專利名稱：對hsp90-抑制劑的易感性的制作方法
對HSP90-抑制劑的易感性本項發(fā)明涉及一種挑選對HSP90抑制劑具有易感性的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的方法。另外還描述了一種測定哺乳動物的腫瘤細(xì)胞或者癌細(xì)胞對HSP90抑制劑治療的反應(yīng)情況的方法。尤其是，本項發(fā)明提供了一種體外診斷方法以篩選出那些對HSP90抑制劑具有易感性的患者，其中包括應(yīng)用可以用于檢測KRAS基因中激活性突變的寡核苷酸或者多聚核苷酸。本項發(fā)明還涉及對一種癌癥的療效進(jìn)行檢測評估或監(jiān)測的方法，此類癌癥以 KRAS基因中至少出現(xiàn)一處激酶激活性突變?yōu)樘卣?，也可能但非必須在EGFR和/或者BRAF 基因中也至少出現(xiàn)一處激活性突變。此外，還介紹了一種對癌癥尤其是具有上述基因突變特征的癌癥的療效進(jìn)行預(yù)測的方法。最后，應(yīng)用具有上述基因突變特征的(轉(zhuǎn)基因)非人類動物模型或者(轉(zhuǎn)基因)細(xì)胞模型對抗癌藥物進(jìn)行篩選和/或者驗證，并提供了一套可以實現(xiàn)上述各種檢測功能的試劑盒?，F(xiàn)階段，人們正試圖對各種主要癌癥類型的基因組進(jìn)行完全注釋標(biāo)記，而這正與 “人類基因組計劃”的工作有所關(guān)聯(lián)；因此在不久的將來，分析體細(xì)胞的基因拷貝數(shù)變化和與癌癥有關(guān)的基因突變(這里兩者統(tǒng)稱為病變)可以為我們提供與人類癌癥相關(guān)的遺傳圖譜。在治療遺傳學(xué)定義的腫瘤方面，分子靶向的治療方法已經(jīng)取得了不少成功以ERBB2/ Her2基因為靶點(diǎn)的曲妥珠單抗可以縮小因ERBB2基因擴(kuò)增而罹患乳腺癌的婦女體內(nèi)的腫瘤(Slamon等，2001)；在攜帶BCR/ABL轉(zhuǎn)位的慢性粒細(xì)胞白血病患者(Druker等，2001a ； Druker等，2001b)和帶有KIT基因突變或者PDGFRA基因突變(Heinrich等，200 的胃腸道間質(zhì)瘤和黑色素瘤患者(見Hodi等，NEJM，2008)體內(nèi)，ABL/KIT/PDGFR基因抑制劑伊馬替尼可以誘導(dǎo)有效的藥物反應(yīng)；最后，由EGFR基因突變導(dǎo)致的肺癌對EGFR基因抑制劑吉非替尼和埃羅替尼具有高度敏感性(Lynch等，2004 ；I3aez等，2004 ；Pao等，2004)；這些成功的例子足以說明前述遺傳標(biāo)記工作在臨床治療方面的意義。在絕大多數(shù)情況下，此類抑制劑的療效都是在臨床試驗完成后被發(fā)現(xiàn)的，然而目前尚無固定的機(jī)制可以依循，于是人們無法在對患者進(jìn)行臨床試驗之前系統(tǒng)性地鑒定出導(dǎo)致特定原癌基因依賴性的“損傷”。另一方面，靶點(diǎn)導(dǎo)向療法常常依賴于某個癌基因激活的信號通路，因此被認(rèn)為與癌癥當(dāng)中發(fā)生的體細(xì)胞遺傳背景改變(損傷)具有因果效應(yīng)。然而，目前還沒有辦法可以系統(tǒng)性地將此類“損傷”與治療靶點(diǎn)聯(lián)系起來。K-Ras蛋白是一個與細(xì)胞分裂調(diào)節(jié)有關(guān)的GTP酶。攜帶KRAS基因突變的癌癥患者(例如，非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、腦瘤、小兒腫瘤、肉瘤等)不僅預(yù)后發(fā)展很差，而且生存率極低。由于無法有效地治療這些病癥，鑒定出攜帶KRAS基因突變的腫瘤/腫瘤細(xì)胞對之具有易感性的藥物/化合物便成了當(dāng)務(wù)之急， 尤其是迫切需要在臨床試驗開始/完成之前鑒定出來以避免用人體試驗。本說明所說的 “KRAS”指的是K-Ras、k-ras以及類似的字母組合，并且它們都被作為同義詞使用。然而， “KRAS”多數(shù)情況下是指編碼K-feis GTP酶的基因，而詞組“K-ras”、“K-feiS”或者“K-RAS” 多數(shù)情況下是指該基因編碼的蛋白。為了鑒定攜帶上述KRAS基因突變的腫瘤/腫瘤細(xì)胞對之具有易感性的藥物/化合物，相應(yīng)的癌細(xì)胞系經(jīng)常被用在鑒定試驗當(dāng)中；但是這些廣為使用的細(xì)胞模型其可靠性
5和臨床適用性受到了一些質(zhì)疑。另外，細(xì)胞系的遺傳背景不穩(wěn)定并且經(jīng)常發(fā)生改變，因此對各種原發(fā)腫瘤的代表性可能會差一些。再一點(diǎn)，組織病理學(xué)定義的各類腫瘤其遺傳多樣性通常較為復(fù)雜；例如臨床診斷的腫瘤“非小細(xì)胞肺癌”(NSCLC)包括攜帶EGFR基因或者KRAS 基因突變的肺腺癌和攜帶KRAS基因突變的鱗狀上皮細(xì)胞肺癌。因此，任何一個代表性的臨床前模型都需要把握原發(fā)腫瘤病變的本質(zhì)以及這些病變在以組織病理學(xué)定義的人群里的分布。最近有文獻(xiàn)報道證明了癌細(xì)胞系在臨床前藥物靶點(diǎn)驗證試驗中的作用(Lin等， 2008 ；McDermott等，2007 ；Neve等，2006 ；Solit等，2006)。但是，這些研究均有不足之處， 它們或者使用了多個腫瘤來源的癌細(xì)胞系(Solit等，2006)，或者只著力于對癌細(xì)胞系進(jìn)行大尺度上的基因組分析(Lin等，2008)，又或者僅僅通過建立高通量細(xì)胞系譜來尋找對腫瘤抑制劑具有強(qiáng)烈易感性的細(xì)胞系而忽視了對細(xì)胞系進(jìn)行基因組分析(McDermott等， 2007)。另一方面，由于具有抗癌作用的化合物/藥物往往只能在臨床試驗結(jié)束后才能被鑒定出來，因此不僅費(fèi)時，而且成本很高。同時，一個特定的腫瘤體(例如“肺癌”)可能是由具有不同遺傳譜和/或者轉(zhuǎn)錄譜特征的多種腫瘤組成；所以，即便是“同一個”腫瘤(來自同一個腫瘤體的不同腫瘤，例如肺癌)也不一定能用同一種藥物/化合物進(jìn)行治療。因此， 找出特定類型的腫瘤對特定藥物/化合物的易感性的“標(biāo)記”或者“預(yù)測器”，將會使患有同一種癌癥的更多患者從中受益。因此，本項發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供用于評價細(xì)胞尤其是腫瘤細(xì)胞對于抗腫瘤治療的敏感性和反應(yīng)性的手段和方法。此技術(shù)問題在權(quán)利要求書的實施方案中得到解決。因此，本項發(fā)明涉及一種挑選對HSP90抑制劑具有易感性的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的方法，主要步驟有(a)在待檢測細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞中確認(rèn)至少存在一處KRAS 基因突變；(b)挑選出這些攜帶有至少一處KRAS基因突變的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞。本方法還可以包括其他步驟(i)用HSP90抑制劑接觸待測細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞；(ii)檢測這些接觸了 HSP90抑制劑的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的存活率。需要注意的是，步驟(i) 和(ii)可以在步驟(a)之前進(jìn)行，也可以在步驟(a)之后或者步驟(b)之后進(jìn)行。以上步驟(i)和(ii)尤其可作為證明挑選出的攜帶有KRAS基因突變的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞在存活率上對HSP90抑制劑具有易感性的進(jìn)一步實驗證據(jù)。這些KRAS基因突變最好是“激活性基因突變“。本文所指的“細(xì)胞、組織和培養(yǎng)細(xì)胞”不僅限于分離的細(xì)胞、組織和培養(yǎng)細(xì)胞，也包括使用的各種樣品，亦即由含有這些細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的液體所構(gòu)成的生物學(xué)的、醫(yī)學(xué)的或者病理學(xué)的液體樣品。另外，此種樣品液體可能是體液或者排出物，也可以是一種培養(yǎng)物，例如取自細(xì)胞培養(yǎng)或者組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基。體液可以包括血液、血清、血漿、尿液、唾液、關(guān)節(jié)液、脊髓液、腦脊液、淚液、糞便以及其他類似物但不僅限于以上各項。因此，本項發(fā)明的關(guān)鍵點(diǎn)在于提供一種測定特定的細(xì)胞、組織或者組織細(xì)胞(或者培養(yǎng)細(xì)胞或者培養(yǎng)細(xì)胞中的單個細(xì)胞，或者如下所述來自某一生物學(xué)/醫(yī)學(xué)/病理學(xué)樣品的細(xì)胞)對于HSP90抑制劑抗癌或抗增生處理的敏感性的方法。正如在附加例子中所描述的，我們很意外地發(fā)現(xiàn)，在KRAS基因中帶有一處激活性突變的細(xì)胞對HSP90抑制劑的處理格外敏感。同時，我們的在體實驗例子也表明HSP90抑制劑能成功地用于治療與KRAS基
