專利名稱：包含消泡劑的疏水蛋白溶液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包含消泡劑的疏水蛋白溶液。特別地，它涉及一種通過發(fā)酵方法獲得的包含消泡劑的疏水蛋白溶液。
背景技術(shù)：
發(fā)泡是需氧深層發(fā)酵中的常見問題。發(fā)泡由于將氣體鼓入(sparging)發(fā)酵培養(yǎng)基而引起，將氣體鼓入發(fā)酵培養(yǎng)基的目的是為正在培養(yǎng)的需氧有機(jī)體(例如細(xì)菌、酵母、真菌、藻類、細(xì)胞培養(yǎng)物)的生長提供氧氣。若發(fā)酵培養(yǎng)基含有諸如蛋白質(zhì)、多糖或脂肪酸之類的表面活性組分，則當(dāng)鼓入的氣泡脫離液體時(shí)，可在培養(yǎng)基的表面上形成泡沫。發(fā)泡引起許多問題，包括不合需要地將產(chǎn)品、營養(yǎng)素和細(xì)胞帶(stripping)入泡沫，并且可能使工藝保持變得困難?？刂瓢l(fā)泡的一種已知方法是使用消泡劑，其中的幾類是常用的基于硅氧烷的消泡劑(例如聚二甲基硅氧烷)、聚亞烷基二醇(例如聚丙二醇)、脂肪酸、聚酯和天然油 (例如亞麻籽油、大豆油)。消泡劑代替氣泡表面上的發(fā)泡組分，導(dǎo)致泡沫因氣泡聚結(jié)而破滅。在發(fā)酵開始和/或期間加入消泡劑。
當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)品有意用于食品、個(gè)人用品或藥品時(shí)，非常希望通過生產(chǎn)有機(jī)體將所述產(chǎn)品分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中(即，細(xì)胞外而非細(xì)胞內(nèi)制備)。這樣不需要通過物理或化學(xué)方法破壞細(xì)胞，以便釋放供回收的產(chǎn)品。通過保持細(xì)胞完整，可容易地將細(xì)胞材料與產(chǎn)品分離， 以致產(chǎn)品不含細(xì)胞內(nèi)材料和遺傳材料，所述材料通常被視為不合需要的污染物。若生產(chǎn)有機(jī)體已經(jīng)過基因修飾，這樣做可能尤其重要。然而，細(xì)胞外制備疏水蛋白可加強(qiáng)發(fā)酵罐中的發(fā)泡程度。使用消泡劑在疏水蛋白的細(xì)胞外制備中產(chǎn)生特殊問題，其原因有二 第一，由于疏水蛋白本身促進(jìn)了發(fā)酵罐中的發(fā)泡，因此所需消泡劑的量增加。第二，由于消泡劑與疏水蛋白一起存在將削弱疏水蛋白的功能(functionality)，因此必須基本上去除消泡劑。
Bailey 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 58 (2002) p721_727 公開了通過里氏木霉(Trichoderma reesei)轉(zhuǎn)化株的發(fā)酵來制備疏水蛋白HFB I和HFB II。使用消泡劑 (Struktol J633)來防止發(fā)泡，并使用雙水相萃取提純疏水蛋白。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，疏水蛋白溶液中可以存在某種水平的消泡劑，而疏水蛋白保留它的至少部分功能。因此，存在一種包含消泡劑的疏水蛋白溶液，從而簡化它的生產(chǎn)過程并導(dǎo)致顯著的節(jié)約是可能的。
發(fā)明簡述 本發(fā)明的目的是提供一種包含至少300mg/l疏水蛋白和至少0. 3mg/l消泡劑的水溶液，其中消泡劑/疏水蛋白重量比低于0. 2，優(yōu)選低于0. 15，更優(yōu)選低于0. 1。
優(yōu)選地，該水溶液包含至少0. 5mg/l消泡劑。
還優(yōu)選，疏水蛋白是II類疏水蛋白，最優(yōu)選是來自里氏木霉(Trichoderma reesei)的 HFBI 或 HFB II。
還優(yōu)選，消泡劑具有濁點(diǎn)。
優(yōu)選對(duì)該水溶液進(jìn)行濃縮，以便消泡劑/疏水蛋白比例保持低于0. 2，但是它的疏水蛋白含量高于ig/ι，優(yōu)選I0g/1，甚至更優(yōu)選100g/l。
發(fā)明詳述 除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有本領(lǐng)域(例如細(xì)胞培養(yǎng)、 分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交技術(shù)和生物化學(xué)領(lǐng)域)普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。用于分子和生物化學(xué)方法的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可見于Sambrook等，Molecular Cloning =A Laboratory Manual, 3 , (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1 Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology (1999) H 4 片反， Johnffiley & Sons. Inc. ( 5 片反白勺g禾爾力 Current Protocols in Molecular Biology) 中。
