專利名稱：灰樹(shù)花疏水蛋白及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物生物技術(shù)，特別涉及一種食用真菌疏水蛋白及其基因。
背景技術(shù)：
灰樹(shù)花又稱舞茸、栗子蘑、蓮花菇，學(xué)名貝葉多孔菌(Polyporus frondosus)，來(lái)源中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)，編號(hào)ACCC 50246。疏水蛋白是由絲狀真菌分泌的一類小分子量、疏水性蛋白質(zhì)，這類蛋白可以在兩相界面處自我裝配，形成一層兩性蛋白膜，可以改變介質(zhì)表面的親水或疏水性，即可以將疏水性表面變?yōu)橛H水表面或者將親水表面轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷砻妫⒕哂型笟獠煌杆膬?yōu)良性質(zhì)及良好的耐熱性，在理論上和應(yīng)用上均有著極高的價(jià)值。
1986年，Rosenberg和Kjelleberg小組在研究細(xì)菌與寄主吸附機(jī)理時(shí)首先提出了疏水蛋白這一概念，意指微生物細(xì)胞表面的任何疏水物質(zhì)(林福呈，真菌疏水蛋白的研究進(jìn)展，微生物學(xué)報(bào)，2001，4518-521)。隨后，荷蘭Wessels研究小組對(duì)裂褶菌疏水蛋白SC系列進(jìn)行了深入研究，為疏水蛋白的研究方法開(kāi)辟了新的思路(HAB.Wosten.Interfacial Self-Assembly ofa Fungal Hydrophobin into a Hydrophobic Rodlet Layer，PLANT CELL，1993；51567)，從此疏水蛋白的研究工作廣泛開(kāi)展。目前世界上已經(jīng)報(bào)道的疏水蛋白有近70種，其中報(bào)道的食用真菌疏水蛋白卻不是很多，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有真菌疏水蛋白及其相關(guān)基因的報(bào)道。
真菌疏水蛋白具有在兩相界面處自我裝配成膜的特殊性質(zhì)，這使它含有很多潛在的應(yīng)用價(jià)值。例如，在食品制造業(yè)上，疏水蛋白可改善食品對(duì)抗相變能力在不通氣狀態(tài)下形成穩(wěn)定泡沫；在果蔬保鮮方面，疏水蛋白可以在果蔬表面形成一層防腐保鮮被膜，這層被膜不僅可以防止多種微生物對(duì)果蔬的侵害，由于被膜本身是從食用真菌中提取出來(lái)的，因此可以直接食用，不用除去，甚為方便，彌補(bǔ)了保鮮膜及蠟封技術(shù)的缺陷；在日用產(chǎn)品中，疏水蛋白可通過(guò)自我裝配而將面部的油脂等疏水的成分包裹起來(lái)，再用水清洗將其除去，也可以作為保護(hù)頭發(fā)的天然膜，使發(fā)部維持清潔并保持一定水分；在蛋白質(zhì)固定化方面，疏水蛋白可以將疏水性的酶類固定于親水性的介質(zhì)表面，如生物芯片技術(shù)上，可以將探針更牢固的固定在載體表面。
灰樹(shù)花又稱舞茸、栗子蘑、蓮花菇，學(xué)名貝葉多孔菌(Polyporus frondosus)，是一種具有很高食用價(jià)值和藥用價(jià)值的蘑菇，其分泌的多糖物質(zhì)可以抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并有抗艾滋病的作用。因灰樹(shù)花疏水蛋白具有食用安全性，所以其理論和應(yīng)用研究具有特殊的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是分離一種新型天然表面膜材料，應(yīng)用于蛋白質(zhì)的固定化、生物芯片、保濕美容、果蔬保鮮和醫(yī)療衛(wèi)生中的傷口處理。
本發(fā)明的技術(shù)方案灰樹(shù)花疏水蛋白基因含324個(gè)核苷酸，編碼107個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，其中前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，該基因的堿基序列、編碼蛋白及成熟蛋白的氨基酸序列如下基因的堿基序列ATGTTCTCCAAGCTCGCCATCTTCGCTACTGCGGCCTTCGCCGTTCTTGCGGCTGCCACCCCTGTCCGCCGCCAACAGTGCACCACTGGCCAGCTCCAGTGCTGCGAGTCTACCTCCACTGCGAACGA