6因相關(guān)的或者由其引發(fā)的癌癥，例如KRAS基因驅(qū)動的肺腺癌，即在KRAS基因中帶有一處激活性突變的癌癥。所以，本項發(fā)明不僅解決了挑選出對HSP90抑制劑具有易感性的細(xì)胞/組織/培養(yǎng)細(xì)胞的問題，還提供了一種方法來評估一個患病的人或者動物個體在用HSP90抑制劑進(jìn)行抗癌或者抗增生治療時可能的藥物反應(yīng)。本項發(fā)明不僅為挑選出對HSP90抑制劑處理具有易感性的細(xì)胞、組織和培養(yǎng)細(xì)胞提供了可能性(也就是說，本項發(fā)明所使用的研究手段可以用于新型HSP90抑制劑的性能測試，或者用于篩選與HSP90抑制劑具有相同功能的其他化合物)，也可以用于評價HSP90抑制劑療法對一個需要治療和預(yù)防增生性疾病的特定 (人類)患者是否有效。在最優(yōu)化方案中，患者對以下幾種HSP90抑制劑的藥物反應(yīng)得到了檢測格爾德霉素(geldanamycin)或者其衍生物，尤其是17-AAG或者IPI-504。這些連同其他一些可以被檢測的HSP90抑制劑將在后文給予詳細(xì)說明。在挑選出對HSP90抑制劑有響應(yīng)性的細(xì)胞或者患者的過程中，需要先找出在KRAS 基因中至少帶有一處突變的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞。這些細(xì)胞/組織可以取自某一人的樣品或者是含有至少一個這樣的細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)的體液樣品；如這樣的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞中KRAS基因含有激活性突變，則表明此細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞對HSP90抑制劑有易感性，即能夠被HSP90抑制劑有效地殺死。這里所說的“激活性突變”是指某一基因 (尤其是KRAS基因)中的一處突變，而這個突變導(dǎo)致了該基因的相應(yīng)產(chǎn)物、也就是蛋白(尤其是KRAS蛋白)的活性提高。檢測蛋白尤其是KRAS蛋白(提高的)活性的方法在相關(guān)技術(shù)領(lǐng)域中已廣為人知，后文也將予以闡述。另外，后文還將介紹KRAS基因中典型的(激活性)突變；再重復(fù)一次，本發(fā)明的方法中優(yōu)先使用“(激活性)突變”。正如上文以及備選實施方案所指的，本項發(fā)明主要涉及一種測定哺乳動物腫瘤細(xì)胞或者癌細(xì)胞對HSP90抑制劑處理的藥物反應(yīng)情況的方法，此方法需要在相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中鑒別出KRAS基因至少一處突變，并且以這種突變來標(biāo)示該細(xì)胞是否可能對抑制劑處理有所響應(yīng)。這樣一個測定的過程可以在分離的單一腫瘤細(xì)胞上實現(xiàn)，也可用于檢測諸如體液、分離的機(jī)體組織樣品以及與之類似的各類生物學(xué)/醫(yī)學(xué)/病理學(xué)樣品，并且這些樣品往往含有待分析的細(xì)胞或者細(xì)胞成分。正如在上文涉及的技術(shù)問題時指出的，本領(lǐng)域急迫需要一個有效標(biāo)志物，用于在治療前和治療過程中預(yù)測使用HSP90抑制劑進(jìn)行抗癌治療的結(jié)果；同時，我們也需要將接受HSP90抑制劑抗癌治療的患者或考慮接受HSP90抑制劑抗癌治療的患者加以分類，以區(qū)別HSP90抑制劑的“敏感者”患者和“非敏感者”患者。本項發(fā)明的主要目的是為即將接受或者正在接受某種抗癌或者抗增生治療的個體提供一種診斷方法，此方法可評測患者在接受HSP90抑制劑治療前、治療過程中和/或者治療后對HSP90抑制劑療法的反應(yīng)情況。此過程的主要步驟包括(a)在生物學(xué)/醫(yī)學(xué)/病理學(xué)樣品中鑒定出KRAS基因至少一處(激活性)突變，并且以這種突變作為在接受HSP90 抑制劑治療前、治療過程中以及治療后對HSP90抑制劑具有藥物反應(yīng)的標(biāo)志，如KRAS基因含有激活性突變則表明此患者對HSP90抑制劑有易感性，即HSP90抑制劑治療會有效；(b) 根據(jù)患者樣品中發(fā)現(xiàn)的KRAS基因的不同突變情況將其分為“響應(yīng)者”和“非響應(yīng)者”。在優(yōu)選方案中，所依據(jù)的KRAS基因突變是激活性突變。因此，本項發(fā)明的意義在于首次發(fā)現(xiàn)和提供了能夠在用HSP90抑制劑進(jìn)行抗癌/
7抗增生治療前、治療過程中以及治療后準(zhǔn)確預(yù)測治療的效果。本項發(fā)明之所以能解決上述技術(shù)性問題，其原因正如后文以及附加案例中所提到的，我們很意外地發(fā)現(xiàn)，在那些細(xì)胞(群)、組織(群)或者培養(yǎng)的細(xì)胞(群)當(dāng)中(或者在某種由細(xì)胞或者細(xì)胞成分組成的生物學(xué)樣品中)所發(fā)現(xiàn)的KRAS基因至少一處突變，可以準(zhǔn)確預(yù)測這些這些細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞(或者提供上述生物學(xué)樣品的個體)對HSP90抑制劑的易感性。目前，由于缺少相應(yīng)的治療手段，以KRAS基因發(fā)生至少一處突變?yōu)樘卣鞯倪@些癌癥尚無法得到有效治療；因此，患有此類癌癥或者腫瘤性疾病的患者的預(yù)后發(fā)展很不樂觀(詳見KDerhardtQOOfe)，J. Clin. Oncol.)。這類腫瘤性疾病或者癌癥可包括非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、頭頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胃腸癌(包括胃癌和食道癌)、腎細(xì)胞癌、尿道癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、腦瘤、小兒腫瘤以及肉瘤等等，并且所有這些疾病都是相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)所熟知的。一般而言，除了上述各種腫瘤病之外，一個相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的專業(yè)人員還會注意到本發(fā)明適用于其他一些典型的腫瘤性疾病， 例如神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、畸胎瘤等等。本項發(fā)明不僅著力于評測HSP90抑制劑治療惡性腫瘤疾病的成功率，也可用于評測HSP90抑制劑對良性腫瘤疾病的療效，例如脂肪瘤、纖維瘤、肌瘤、息肉、疣、扁平濕疣以及其他類似的疾病。但是，對惡性腫瘤/癌癥的HSP90抑制劑療效進(jìn)行評測仍然是本項發(fā)明的首要關(guān)注點(diǎn)。在本項發(fā)明中，KRAS基因的突變可作為對HSP90抑制劑處理具有響應(yīng)性或者易感性的標(biāo)記物/預(yù)測標(biāo)記，這使我們深感意外。這里所指的“標(biāo)記物”和“預(yù)測標(biāo)記”可以交叉使用，都是指基因的某一種等位突變型，這里的“基因”是指KRAS基因，也可以是EGFR 基因和/或者BRAF基因。這些基因典型的突變類型將在后文給予說明。實驗數(shù)據(jù)表明， 我們所定義的“標(biāo)記物” / “預(yù)測標(biāo)記”與HSP90抑制劑處理的響應(yīng)性/易感性顯著相關(guān)(P < 0. 05)。在具體實施方案中，任何一個KRAS基因激活性突變都預(yù)示著用HSP90抑制劑對惡性增生(例如癌癥)進(jìn)行治療(或者預(yù)防)的成功。KRAS基因突變可作為腫瘤細(xì)胞對HSP90抑制劑尤其是17-AAG具有易感性的標(biāo)記， 這第一次為此類癌癥(KRAS基因發(fā)生突變)患者提供了一條治療途徑?；颊呓邮蹾SP90抑制劑治療后，臨床有效率可在原有基礎(chǔ)上提高80%，并且存活率可大約提高100%。在之前用EGFR抑制劑埃羅替尼和吉非替尼治療含EGFR基因突變的肺癌時，也得到過類似的臨床有效率和患者存活率提高的結(jié)果。HSP90與發(fā)生突變后的原癌基因的成熟過程有關(guān)，例如變異的BRAF基因和EGFR基因(ShimamuraU005) Cancer Res ;Grbovic (2005)PNAS)。在此研究領(lǐng)域內(nèi)有假說認(rèn)為，在 RAS-RAF通路上的某些基因發(fā)生突變的腫瘤細(xì)胞依賴于Hsp90的分子伴侶作用，也有人試圖通過研究來證實這一假說(Banerji等，2008 ；Hostein等，2001)。在BRAF基因和EGFR基因中帶有突變的腫瘤對HSP90抑制劑具有高度易感性，這是因為此類腫瘤的生長和發(fā)展需要有HSP90在這些發(fā)生了突變的BRAF和EGFR蛋白的成熟過程中發(fā)揮其作用。因此，有關(guān)這方面的研究者推測，BRAF基因和EGFR基因的突變可以作為對HSP90抑制劑的易感性的一個預(yù)測性標(biāo)記。有人進(jìn)行過一個臨床試驗(NCT004310M)來探究HSP90抑制劑IPI-504在治療非小細(xì)胞肺癌患者過程中的安全性和有效性問題(Smith, Drug Discovery Today Therapeutic Strategies，2008)。然而，相關(guān)研究既沒有提及KRAS基因的突變，也未提出