疏水蛋白 可通過培養(yǎng)絲狀真菌如絲狀菌(例如，木霉)，擔(dān)子菌和子囊菌獲得疏水蛋白。特別優(yōu)選的宿主是食品等級(jí)的有機(jī)體，如栗疫病菌，其分泌一種稱為cryparin的疏水蛋白 (MacCabe 和 Van Alfen, 1999, App. Environ. Microbiol 65:5431-5435)。類似地，可從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)獲得表面活性肽，可從例如銅綠假單胞菌(Pseudomanas aeruginosa)、紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、分枝桿菌屬物禾中(Mycobacterium species)和球擬酵母(Torulopsis bomb i col a)獲得糖脂(Desai 和 Banat, Microbiology and Molecular Biology Reviews, Mar. 1997,p47_64)。
我們以前曾在EP 1623631中發(fā)現(xiàn)，疏水蛋白允許產(chǎn)生具有優(yōu)異的抗歧化 (disproportionation)和抗聚結(jié)穩(wěn)定性的水性泡沫。由于疏水蛋白是非常有效的發(fā)泡劑， 因此它們?cè)诎l(fā)酵培養(yǎng)基中的存在對(duì)泡沫控制形成一個(gè)特別挑戰(zhàn)。
疏水蛋白是一類充分定義的蛋白(ffessels,1997，Adv. Microb. Physio. 38 :1-45 ； ffosten,2001, Annu Rev. Microbiol. 55 :625-646)，其能夠在疏水/親水界面處自組裝，并具有以下保守序列 Xn-C-X5_9-C-C-Xn_39-C-X8_23-C-X5_9-C-C-X6_18-C-Xm，(SEQ ID No. 1) 其中X代表任何氨基酸，η和m獨(dú)立地代表整數(shù)。典型地，疏水蛋白具有至多125 個(gè)氨基酸的長度。該保守序列中的半胱氨酸殘基(C)是二硫橋鍵(bridge)的一部分。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“疏水蛋白，，具有更寬的含義，包括仍然顯示在疏水-親水界面自組裝產(chǎn)生蛋白質(zhì)膜的特性的功能上等價(jià)的蛋白質(zhì)，例如包含以下序列或其部分，仍然顯示在疏水-親水界面自組裝產(chǎn)生蛋白質(zhì)膜的特性的蛋白質(zhì) Xn-C-XHQ-C-XH-C-XHQQ-C-XHQQ-C-XHQ-C-XH-C-X^-C-XJSEQ ID No. 2)。
根據(jù)本發(fā)明的定義，可通過將蛋白質(zhì)吸附到特氟隆上，并使用圓二色性，以確定二級(jí)結(jié)構(gòu)(一般是α -螺旋)的存在來檢測自組裝(De Vocht等人，1998，Biophys. J. 74 2059-68)。
可以通過在蛋白質(zhì)溶液中孵育特氟隆片，然后用水或緩沖劑洗滌至少3次來確定膜的形成(Wosten等人，1994, Embo. J. 13 =5848-54)。可通過如本領(lǐng)域充分建立的任何合適的方法例如用熒光標(biāo)記物標(biāo)記，或者通過使用熒光抗體來顯現(xiàn)蛋白質(zhì)膜。m和η的值典型為 0-2000，但更通常地，m和η的總和小于100或200。在本發(fā)明的上下文中，疏水蛋白的定義包括疏水蛋白與另一種多肽的融合蛋白，以及疏水蛋白與其他分子如多糖的綴合物。
至今所鑒定的疏水蛋白一般歸類為I類或II類。這兩種類型已在真菌中鑒定為分泌性蛋白質(zhì)，它們?cè)谑杷缑嫣幾越M裝成兩親膜。I類疏水蛋白的組裝體(Assemblage)
4一般相對(duì)不可溶解，而II類疏水蛋白的那些組裝體容易溶解在各種溶劑中。優(yōu)選地，所述疏水蛋白溶于水，這意味著，其至少0. 1%，優(yōu)選至少0.5%可溶于水。至少0. 可溶于水是指使99. 9mL水中的0. Ig疏水蛋白在20°C下經(jīng)受30000g離心30分鐘時(shí)，不發(fā)生疏水蛋白沉淀。
在絲狀細(xì)菌如放線菌(Actinomycete sp.)和鏈霉菌(Sti^ptomyces sp.)中也鑒定了疏水蛋白樣蛋白質(zhì)(例如 “chaplins”) (W0 01/74864 ；Talbot, 2003, Curr. Biol, 13 R696-R698)。與真菌疏水蛋白形成對(duì)比，這些細(xì)菌蛋白可能只形成至多一個(gè)二硫橋鍵，因?yàn)樗鼈兛赡苤挥袃蓚€(gè)半胱氨酸殘基。此類蛋白質(zhì)是具有SEQ ID No. 1和2中所示共有序列的疏水蛋白的功能性等價(jià)體的一個(gè)實(shí)例，并包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