CCCGGCCACCAGCGAGCTCCTCGGTCTGATCGGCGTCGTCATCTCTGATGTCGACGCACTCGTCGGTCTCACCTGCTCGCCGATCTCCGTCATCGGCGTTGGCAGTGGCTCTGCGTGCACCGCGAACCCAGTGTGCTGTGACTCGTCGCCCATTGGTGGACTCGTCTCCATCGGATGTGTTCCGGTTAACGTCTGA編碼蛋白的氨基酸序列MFSKLAIFATAAFAVLAAATPVRRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV成熟蛋白的氨基酸序列TPVRRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV該基因序列經(jīng)過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，核酸序列未發(fā)現(xiàn)同源性基因；蛋白序列比對(duì)表明，由基因翻譯后的疏水蛋白HGFI為107個(gè)氨基酸，其中前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，與其同源性最高的為多年異擔(dān)子菌中的疏水蛋白2(hydrophobin 2)，其同源性為51％，屬于不同的疏水蛋白基因。
還包括與上述序列同源性等于或大于85％的核酸和蛋白序列。
編碼的蛋白質(zhì)可以用于蛋白質(zhì)的固定化(應(yīng)用于生物芯片和生物傳感器)，也可以作為生物膜活性材料(應(yīng)用于果蔬保鮮、保濕美容和醫(yī)療衛(wèi)生中的創(chuàng)面保護(hù)等方面)。
本發(fā)明的灰樹(shù)花疏水蛋白基因的分離方法是平皿培養(yǎng)灰樹(shù)花菌絲，采用異硫氰酸胍法提取灰樹(shù)花菌絲總RNA，用PolyATtractmRNA Isolation System(Promega公司)分離得到的灰樹(shù)花mRNA。通過(guò)M-MLV RTase cDNA synthesis Kit(寶生物工程公司)建立灰樹(shù)花cDNA文庫(kù)，以mRNA為模板，帶有XhoI酶切位點(diǎn)的Oligo(dT)12為引物，用逆轉(zhuǎn)錄法合成雙鏈cDNA。將雙鏈cDNA末端補(bǔ)平后與EcoRI接頭連接，磷酸化后用XhoI酶切，連接到EcoRI和XhoI雙酶切的載體pBluescript II SK(+)上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B中，構(gòu)建灰樹(shù)花的cDNA文庫(kù)。隨機(jī)篩選50個(gè)cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序，其中兩個(gè)cDNA序列包括相同的、完整的開(kāi)放閱讀框，含有324個(gè)核苷酸，是灰樹(shù)花疏水蛋白基因的編碼區(qū)。
本發(fā)明的灰樹(shù)花疏水蛋白的分離方法是用2％的SDS沸水浴處理灰樹(shù)花菌絲10分鐘，用蒸餾水清洗干凈，用氯仿/甲醇(3∶1)65℃水浴處理10分鐘，冷凍干燥得到備用菌絲。將備用菌絲用100％的三氟乙酸(TFA)冰水浴超聲波處理1分鐘，12000r/min離心除去菌絲，用氮?dú)鈱FA吹干后，溶解于50％的乙醇中，冷凍干燥后電泳得到8.6kDa的條帶，經(jīng)序列分析證明為灰樹(shù)花疏水蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的有益效果是真菌疏水蛋白可以在兩相界面自我裝配，形成約10納米厚的兩性蛋白膜，其成膜效率非常高，形成的兩性蛋白膜約10nm厚，每毫克的疏水蛋白足以形成一平方米大小的膜，覆蓋于物質(zhì)的表面。本發(fā)明灰樹(shù)花疏水蛋白來(lái)源于食用真菌，所以具有食用安全性，此外，還可用于蛋白質(zhì)的固定化、生物芯片、保濕美容、果蔬保鮮和醫(yī)療衛(wèi)生中的傷口處理。


圖1灰樹(shù)花總RNA的電泳圖譜圖2采用Oligotex mRNA midi kit分離得到的灰樹(shù)花mRNA圖3cDNA合成過(guò)程中單鏈和雙鏈cDNA的電泳4，圖5目的片段切膠回收的過(guò)程圖6切膠回收的雙鏈cDNA目的片段圖7水源性圖譜圖8，圖9灰樹(shù)花疏水蛋白編碼的蛋白質(zhì)前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列圖10灰樹(shù)花疏水蛋白的凝膠電泳具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實(shí)施例1灰樹(shù)花菌絲的培養(yǎng)1.灰樹(shù)花種子液的制備種子液培養(yǎng)基配方為葡萄糖40g/L，KH2PO42.5g/L，MgSO4·7H2O3g/L，胰蛋白胨5g/L，維生素B1 30mg/L，pH5.5～6.0，在250mL的三角瓶中培養(yǎng)，裝液量為20％，每瓶種子液中加入3.5～4.0g的玻璃珠。取3cm2的灰樹(shù)花平皿菌絲接菌，25℃，150r/min培養(yǎng)5天。