8此基因突變作為腫瘤細(xì)胞/腫瘤對HSP90抑制劑的易感性標(biāo)記的可能性。相反，在對癌癥進(jìn)行單一化療或者聯(lián)合了 EGFR抑制劑例如埃羅替尼(Eberhard(2005) J Clin Oncol 23， 59005909)的化療時，KRAS基因突變被認(rèn)為是抗療性的預(yù)測性標(biāo)記(Pao等，200 )，也就是說，研究者普遍將KRAS基因的突變視作EGFR抑制劑易感性的負(fù)標(biāo)記。換句話說，業(yè)內(nèi)普遍認(rèn)為帶有KRAS基因突變特征的腫瘤細(xì)胞/腫瘤對EGFR抑制劑(例如埃羅替尼或者吉非替尼)處理具有抗性。HSP90甚至不被認(rèn)為與發(fā)生變異的KRAS蛋白的成熟過程有關(guān)，人們只知道HSP90 分子可能是通過其受質(zhì)蛋白BRAF(受質(zhì)蛋白是指HSP90使之穩(wěn)定的蛋白)來調(diào)節(jié)依賴于 K-RAS的信號通路激活過程。但是，HSP90可以使之穩(wěn)定的“受質(zhì)蛋白，，還有很多。早前始于黑色素瘤患者的一些研究(Banerji等；Mol Cancer Ther, Apr ；7 (4) 737-9 2008)認(rèn)為，NRAS基因突變和BRAF基因突變有可能是HSP90抑制劑的生物響應(yīng)標(biāo)記物。但是，由于僅有六名患者參與了此項研究，其數(shù)據(jù)所代表的意義便非常有限。具體地說，兩位患有轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的病人對HSP抑制劑有藥物反應(yīng)；并且其中一位帶有BRAF 基因突變而另一位則是NRAS基因發(fā)生了突變(Banerji等；Mol Cancer Ther, Apr ；7 (4) 737-9 2008)。然而考慮到在所有黑色素瘤患者中約有45-60%的患者帶有BRAF基因突變， 約有20-30%的患者帶有NRAS基因突變，并且這兩種基因的突變在人群中分布廣泛，僅僅兩名患者在此種療法中有效的事實，還不足以證明此類癌癥都集中發(fā)生在那些對HSP90抑制劑有響應(yīng)的患者身上。與之形成對照的是，本發(fā)明中的研究則是在分析了一批近似于自然分布狀態(tài)下的肺癌患者病例的基礎(chǔ)上，得出帶有KRAS基因突變的腫瘤對HSP90抑制劑具有顯著的易感性。在這一批腫瘤患者里，帶有KRAS基因突變的腫瘤都集中分布在對HSP90 抑制劑有易感性的癌癥患者范圍內(nèi)。另外，KRAS蛋白作為HSP90的一個新型受質(zhì)蛋白，這本身也是一個意料之外的驚人發(fā)現(xiàn)。通常，典型的HSP90受質(zhì)蛋白是具有復(fù)雜四級結(jié)構(gòu)的大蛋白，需要進(jìn)行充分的折疊和加工；變異的BRAF激酶就是這樣一個典型的例子。相反，KRAS蛋白是一個非常小的蛋白，不需要充分的結(jié)構(gòu)重構(gòu)來實現(xiàn)活化。需要注意的是，盡管KRAS和NRAS在結(jié)構(gòu)上具有相似性，它們是不同的蛋白。實際上，這些變異蛋白的任何一種致癌性轉(zhuǎn)變，都離不開特定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。例如，BRAF, EGFR和HER2(這些都是結(jié)構(gòu)高度復(fù)雜的蛋白)都是分子伴侶的作用對象，而分子伴侶則在復(fù)雜大蛋白的正確折疊過程中起著必不可少的作用。但是，像 KRAS這樣一個四級結(jié)構(gòu)相對簡單的小蛋白，卻未被業(yè)內(nèi)研究者認(rèn)為(甚至是根本想不到) 是HSP90可能的受質(zhì)蛋白/底物。我們將在后文解釋為什么變異的KRAS蛋白不能與變異的BRAF或者EGFR蛋白一同歸類為HSP90的受質(zhì)蛋白，因此不可能被業(yè)內(nèi)研究人員考慮到有可能是HSP90受質(zhì)蛋白。有文獻(xiàn)表明，變異的KRAS與變異的BRAF或者EGFR(Siimamura T等，Can Res2005 ； Grbovic OM等，PANS 2006)之間存在顯著的差別；這表明變異的KRAS不能同變異的BRAF 或者EGFR —起歸類為HSP90的受質(zhì)蛋白。相反，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)KRAS顯然是一個新型的、 非典型的Hsp90受質(zhì)蛋白。在后面附上的實驗說明中可以看到，變異的KRAS蛋白結(jié)合到 Hsp90上面，并且用HSP90抑制劑(17-AAG)也不能將變異的KRAS從復(fù)合體中去除。在附加案例中還可以看到，突變型和野生型KRAS都能與Hsp90結(jié)合，并且這種結(jié)合過程不會受到像17-AAG這樣的HSP90抑制劑的抑制。然而在相同的實驗條件下，我們發(fā)現(xiàn)用17-AAG處
9理可以將變異的EGFR從復(fù)合體中去除掉，這也與早先研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致(Shimamura T 等；Can Res 2005)。此外，復(fù)合體之外的KRAS水平也不會受到影響。然而，用HSP90抑制劑進(jìn)行處理后，c-Raf和AKT的水平都發(fā)生了變化；倘若不受現(xiàn)有理論限制，這個現(xiàn)象也許可以說明抑制HSP90的功能可以殺死KRAS基因發(fā)生突變的細(xì)胞，因為抑制HSP90的功能阻斷了 KRAS下游的兩條主要的信號通路(c-Raf和AKT通路)。在不考慮現(xiàn)有理論的情況下，我們認(rèn)為，KRAS蛋白(尤其是此文中提及的發(fā)生激活性突變的KRAS蛋白)是HSP90的一個受質(zhì)蛋白/底物，HSP90協(xié)助完成(被激活的)KRAS 蛋白的折疊過程。可以想見，HSP90是通過其分子伴侶的功能阻止變異的KRAS蛋白(也就是帶有激活性突變的KRAS蛋白)被降解掉；因此，有活性的KRAS蛋白水平會提高并且得以保持，而這樣一種高水平的活性KRAS蛋白則有可能促成了本文提及的各種癌癥的發(fā)展和/ 或者惡化(例如腫瘤發(fā)生或者腫瘤生長)。我們還可以確信，本文提及的各種HSP90抑制劑是通過干擾HSP90的分子伴侶功能來阻止激活的/變異的KRAS蛋白的正確折疊，從而導(dǎo)致其水平降低。因此，一個顯而易見的事實是，HSP90抑制劑在治療本文提及的各種癌癥以及在本項發(fā)明提供的各種方法手段中都是很有用的。我們還需要注意到，變異的KRAS蛋白一直未被視作KSP90的受質(zhì)蛋白，同樣與之相關(guān)的激活性KRAS基因突變也未被認(rèn)為或者未被推測可能與腫瘤/癌細(xì)胞對HSP90抑制劑的易感性有關(guān)。例如,Smith (Drug Discovery Today :The Strategies, 2008)認(rèn)為，由于 HSP90的受質(zhì)蛋白種類多樣并且HSP90具有多種細(xì)胞功能，因此相應(yīng)的抑制劑也會起到各種不同的作用。盡管先前的研究都將精力集中在分析依賴于HSP90的原癌基因Akt的成熟過程，卻沒有一項研究系統(tǒng)性地分析過帶有KRAS基因突變的細(xì)胞對HSP90抑制劑作用的易感性。此外，由于缺乏具有完整遺傳標(biāo)記的大批量細(xì)胞系，針對“基因型-表現(xiàn)型”相互關(guān)系的大規(guī)模臨床前研究也難以進(jìn)行。而本項發(fā)明所創(chuàng)立的各種方法和手段都有針對大量腫瘤細(xì)胞系的研究作為基礎(chǔ)，并且這些細(xì)胞系都是屬于某一特定類型的腫瘤，因此使得鑒定出對HSP90抑制劑處理具有易感性/響應(yīng)性的標(biāo)記物成為可能。例如，Smith (Drug Discovery Today therapeutic Strategies, 2008)指出了 NQOl 基因表達(dá)與 17-AAG 易感性之間的相關(guān)性。Solit (2008) Drug Discovery Today 13， 8-43頁也說明了在HSP90抑制劑試驗的設(shè)計過程中需要考慮病人的選擇性。