已經(jīng)從超過16個(gè)真菌物種中克隆了多于34種編碼疏水蛋白的基因(參見例如 W096/41882，其給出了雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)中鑒定的疏水蛋白的序列；以及 Wosten, 2001, Annu Rev. Microbiol. 55 :625-646)。就本發(fā)明而言，與天然存在的疏水蛋白在氨基酸水平上具有至少80%的同一性的疏水蛋白也包括在術(shù)語“疏水蛋白”內(nèi)。
消泡劑 術(shù)語“消泡劑”既包括通常在發(fā)生發(fā)泡前加入的消泡劑，也包括通常在一旦已經(jīng)形成泡沫就加入的那些消泡劑(有時(shí)稱作“去泡劑(defoamers)”)。用于本發(fā)明的消泡劑的定義見“泡沫和它在發(fā)酵系統(tǒng)中的緩解”-Beth Junker-Biotechnology Progress, 2007, 23,768-784。
適用于本發(fā)明的一組特定消泡劑是顯示濁點(diǎn)的那些消泡劑。濁點(diǎn)是當(dāng)發(fā)生相分離(即，消泡劑分子形成散射光的聚集體)時(shí)，消泡劑水溶液變得明顯渾濁的溫度，如 J.Eastoe 在 T. Cosgrove 編著的 Colloid Science principles, Methods and Applications(Blackwell Publishing,2005)中 Surfactant Aggregation and Adsorption at Interfaces 第 63 頁所述。
顯示濁點(diǎn)的消泡劑的例子包括基于聚亞烷基二醇(PAG)的化合物，例如環(huán)氧乙烷 /環(huán)氧丙烷嵌段共聚物、基于環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物的多元醇、以及環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的聚醚；以及基于脂肪酸酯的化合物。
濁點(diǎn)取決于表面活性劑的組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)。例如，對(duì)于聚氧乙烯(PEO)非離子型表面活性劑，對(duì)于給定的疏水基團(tuán)，濁點(diǎn)隨著EO含量的增加而升高。優(yōu)選地，消泡劑的濁點(diǎn)在0°C與90°C之間，更優(yōu)選在5°C與60°C之間。
優(yōu)選地，消泡劑包含至少一種非離子型表面活性劑/聚合物，如聚醚、聚亞烷基二醇、環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物、基于環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷嵌段共聚物的多元醇、基于聚丙二醇的聚醚分散體或烷氧基化脂肪酸酯。基于PAG的消泡劑(例如可得自希倫賽勒赫公司(Schill and Seilacher) ^ Struktol J647)、基于Ε0/Ρ0嵌段共聚物的多元醇(例如可得自希倫賽勒赫公司的Mruktol J647)及其他非離子型表面活性劑消泡劑在消滅泡沫方面特別有效，即使存在強(qiáng)有力的發(fā)泡劑如疏水蛋白時(shí)也是如此。
可以使用消泡劑的混合物，在該情況下，這種混合物的濁點(diǎn)定義為單獨(dú)組分中的最高濁點(diǎn)。
顯示濁點(diǎn)的一些常見的市售消泡劑示于表1中。
表 1
權(quán)利要求
1.包含至少300mg/l疏水蛋白和至少0.3mg/l消泡劑的水溶液，其中該消泡劑/疏水蛋白重量比低于0.2，優(yōu)選低于0. 15，更優(yōu)選低于0. 1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的溶液，其中該疏水蛋白是II類疏水蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求3的溶液，其中該疏水蛋白是來自里氏木霉的HFBI或HFBII。
4.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的溶液，其中該消泡劑具有濁點(diǎn)。
5.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的溶液，其包含至少lg/Ι，優(yōu)選至少10g/l，甚至更優(yōu)選至少 100g/l的疏水蛋白。
全文摘要
包含至少300mg/l疏水蛋白和至少0.3mg/l消泡劑的水溶液，其中消泡劑/疏水蛋白重量比低于0.2，優(yōu)選低于0.15，更優(yōu)選低于0.1。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102186967SQ200980141223
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月16日
發(fā)明者A·R·科克斯, A·B·拉塞爾, C·M·蒂爾 申請(qǐng)人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司