(fù)酶作用1小時(shí)后，底物可達(dá)到85％的解聚程度。
結(jié)合以上的紫外-可見掃描法和高效液相色譜法，都可以看出，在DNA光修復(fù)酶的作用下，光照聚合后的16聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸底物能被明顯的解聚，即DNA光修復(fù)酶具有很強(qiáng)的修復(fù)環(huán)丁烷嘧啶二聚體活性。
權(quán)利要求
1.一種DNA光修復(fù)酶的純化制備方法，包括設(shè)計(jì)擴(kuò)增DNA光修復(fù)酶基因的引物、構(gòu)建克隆、菌液培養(yǎng)、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白的親和層析純化以及酶活性檢測；其特征在于以含有DNA光修復(fù)酶基因的生物體的基因組DNA作為模板，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增DNA光修復(fù)酶基因的兩端引物，運(yùn)用DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將DNA光修復(fù)酶基因進(jìn)行體外擴(kuò)增，并構(gòu)建到帶有組氨酸-標(biāo)簽的載體質(zhì)粒中；在表達(dá)菌株中用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)2-10個(gè)小時(shí)，收集菌液，將菌液于4000個(gè)重力加速度條件下離心沉淀菌體，用溶菌緩沖液重懸菌體后得到的重懸液于1.4×108帕斯卡高壓破碎菌體，破碎后的菌體液在15000-30000個(gè)重力加速度條件下冷凍離心去除菌體碎片；將離心分離出的上清液加入已結(jié)合鎳離子并用含0.005-0.05mol/l咪唑的緩沖液平衡過的鎳離子親和層析柱內(nèi)，用含0.005-0.05mol/l咪唑的緩沖液洗去不能結(jié)合或非特異性結(jié)合的雜蛋白，再用含0.5-1.0mol/l咪唑的緩沖液或者鎳離子螯合劑洗脫，收集洗脫樣品，透析，冷凍干燥；然后對所得到的DNA光修復(fù)酶進(jìn)行活性檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA光修復(fù)酶的純化制備方法，特征在于，所述對DNA光修復(fù)酶的活性檢測方法采用高效液相色譜法即，先制備含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物，然后將含胸腺嘧啶二聚體的DNA底物與DNA光修復(fù)酶混合于反應(yīng)緩沖液中用近紫外光照射，得到各不同照射時(shí)間的相應(yīng)產(chǎn)物；經(jīng)分子-排阻高效液相色譜分析，在線檢測底物單峰的260nm紫外吸收，根據(jù)底物所出的峰，計(jì)算峰面積的變化值，即胸腺嘧啶二聚體的解聚程度；根據(jù)胸腺嘧啶二聚體解聚程度和時(shí)間的比確定DNA光修復(fù)酶的活性。
全文摘要
本發(fā)明DNA光修復(fù)酶的純化制備方法，特征是先利用基因工程方法獲得帶有組氨酸－標(biāo)簽的大腸桿菌DNA光修復(fù)酶，經(jīng)鎳離子親和層析柱親和層析，可一步純化制備得到近90％純度的DNA光修復(fù)酶，克服了現(xiàn)有純化方法步驟繁雜、周期長、后處理麻煩、純化過程中蛋白質(zhì)易丟失或時(shí)間長引起蛋白質(zhì)變性的缺陷；采用的鎳離子親和層析柱基質(zhì)價(jià)格相對便宜，分離效果好，適用于DNA光修復(fù)酶產(chǎn)業(yè)化制備。本發(fā)明提出的采用高效液相色譜法檢測DNA光修復(fù)酶的活性，可克服現(xiàn)有活性檢測方法對酶底物要求高、步驟繁雜、實(shí)驗(yàn)操作難、環(huán)境污染的缺陷。本發(fā)明為預(yù)防和治療紫外線對人體的傷害開辟了新的途徑，并為紫外線防護(hù)產(chǎn)業(yè)展示了新的前景。
文檔編號C12Q1/25GK1624118SQ200310106550
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月5日
發(fā)明者王玉珍, 章東方, 沐萬孟, 俞書勤, 宋欽華, 羅昭鋒, 于宙, 婁陽, 徐蕾 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)