Solit進(jìn)一步認(rèn)為，到目前為止，對于HSP90抑制劑只進(jìn)行過有限的動物實驗，因此關(guān)于17-AAG或者其他 HSP90抑制劑可以降解經(jīng)典HSP90受質(zhì)蛋白的能力，尚需通過在體試驗加以證實。因此，相關(guān)文獻(xiàn)從未提及KRAS基因突變與HSP90抑制劑易感性的關(guān)系，并且人們也不知道變異的KRAS蛋白可作為HSP90的作用靶點(diǎn)。所以，關(guān)于KRAS突變作為HSP90抑制劑的敏感性的標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)是始料未及的也是現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域里沒有預(yù)見到的。如前文所述，罹患攜帶有KRAS基因突變的癌癥的病人存活率非常低、預(yù)后發(fā)展很糟糕，并且已知的各種療法都不太有效。因此，將KRAS基因的突變作為對HSP90抑制劑易感性的標(biāo)記物鑒定出來，將使這些患者從中大為受益。另外，此處提及的診療方法還可以在對患者進(jìn)行臨床試驗之前鑒定出HSP90的“響應(yīng)者”(對HSP90敏感的患者)。附加案例所記述的實驗對本項發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)闡述。這些實驗意外地發(fā)現(xiàn)，對于 HSP90抑制劑尤其是格爾德霉素(geldanamycin)衍生物例如17-AGG的易感性，KRAS基因的突變可作為這種易感性的預(yù)測信號。在附加案例中可以看到，研究人員是通過使用具有代表性的NSCLC (非小細(xì)胞肺癌)細(xì)胞系系列來發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變可作為HSP抑制劑易感性的預(yù)測物/標(biāo)記物。這些研究結(jié)果在另一個基于NCI-60細(xì)胞系列的研究中得到了進(jìn)一步證實(Garraway 等，2005 ；Shoemaker, 2006) (ρ 值< 0. 05)。而 NCI-60 細(xì)胞系系列由來自多種腫瘤的細(xì)胞系組成，代表了絕大多數(shù)人類腫瘤類型；因此可以說，KRAS基因突變是對 HSP90抑制劑具有易感性(對HSP90處理有響應(yīng)性)的通用預(yù)測物/標(biāo)記物。所以，根據(jù)本項發(fā)明的設(shè)計，除了 NSCLC癌癥，任何一種以KRAS基因發(fā)生突變?yōu)闃?biāo)志的癌癥(例如含有 KRAS基因突變的非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、腦瘤、小兒腫瘤、肉瘤等等)都能得到治療。當(dāng)然，這里所提的KRAS基因突變最好是激活性的突變。因此在這里所述實施方案中，優(yōu)先對激活的KRAS基因突變進(jìn)行尋找、識別或者評估。附加例子中也提供了動物實驗數(shù)據(jù)，表明激活性突變確實預(yù)示著對HSP90抑制劑的易感性。這些動物實驗應(yīng)用了一種轉(zhuǎn)基因老鼠模型；這種帶有l(wèi)0X-st0p-l0XKRASG12D 的轉(zhuǎn)基因老鼠由于在肺部表達(dá)了一個突變型的KRAS等位基因，因此患有侵入性的肺腺癌 (Jackson EL等；Genes Dev 2001)。接下來，研究人員用一種典型的HSP90抑制劑—— 17-DMAG(文中給予其描述和定義)來處理這種患有肺部腫瘤的老鼠，這種17-AAG衍生物具有更好的可溶性。值得注意的是，處理一周之后，患有腫瘤的四只老鼠有三只的腫瘤發(fā)生了消退。盡管這種消退反應(yīng)是短時的，但明顯證實了帶有激活性KRAS基因突變的腫瘤對 HSP90抑制劑具有藥物反應(yīng)；這也從在體實驗方面確證了針對帶有遺傳標(biāo)記細(xì)胞系的大規(guī)模篩選實驗的結(jié)果。本項發(fā)明所具有的一個優(yōu)勢是，可以離體篩選出那些對HSP90抑制劑敏感或者對 HSP90抑制劑處理有響應(yīng)性的細(xì)胞(群)、組織(群)或者培養(yǎng)細(xì)胞。正如文中所指出的， 我們使用的是帶有基因組標(biāo)記的NSCLC細(xì)胞系，這種細(xì)胞系在遺傳多樣性、轉(zhuǎn)錄譜以及表型特征等方面都具有原發(fā)NSCLC(非小細(xì)胞肺癌)腫瘤的代表性。一項全范圍的基因組集成譜系分析表明，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞系的基因組在基因拷貝數(shù)、原癌基因突變以及基因表達(dá)空間等方面，對在外科手術(shù)中從患者身上分離出來的原發(fā)性NSCLC腫瘤具有高度代表性。因此，用這樣一種NSCLC細(xì)胞系便可以避免使用動物或者患有癌癥的志愿者進(jìn)行活體試驗。同時，與業(yè)內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)不同的是，使用這類細(xì)胞系還可以使得鑒定出KRAS基因突變作為HSP90抑制劑易感性標(biāo)記物的結(jié)果可靠。我們的構(gòu)想是，其他的細(xì)胞系只要能夠高度模擬原發(fā)性NSCLC腫瘤，尤其是在基因拷貝數(shù)、原癌基因突變以及基因表達(dá)空間等方面進(jìn)行模擬，同樣可以用在此處。此外，文中說明過的并在附加案例中得以使用的算法也可用到本項發(fā)明當(dāng)中，尤其是用于評測實驗數(shù)據(jù)，以及/或者鑒定代表著(腫瘤)細(xì)胞、(腫瘤)組織、或者(腫瘤)培養(yǎng)細(xì)胞對HSP90抑制劑易感性的預(yù)測物/標(biāo)記物。這些算法在相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)已廣為使用，主要有K-鄰近算法以及統(tǒng)計學(xué)檢驗，例如Fisher精確檢驗。業(yè)內(nèi)專業(yè)人員會知曉如何在本項發(fā)明中使用這些算法，并且可以根據(jù)發(fā)明的需要和自身的知識背景采用更多的算法。后文的闡述以及附加案例說明了如何選擇細(xì)胞系或者細(xì)胞系組合， 以便在藥物敏感性標(biāo)記物的評測實驗中合理地設(shè)計實驗組合。為了確認(rèn)這樣一種細(xì)胞系是否反映了原發(fā)性NSCLC腫瘤的遺傳多樣性，我們對一大組NSCLC細(xì)胞系的基因組進(jìn)行了系統(tǒng)的分析標(biāo)注。正如附加案例中所顯示的，這些細(xì)胞系的表型很穩(wěn)定，因而證明了非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的細(xì)胞系對原發(fā)性NSCLC腫瘤具有高
11度代表性。同時，這些細(xì)胞系還可以用在針對基因組損傷的藥物療效的系統(tǒng)性分析當(dāng)中。在附加案例中，研究人員通過使用系統(tǒng)性相似譜系分析證實了 EGFR基因突變可用來預(yù)測對EGFR抑制劑的易感性(埃羅替尼，PDI68393，凡德他尼)(Arao等，2004 ；Lynch 等，2004 ；Paez等，2004 ；Pao等，2004 ；Sos等，2008)，而這個結(jié)果與業(yè)內(nèi)已有的觀測結(jié)果相一致。同時，已有研究發(fā)現(xiàn)在帶有EGFR-基因突變的NSCLC細(xì)胞系中具有很高的EGFR抑制劑活性(McDermott等，2007 ；Paez等，2004 ；Tracy等，2004)。這些發(fā)現(xiàn)都是使用無偏差算法對遺傳性損傷進(jìn)行系統(tǒng)性全局測量而得到的。此外，EGFR基因突變作為EGFR抑制劑易感性的預(yù)測物/標(biāo)記物這一業(yè)內(nèi)已有發(fā)現(xiàn)，在本項發(fā)明中也得到了證實；因此，這也說明在發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變作為HSP90抑制劑易感性預(yù)測物/標(biāo)記物的案例實驗中，所使用的算法具有全局功能性的生物學(xué)可靠性。例如，通過基于細(xì)胞的系統(tǒng)性化合物篩選發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變作為EGFR抑制作用易感性的標(biāo)記物/預(yù)測物(ρ < 0. 0001)，隨后根據(jù)損傷譜系分析對易感性強(qiáng)弱進(jìn)行預(yù)測。然而出人意料的是，不僅是EGFR基因突變被發(fā)現(xiàn)并且證實作為對 EGFR抑制劑易感性的預(yù)測物/標(biāo)記物，KRAS基因突變也被發(fā)現(xiàn)并且證實作為對HSP90抑制劑易感性的預(yù)測物/標(biāo)記物。不難理解，在對針對腫瘤細(xì)胞的抗癌治療效果進(jìn)行深度臨床前分析時，不僅需要對取自某一腫瘤體的足量細(xì)胞系進(jìn)行詳盡的基因組分析，還需要進(jìn)行高通量細(xì)胞系譜分析，然后根據(jù)本文所述對化合物活性進(jìn)行預(yù)測。類似于附加案例所述的凡德他尼/埃羅替尼結(jié)合于EGFR激酶結(jié)構(gòu)域，化合物結(jié)合于HSP90這個過程的結(jié)構(gòu)模型可以進(jìn)一步證明發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變作為對HSP90抑制劑易感性預(yù)測物/標(biāo)記物的準(zhǔn)確性。在表達(dá)有T790M抗性等位基因的Ba/F3細(xì)胞中，相應(yīng)化合物活性的缺失確證了凡德他尼(Vandatinib)/埃羅替尼(Erlotinib)是EGFR抑制劑。EGFR 基因突變也被發(fā)現(xiàn)可作為對SRC/ABL抑制劑達(dá)沙替尼(dasatinib)易感性的預(yù)測物/標(biāo)記物。在不受現(xiàn)有理論限制的情況下，這一發(fā)現(xiàn)證明了突變的EGFR基因是達(dá)沙替尼的確切作用靶點(diǎn)(Song等，2006)。在本項發(fā)明中，詞組“對HSP90抑制劑的易感性”和“對HSP90抑制劑處理的響應(yīng)性”可以相互交叉使用。任何關(guān)于“對HSP抑制劑的易感性”的解釋都適用于“對HSP90抑制劑處理的響應(yīng)性”，反之亦然。確定藥物易感性的技術(shù)手段和方法在業(yè)內(nèi)已較為成熟，此類方法主要包括細(xì)胞或者組織培養(yǎng)實驗。一個非最優(yōu)選但仍應(yīng)予以考慮的情況是，應(yīng)該同時測定兩種或者多種 HSP90抑制劑(也就是說，HSP90擁有各種具有不同化學(xué)式、有時甚至不具結(jié)構(gòu)相關(guān)性的抑制劑)。然而，一次最好只測定一種HSP90抑制劑。后文將對本項發(fā)明中優(yōu)先使用和測定的 HSP90抑制劑予以陳述說明。在此文中，對HSP90抑制劑處理的響應(yīng)性的測定包括一個接觸步驟，后文將對此步驟進(jìn)行更為細(xì)致的說明。這里所說的“HSP90抑制劑處理”是指讓一種細(xì)胞例如哺乳動物腫瘤細(xì)胞或者癌細(xì)胞與相應(yīng)的抑制劑相接觸。當(dāng)然，后文提及的其他各種細(xì)胞也可用HSP90 抑制劑進(jìn)行處理。上述方法還可以包括一個評測/測定步驟，例如，測量用HSP90抑制劑處理過的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞或者哺乳動物細(xì)胞的存活率。例如，上面提及的各種細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞在用HSP90抑制劑處理后，存活率可能會下降。理想情況下，這些細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞相對于未經(jīng)處理的對照組細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞而言，存活率可能下降至少
1210%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，最多可達(dá)到 90%。除去不用 HSP90 抑制劑進(jìn)
行處理這一點(diǎn)，對照組細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞最好與實驗組細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞完全相同。因此，如上文所述，這些經(jīng)過了 HSP90抑制劑處理并且增殖減少的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞，就可被視作對HSP90抑制劑具有易感性。同樣地，經(jīng)過HSP90抑制劑處理并且出現(xiàn)增殖減少的哺乳動物細(xì)胞，也被認(rèn)為對HSP90抑制劑處理具有響應(yīng)性。后文將闡述測定 KRAS基因中至少一處突變以及相應(yīng)各種突變的步驟。如前文所述，我們意外地發(fā)現(xiàn)，KRAS 基因中這樣一個突變可以預(yù)示著用HSP90抑制劑處理的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞是否會對 HSP90抑制劑具有易感性或者對HSP90抑制劑處理具有響應(yīng)性。存活率的降低可能反映在細(xì)胞增殖的減少，例如相對于未經(jīng)HSP90抑制劑處理的對照組細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞，實驗組細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的增殖減少了 10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %， 最多可達(dá)到90%。這種增殖的減少程度可通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量總細(xì)胞體積、組織體積或者培養(yǎng)細(xì)胞體積來進(jìn)行定量。如上所述，經(jīng)處理和對照組細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的增殖差異，可通過使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的體積來警醒測定/估計。這種測定可在不同的時間點(diǎn)進(jìn)行，例如在用HSP90抑制劑處理相應(yīng)細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞15分鐘、30分鐘、60分鐘、2 小時、5小時、18小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天以及/或者7天之后進(jìn)行測定。同時，還應(yīng)進(jìn)行重復(fù)測定，例如，在處理15分鐘、30分鐘和60分鐘后進(jìn)行測定。需要注意的是， 這些細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞可在不同的條件下(例如，相同濃度的抑制劑，不同濃度的抑制劑，含有不同穩(wěn)定劑、稀釋劑以及/或者載體的抑制劑等等)進(jìn)行多次測定(例如2次、 3次、5次、10次或者20次)，而不是只測一次。相應(yīng)地，重復(fù)測定可以在最后一次用HSP90 抑制劑處理之后進(jìn)行，或者在上述不同處理次數(shù)之間進(jìn)行。上述典型的測定/評測步驟，包括測定經(jīng)HSP90抑制劑處理的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的增殖情況的步驟，可用于此文提及的以及更多其他測定/評測過程(例如測定HSP90基因的表達(dá)水平)。業(yè)內(nèi)技術(shù)人員應(yīng)該知曉此類檢測方法，這類方法可對細(xì)胞凋亡、衰老或者其他細(xì)胞生物學(xué)表型進(jìn)行定量，而這些表型都與腫瘤細(xì)胞存活率或者增殖數(shù)降低的現(xiàn)象有關(guān)。測定對HSP90抑制劑處理的響應(yīng)性的方法還包括測定HSP90的活性水平，這一活性預(yù)示著細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞是否對HSP90抑制劑具有易感性或者是否對HSP90抑制劑處理具有響應(yīng)性。正如后文關(guān)于測定KRAS以及EGFR和/或者BRAF基因活性的說明，這里所指的“活性”是指例如在蛋白水平測定酶活力以及/或者測定其表達(dá)水平(例如mRNA 或者蛋白質(zhì))。文中提及的活性測定方法在相關(guān)研究領(lǐng)域已較為成熟，后文也將給予更多的說明。本項發(fā)明所說的“HSP90”( “熱休克蛋白90”)是指一種真核生物不可缺少的分子伴侶。作為一種分子伴侶，熱休克蛋白90起著修正錯誤折疊的蛋白的作用，因此在健康細(xì)胞中發(fā)揮著重要的分子控制機(jī)能作用。人們發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，由于發(fā)生突變而激活的原癌基因例如BRAF或者EGFR都需要借助HSP90實現(xiàn)其熟化過程。盡管HSP90本身的功能是保護(hù)細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞卻也能借助這種保護(hù)功能穩(wěn)定原癌基因，促使致癌性轉(zhuǎn)變的發(fā)生。人類HSP90基因的各種轉(zhuǎn)錄子序列見SEQ ID第137、139、141、143以及145號；同時相應(yīng)的各種同型HSP90蛋白的氨基酸序列見SEQ ID第138、140、142、144以及146號。業(yè)內(nèi)有人懷疑編碼HSP90AA2蛋白(SEQ ID第145號)的核酸序列可能是個假基因?？傮w而言，這里提及的HSP90可以指任何一個帶有(部分)HSP90活性的氨基酸序列以及編碼相應(yīng)氨基酸序列的核酸序列。除了這里提及的人類HSP90序列，業(yè)內(nèi)技術(shù)人員也可以使用已有的手段鑒定出其他哺乳動物或者非哺乳動物(尤其是老鼠、黑猩猩、獼猴、線蟲、果蠅)的HSP90核酸序列； 這些鑒定手段包括例如核酸測序、雜交檢測、使用人工或者后文將予以說明的計算機(jī)程序進(jìn)行序列比對，在上述計算機(jī)程序中對“雜交”和同源度進(jìn)行了定義。在一項實施案例中， 編碼人類HSP90同源物的核酸序列與SEQ ID第137、139、141、143以及145號核酸序列具有至少40%的同源性；在其他更好的情況下，此同源性可達(dá)到至少45 %、50%、55%、60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或者 98%，并優(yōu)先選取較高值；而在極端情況下，上述同源性可達(dá)到99%以上。對已知核酸序列/啟動子的同源序列進(jìn)行雜交檢測的方法在業(yè)內(nèi)已較為成熟；相關(guān)技術(shù)可以參見 Sambrook、Russell “Molecular Cloning，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (2001) ；Ausubel，"Current Protocols in Molecular Biology，，，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N. Y. (1989)。這里所說的“雜交過程”或者“雜交”可以在嚴(yán)苛的或者非嚴(yán)苛條件下進(jìn)行；如果沒有特別要求， 一般使用非嚴(yán)苛的反應(yīng)條件。這些反應(yīng)體系可以根據(jù)常規(guī)的實驗方案來建立，例如上面提 R^] Sambrook (2001) ；Ausubel (1989) ； 1 Higgins and Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach "I RL Press Oxford, Washington DC, (1985)。反應(yīng)條件的設(shè)置應(yīng)為技術(shù)人員所熟知，并且可以根據(jù)已有的實驗方案進(jìn)行安排調(diào)整。因此，當(dāng)我們要檢測特異性的雜交序列時，就需要使用嚴(yán)格的雜交反應(yīng)和洗脫條件，例如0. Ix的SSC、 0. 1%的305、反應(yīng)溫度65攝氏度或者&的55(、60攝氏度、0. 1%&SDS。對于檢測一般同源性或者非嚴(yán)格匹配的序列，則可以使用較為寬松的雜交反應(yīng)條件，例如6x的SSC、1%的 SDS、反應(yīng)溫度65攝氏度。此外，探針長度和待檢測核酸的化學(xué)組成都應(yīng)在設(shè)計反應(yīng)條件時予以考慮。在本項發(fā)明中，涉及到兩條或者多條核酸序列時所說的“同源性” “百分比同源性《‘一致《‘百分比一致《‘百分之幾一致”或者“序列一致性”，是指這兩條或者多條序列或者子序列完全相同、或者某一百分比的核苷酸完全相同(理想情況下至少有40%的一致性， 更好的情況下可至少有 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%或者98%的一致性，最好時可達(dá)到99%以上的一致性)； 這些比對結(jié)果可通過使用比對窗口進(jìn)行最大匹配比較或者比對獲得，也可使用已有的序列比對算法對指定區(qū)域進(jìn)行比對獲得，或者進(jìn)行人工比對和肉眼檢查。舉例來講，具有75%到 90%或者更高的序列一致性的序列，便可被認(rèn)為是基本相同的。這種定義同樣適用于檢測序列的互補(bǔ)性。理想情況下，某一段含有至少15-20個核苷酸的序列是完全一致的；更好的情況是至少50到100個核苷酸的序列一致；最好時可至少有800到1200個核苷酸完全一致。業(yè)內(nèi)技術(shù)人員將會熟知如何使用各種算法，例如基于CLUSTALW計算機(jī)程序(Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994)，4673-4680)或者 FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245)的算法來測定序列之間的一致性百分比。雖然FASTDB算法通常不會考慮序列當(dāng)中不能匹配的核苷酸缺失或者添加(也就
14是空缺)，但是在其計算過程中，可以人工修正這種偏差以免過高估計序列的一致性百分比。然而，CLUSTALW程序則將序列空缺納入了一致性計算的考慮范圍。此外，還有其他算法可供此領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇，例如BLAST和BLAST2. 0算法(Altschul，(1997)Nucl. Acids Res. 25 :3389-3402 ；Altschul(1993)J. Mol. Evol. 36 :290-300 ；Altschul (1990)J. Mol. Biol. 215 :403-410)。進(jìn)行核酸序列比對時，BLASTN程序預(yù)設(shè)字長(W)為11，期望值(E)為 10, M= 5, N = 4，并且比對核酸的兩條鏈。BL0SUM62打分矩陣(Henikoff (1989) PNAS 89 10915)設(shè)置比對值⑶為50，期望值(E)為10，M = 5，N = 4，并且比對核酸的兩條鏈。為了確定一條核酸序列中的某一個核苷酸殘基是否對應(yīng)著該核苷酸序列(例如 SEQ ID第137、139、141、143和145號序列)中的某一個位置，技術(shù)人員可采用已知的各種方法和手段，比如人工比對或者使用上述各種計算機(jī)程序進(jìn)行比對。比如BLAST2. 0，全稱是 Basic Local Alignment Search Tool (見上文提及的 Altschul (1997) ；Altschul (1993)； Altschul (1990))，可用來進(jìn)行局部序列比對。如上所述，BLAST可以生成核苷酸序列的比對，以此來確定序列的相似性。由于其比對的“局部”性特征，BLAST在確定精確匹配或者鑒別相似序列方面特別有用。BLAST算法結(jié)果輸出的基本單位是“高分匹配片段”(HSP)。 一個HSP結(jié)果由兩條序列片段構(gòu)成，這兩條片段是任意選取的，長度相同，并且在局部比對中得分最高或者其比對得分達(dá)到或者超過了用戶設(shè)置的閾值或者臨界分值。因此可以說， BLAST方法就是用來在一條待查詢序列和一條數(shù)據(jù)庫序列之間尋找HSP，然后對找到的任意一種匹配情況的統(tǒng)計學(xué)顯著性進(jìn)行測算，然后將那些達(dá)到了用戶設(shè)置的顯著性標(biāo)準(zhǔn)的匹配結(jié)果報告出來。參數(shù)E確定統(tǒng)計學(xué)顯著性閾值，該閾值決定著是否報告某一條數(shù)據(jù)庫序列匹配情況。因此，E值也可以理解為在整個數(shù)據(jù)庫中搜索到一個HSP(或者一批HSP)的概率期望值的上限。任何一個數(shù)據(jù)庫的序列只要匹配值滿足E，都將輸出到程序結(jié)果當(dāng)中?；贐LAST(見上文提及的 Altschul (1997) ；Altschul (1993) ；Altschul (1990)) 的類似計算機(jī)技術(shù)也可用來在核苷酸數(shù)據(jù)庫中搜索相同的或者有關(guān)聯(lián)的分子，例如 GenBank或者EMBL。這種分析方法比需要使用多層膜的雜交方法快速得多，而且計算機(jī)搜索的敏感度可以進(jìn)行修正，以便確定某一個匹配應(yīng)當(dāng)歸類于“精確一致”還是“相似”。搜索結(jié)果以下列算式的得分為基礎(chǔ)
%序列一致性X % BLAST最高得分 100同時，還綜合考慮了兩條序列之間的相似度和匹配序列的長度。例如，一個得分為 40分的匹配結(jié)果可能有1-2%的錯配；而一個70分的匹配就會很精確。通常情況下，得分在15分到40分之間的匹配會被認(rèn)為是相似的分子，而更低的分?jǐn)?shù)則有可能會鑒別出有關(guān)聯(lián)的分子。另一個可用作序列比對程序的例子是CLUSTALW計算機(jī)程序(Thompson (1994) Nucl.Acids Res. 2 :4673-4680) # FASTDB(Brutlag(1990)Comp. App. Biosci.6 237- ，這些都是業(yè)內(nèi)熟知的例子。"HSP90抑制劑”一詞在本文中是指某種可以抑制上述提及的“HSP90”的表達(dá)或者活性的化合物。例如，某種HSP90抑制劑可以是干擾HSP90基因的轉(zhuǎn)錄、基因產(chǎn)物(未剪切或者部分剪切的mRNA)的加工(例如剪切、從細(xì)胞核向外轉(zhuǎn)運(yùn)等類似過程)和/或者基因產(chǎn)物(成熟mRNA)的翻譯的化合物。HSP90抑制劑還可以是干擾對HSP90基因編碼的多肽/
15蛋白的修飾過程(例如糖基化)，從而完全或者部分抑制前述HSP90蛋白的活性的化合物。 更進(jìn)一步地，HSP90抑制劑也可以是干擾HSP90蛋白與其他蛋白的相互作用，尤其是那些通過HSP90活性來得到穩(wěn)定的變異蛋白的化合物。此外，針對編碼HSP90的核酸分子而設(shè)計的siRNAs/RNAis、反義核酸分子以及核酶都被納入了本項發(fā)明所使用的HSP90抑制劑的范圍。同時，上面提及的HSP90拮抗劑/ 抑制劑還可能是一種輔助抑制性的核酸。siRNA 方法在諸如 Elbashir ((2001)，Nature411，494-498)的文獻(xiàn)中有所記載。根據(jù)本項發(fā)明的設(shè)計需要，像短發(fā)夾RNA(shRNAs)這樣的RNA也會作為藥物組分被使用在本項發(fā)明當(dāng)中。使基因靜默的shRNA方法在業(yè)內(nèi)已廣為人知，同時也可能會涉及到st (small temporal) RNAs 的使用，可參見 Paddison Q002) Genes Dev. 16,948-958。如前文所述，業(yè)內(nèi)已有的使基因靜默的途徑有利用“RNA”的方法，例如 RNAi (iRNA)或者siRNA。成功應(yīng)用這些方法的例子可參見前文提及的I^addisonQ002)， VX R Elbashir (2002)Methods26,199-213 ；Novina(2002)Mat. Med. June 3,2002 ； Donze (2002)Nucl. Acids Res. 30, e46 ；Paul (2002)Nat. Biotech 20,505-508 ；Lee (2002) Nat. Biotech. 20，500—505 ；Miyagashi(2002)Nat. Biotech. 20，497—500 ；Yu(2002)PNAS 99,6047-6052 或者 Brummelkamp Q002)，Science 296,550-553。這些方法可能使用了遺傳載體比如pSUPER載體，或者使用了 RNA聚合酶III載體，可參見前文提及的Υι^2002)； Miyagishi (2002)或者 Brummelkamp (2002)。業(yè)內(nèi)研究還使用過更多種類的HSP90抑制劑，相關(guān)例子可參見Gharp and Workman, 2006 ； Sol it and Rosen, 2006) 然而，本項發(fā)明所使用的HSP90抑制劑卻不僅限于已知的各種類型；也就是說，本項發(fā)明也可以用于對今后發(fā)現(xiàn)的HSP90抑制劑抗癌療效的預(yù)測。這些抑制劑可通過本文介紹的各種方法或者業(yè)內(nèi)已有的手段鑒定出來，例如針對HSP90抑制作用的高通量生化檢測手段(Sharp and Workman, 2006 ； Sol it and Rosen, 2006)。以已有的知識背景為基礎(chǔ)，業(yè)內(nèi)技術(shù)人員可以很容易地鑒定出這類抑制劑，或者檢測出疑似HSP90抑制劑化合物的抑制活性。這些檢測過程可能需要使用到附加案例中描述過的各種細(xì)胞或者培養(yǎng)細(xì)胞，還可能會用到其他各種細(xì)胞/組織/培養(yǎng)細(xì)胞，例如從活組織檢查中獲得的細(xì)胞/組織/培養(yǎng)細(xì)胞。本項發(fā)明的優(yōu)選案例所使用的HSP90抑制劑是格爾德霉素或者其衍生物。格爾德霉素(IUPAC 命名為([18S-(4E,5Z,8R*,9R*, 10E, 12R*, 13S*, 14R*, 16S*, )]_9_[(氨基羧基) 氧]-13-羥基-8，14，19-三甲氧基-4，10，12，16-四甲基-2-氮雜雙環(huán)[16. 3. 1. ] 二十二碳-4，6，10，18，21-戊烷-3，20，22trion)是一種由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的苯醌安莎霉素類抗生素。格爾德霉素能特異性地與HSP90(熱休克蛋白90)結(jié)合并且影響其功能。通常情況下， Hsp90能夠使蛋白的折疊趨于穩(wěn)定，尤其是腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)/變異的蛋白，例如v-Src、 Bcr-Abl以及p53等等；而Hsp90抑制劑格爾德霉素則可以引起這些蛋白的降解。以下是格爾德霉素的化學(xué)式
1權(quán)利要求
1.一種可以鑒定出對HSP90抑制劑具有易感性的細(xì)胞、組織或是培養(yǎng)的細(xì)胞的方法， 包括如下步驟(a)確定待測細(xì)胞、組織或培養(yǎng)細(xì)胞是否在KRAS基因中至少有一處激活突變；(b)挑選出在KRAS基因中至少有一個激活突變的細(xì)胞、組織或培養(yǎng)細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，此外還包括如下步驟(i)將上述待測細(xì)胞、組織或培養(yǎng)細(xì)胞用某種HSP90抑制劑進(jìn)行處理；( )測定上述經(jīng)某種HSP90抑制劑處理的待測細(xì)胞、組織或培養(yǎng)細(xì)胞的存活率。
3.一種測定某種哺乳動物腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞對某種HSP90抑制劑處理的響應(yīng)性的方法，該方法包括測定上述腫瘤細(xì)胞中至少一處KRAS基因的激活性突變，該突變預(yù)示著此細(xì)胞是否會對上述處理發(fā)生響應(yīng)或者具有響應(yīng)性。
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項所述的方法，此外還需測定EGFR基因和/或者BRAF 基因中的激活性突變。
5.一種體外鑒別某種HSP90抑制劑的響應(yīng)者或者對其具有易感性的患者的方法，包括如下步驟(a)從疑似患有或者易患某種癌癥的患者處獲得樣品，此種癌癥以在KRAS基因中、同時在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少有一處激激活性突變?yōu)樘卣鳎?b)鑒定上述KRAS基因、以及EGFR基因和/或BRAF基因中的至少一處激激活性突變； 其中，僅僅在KRAS基因中有一個激激活性突變、或者在EGFR基因和/或BRAF基因中也有激激活性突變，將標(biāo)志著某個響應(yīng)性患者，或者表示該患者對某種HSP90抑制劑具有敏感性。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項所述的方法，其中所說的HSP90抑制劑為格爾德霉素或其某種衍生物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，所說的格爾德霉素衍生物為17-AAG或者IPI-504。
8.如權(quán)利要求1至5中任意一項所述的方法，其中所說的HSP90抑制劑為NVP-AUY922。
9.如權(quán)利要求1至8中任意一項所述的方法，其中所說的KRAS基因突變選自以下一組突變情況KRAS_G12C，KRAS_G12R, KRAS_G12D, KRAS_G12A, KRAS_G12S, KRAS_G12V, KRAS_ G13D, KRAS_G13S, KRAS_G13C, KRAS_G13V, KRAS_Q61H, KRAS_Q61R, KRAS_Q61P, KRAS_Q61L, KRAS_Q61K, KRAS_Q61E, KRAS_A59T 以及 KRAS_G12F。
10.如權(quán)利要求4至9中任意一項所述的方法，其中所說的EGFR基因突變選自以下一組突變情況EGFR_D770_N771 > AGG ；EGFR_D770_N771insG ；EGFR_D770_N771insG ； EGFR_D770_N77IinsN ；EGFR_E709A ；EGFR_E709G；EGFR_E709H ；EGFR_E709K ；EGFR_E709V ； EGFR_E746_A750del ；EGFR_E746_A750del, T751A ；EGFR_E746_A750del, V ins ；EGFR_E746_ T751del, I ins ；EGFR_E746_T751del，S752A ；EGFR_E746_T751del，S752D ；EGFR_E746_ T751del, V ins ；EGFR_G719A ；EGFR_G719C ；EGFR_G719S ；EGFR_H773_V774insH ；EGFR_H773_ V774insNPH ；EGFR_H773_V774insPH ；EGFR_H773 > NPY ；EGFR_L747_E749del ；EGFR_L747_ E749del, A750P ；EGFR_L747_S752del ；EGFR_L747_S752del, P753S ；EGFR_L747_S752del， Q ins ；EGFR_L747_T750del, P ins ；EGFR_L747_T751del ；EGFR_L858R；EGFR_L861Q ；EGFR_ M766_A767insAI ；EGFR_P772_H773insV ；EGFR_S752_I759del ；EGFR_S768I ；EGFR_T790M ； EGFR_V769_D770insASV ；EGFR_V769_D770insASV ；以及 EGFR_V774_C775insHV。
11.如權(quán)利要求4至10中任意一項所述的方法，其中所說的BRAF基因突變選自以下一組突變情況BRAF_D594G，BRAF_D594V, BRAF_F468C, BRAF_F595L, BRAF_G464E, BRAF_G464R, BRAF_G464V,BRAF_G466A,BRAF_G466E,BRAF_G466R,BRAF_G466V,BRAF_G469A,BRAF_G469E, BRAF_G469R, BRAF_G469R, BRAF_G469S,BRAF_G469V,BRAF_G596R,BRAF_K601E,BRAF_K601N, BRAF_L597Q,BRAF_L597R,BRAF_L597S,BRAF_L597V, BRAF_T599I, BRAF_V600E, BRAF_V600K, BRAF_V600L和 BRAF_V600R。
12.如權(quán)利要求4至11中任意一項所述的方法，其中所說的KRAS基因、以及EGFR基因和/或者BRAF基因的突變可以通過SSP、PCR-RFLP、實時定量PCR、測序、HPLC或質(zhì)譜基因型鑒定等方法來進(jìn)行檢測。
13.如權(quán)利要求5至12中任意一項所述的方法，其中所說的樣品取自疑似患有或者易患癌癥的患者。
14.一種使用能檢測至少一種KRAS基因激活性突變、以及(可有可無地)EGFR或者 BRAF基因激活性突變的寡聚或多聚核苷酸用于對條目6到8中的定義的HSP90抑制劑敏感度進(jìn)行診斷的用途。
15.應(yīng)用權(quán)利要求14，其中所說的寡聚核苷酸長度大約為15至100個核苷酸。
16.一種監(jiān)測針對患有上述疾病或者易患上述疾病的患者所進(jìn)行的抗癌治療的療效的方法，此類癌癥以在KRAS基因中、同時選擇性地在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少具有一處激激活性突變?yōu)樘卣?；該方法包括如下步驟a)在取自上述受治療者/患者的細(xì)胞或者組織樣品中，測定KRAS基因的表達(dá)或者活性，同時選擇性地測定EGFR基因的活性或表達(dá)水平、以及/或者BRAF基因的說性或表達(dá)水平；b)將a)步驟中測得的至少一種上述標(biāo)記基因的活性、與KRAS基因的參考或?qū)φ毡磉_(dá)水平或者參考或?qū)φ栈钚赃M(jìn)行比較，同時選擇性地與EGFR基因的參考或?qū)φ毡磉_(dá)水平以及/或者BRAF基因的參考或?qū)φ毡磉_(dá)水平進(jìn)行比較，在a)步驟中測得的活性或表達(dá)水平、與上述參考表達(dá)水平或參考活性之間的差異程度標(biāo)志著針對上述癌癥所進(jìn)行的治療的療效。
17.一種預(yù)測針對患有上述疾病或者易患上述疾病的患者所進(jìn)行的抗癌治療的療效的方法，此類癌癥以在KRAS基因中、同時選擇性地在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少具有一處激激活性突變?yōu)樘卣?；該方法包括如下步驟a)在取自上述受治療者/患者的細(xì)胞或者組織樣品中，測定KRAS基因、EGFR基因以及 /或者BRAF基因中至少一種標(biāo)記基因的活性或表達(dá)水平；b)將a)步驟中測得的至少一種上述標(biāo)記基因的活性、與至少一種上述標(biāo)記基因的參考活性或參考表達(dá)水平進(jìn)行比較；該參考活性或參考表達(dá)水平是從取自某一對照受治療者 /患者(響應(yīng)者/非響應(yīng)者)的細(xì)胞或者組織樣品中選擇性地測得，在a)步驟中測得的活性或表達(dá)水平、與上述參考或?qū)φ栈钚曰蛘呤菂⒖蓟驅(qū)φ毡磉_(dá)水平之間的差異程度，標(biāo)志著針對癌癥所進(jìn)行的治療的預(yù)期療效。
18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中針對以在KRAS基因中、同時在EGFR基因和 /或者BRAF基因中至少有一處激激活性突變?yōu)樘卣鞯陌┌Y所進(jìn)行的治療過程，包括施用權(quán)利要求6至8中任何一項所定義的某種HSP90抑制劑。
19.應(yīng)用一種在KRAS基因中、同時在EGFR基因和/或者BRAF基因中至少有一處激激活性突變的(轉(zhuǎn)基因)細(xì)胞或者(轉(zhuǎn)基因)非人類動物，來對用來治療以在KRAS基因中至少有一處激激活性突變?yōu)樘卣鞯陌┌Y的某種藥物進(jìn)行篩選和/或者驗證。
20.如權(quán)利要求5至19中任意一項所述的方法，其中所說的癌癥選自下列一組癌癥 非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胃腸癌(包括胃癌和食道癌)、腎細(xì)胞癌、尿道癌、白血病、前列腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、腦瘤、小兒腫瘤以及肉瘤。
21.—種可以用來實現(xiàn)權(quán)利要求1至12、16、17以及20當(dāng)中任何一項所述方法的試劑盒，該試劑盒包括可用來測定KRAS基因中至少一處激活性突變的寡聚核苷酸或者多聚核苷酸，也可以包括但不一定包括可用來測定EGFR基因和/或者BRAF基因中至少一處激活性突變的寡聚核苷酸或者多聚核苷酸。
22.應(yīng)用權(quán)利要求6至8中任何一項所定義的HSP90抑制劑來制備用來治療、改善以及 /或者預(yù)防癌癥的藥物制劑；此類癌癥以在KRAS基因中至少有一處激活性突變?yōu)樘卣鳌?br> 23.應(yīng)用權(quán)利要求6至8中任何一項所定義的某種HSP90抑制劑，來治療、改善以及/ 或者預(yù)防以KRAS基因中至少有一處突變?yōu)樘卣鞯陌┌Y。
24.一種選自以下各種細(xì)胞系的細(xì)胞系組合A427、A549, Calu-U Calu-3、Calu-6、 H1299、H1355、H1395、H1437、H1563、H1568、H1648、H1650、H1666、H1734、H1755、H1770、 H1781、H1792、H1819、H1838、H1915、H1944、H1975、H1993、H2009、H2030、H2052、H2087、 H2110、H2122、H2126、H2172、H2228、H23、H2347、H2444、H28、H358、H441、H460、H520、H522、 H596、H647、H661、H820、HCC2935、HCC4006、HCC827、SK-LU-I、EKVX,H322M、H0P-62、H0P-92、 Colo699、DV-90、HCC15、HCC366、HCC44、HCC78、LCLC103H、LCLC97TM1 以及 LouNH91。
25.應(yīng)用權(quán)利要求M所定義的細(xì)胞系組合來預(yù)測對某種藥物的易感性。
26.應(yīng)用權(quán)利要求25，其中所說的藥物是指某種HSP90抑制劑。
全文摘要
本項發(fā)明涉及一種挑選對HSP90抑制劑具有易感性的細(xì)胞、組織或者培養(yǎng)細(xì)胞的方法。另外還描述了一種測定哺乳動物的腫瘤細(xì)胞或者癌細(xì)胞對HSP90抑制劑治療的反應(yīng)情況的方法。尤其是，本項發(fā)明提供了一種體外診斷方法以篩選出那些對HSP90抑制劑具有易感性的患者，其中包括應(yīng)用可以用于檢測KRAS基因中激活性突變的寡核苷酸或者多聚核苷酸。本項發(fā)明還涉及對一種癌癥的療效進(jìn)行檢測評估或監(jiān)測的方法，此類癌癥以KRAS基因中至少出現(xiàn)一處激酶激活性突變?yōu)樘卣?，也可能但非必須在EGFR和/或者BRAF基因中也至少出現(xiàn)一處激活性突變。此外，還介紹了一種對癌癥尤其是具有上述基因突變特征的癌癥的療效進(jìn)行預(yù)測的方法。最后，應(yīng)用具有上述基因突變特征的(轉(zhuǎn)基因)非人類動物模型或者(轉(zhuǎn)基因)細(xì)胞模型對抗癌藥物進(jìn)行篩選和/或者驗證，并提供了一套可以實現(xiàn)上述各種檢測功能的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102216775SQ200980141367
公開日2011年10月12日 申請日期2009年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月18日
發(fā)明者K·王, K·馬林, P·弗朗莫特, R·托馬斯, T·贊德 申請人:科隆大學(xué), 馬克斯·普朗克科學(xué)促進(jìn)協(xié)會