2.灰樹(shù)花菌絲的培養(yǎng)灰樹(shù)花菌絲培養(yǎng)基配方為葡萄糖20g/L，L-天冬氨酰1.5g/L，酵母抽提物1g/L，K2HPO41g/L，KH2PO40.46g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 5mg/L，維生素B10.12mg/L，瓊脂粉15g/L，pH5.5～6.0，在90cm平皿中培養(yǎng)，裝液量為30mL，取種子液2mL接菌，25℃培養(yǎng)8～10天，刮下菌絲，-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例2灰樹(shù)花疏水蛋白基因的分離1.總RNA提取取0.3g灰樹(shù)花菌絲置于研缽中，加入液氮研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移至11mL的離心管中，加入3mL變性液(6mol/L異硫氰酸胍，37.5mmol/L檸檬酸，0.75％十二烷基肌酸鈉，0.15mol/Lβ-巰基乙醇)，混勻；加入300μL 2mol/L NaAc溶液(pH4.0)，反復(fù)顛倒離心管；加入3mL水飽和酚(pH≤4.0)和1mL氯仿/異戊醇(24∶1)，劇烈振蕩10秒，冰浴15分鐘；4℃ 10000r/min離心20分鐘，轉(zhuǎn)移上清，用等體積酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)再抽提兩次；轉(zhuǎn)移上清，加入等體積的異丙醇，-70℃沉淀20分鐘，4℃ 10000r/min離心20分鐘；棄上清，將RNA沉淀用0.5mL無(wú)RNase的水溶解，加入1.5mL 4mol/L NaAc(pH7.0)，0℃過(guò)夜；4℃ 8000r/min離心15分鐘，75％乙醇洗滌沉淀兩次，將RNA溶解于適量無(wú)RNase的水中，-70℃保存。
圖1是灰樹(shù)花總RNA的電泳圖譜。
2.mRNA的分離通過(guò)Promage mRNA提取試劑盒(PolyATtractmRNA Isolation System)，從灰樹(shù)花總RNA中提取mRNA。
(1)探針的退火在一個(gè)無(wú)RNase的3mL離心管中，加入5mg總RNA，補(bǔ)充無(wú)RNase的去離子至總體積2.43mL；65℃水浴10分鐘；加入10μL生物素標(biāo)記的Oligo(dT)探針及60μL的20×SSC溶液，輕輕混勻，在室溫下使其冷卻。
(2)反應(yīng)液的制備在一個(gè)無(wú)RNase的11mL離心管中，加入0.125mL的20×SSC和4.875mL的無(wú)RNase的去離子水，制備5mL的0.5×SSC溶液；在無(wú)RNase的11mL離心管中，加入50μL的20×SSC和9.95mL的無(wú)RNase的去離子水，制備10mL的0.1×SSC溶液。
(3)洗滌抗生物素蛋白鏈菌素磁球顆粒(SA-PMPs)輕輕敲打離心管底部，使SA-PMPs溶解，將其放置在磁圈上，使SA-PMPs吸附在管壁上，這個(gè)過(guò)程大約30秒；小心的吸去上清；用1.5mL的0.5×SSC洗滌SA-PMPs三次，每次小心吸去上清；將洗脫后的SA-PMPs溶解于0.5mL的0.5×SSC中。
(4)獲得Oligo(dT)-mRNA復(fù)合體在含有的SA-PMPs溶液中加入退火試劑，室溫下孵育10分鐘，每1-2分鐘輕輕混勻；通過(guò)磁圈獲得SA-PMPs，并小心吸去上清；用1.5mL的0.1×SSC洗滌SA-PMPs四次，最后一次洗脫時(shí)，盡可能吸去上清。
(5)洗脫mRNA將最終的SA-PMPs溶于1.0mL的無(wú)RNase的水中，輕輕敲打試管底部，使其混勻；通過(guò)磁圈吸取上清，并轉(zhuǎn)移至無(wú)RNase的2mL離心管中，醋酸鈉沉淀獲得mRNA。
圖2是分離得到的灰樹(shù)花mRNA。
泳道1為TaKaRa的DL2000核酸分子量Marker；泳道2為灰樹(shù)花mRNA。
3.cDNA第一鏈的合成以mRNA為模板，帶有XhoI酶切位點(diǎn)的Oligo d(T)12為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV Rtase作用下轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈。
(1)在微量離心管中配置下表中反應(yīng)液，總量20μL，輕輕攪拌混勻。

(2)室溫放置10分鐘后，移至42℃水浴鍋中水浴1小時(shí)。
(3)反應(yīng)結(jié)束后置于冰中2分鐘。
4.cDNA第二鏈的合成先用RNaseH消化mRNA，然后以斷裂的mRNA作為第二鏈合成的引物，以cDNA一鏈為模板在DNA Polymerase I作用下合成cDNA第二鏈。
5.雙鏈cDNA末端補(bǔ)平在T4DNA polymerase的作用下將雙鏈cDNA的末端補(bǔ)平，補(bǔ)平后的cDNA需要經(jīng)過(guò)酚/氯仿/異戊醇純化，去除多余的蛋白等雜質(zhì)。
(1)在第一條鏈合成后的微量離心管中再加入下表中的反應(yīng)液，總量146μL。

(2)加入2μL DNA Polymerase I和2μL RNaseH/DNA Ligase Mixture，輕輕攪拌混勻。
(3)16℃反應(yīng)2小時(shí)。
(4)70℃加熱10分鐘，加入4μL T4DNA polymerase，輕輕攪拌。
(5)37℃反應(yīng)10分鐘，加入15μL 0.25M EDTA(pH8.0)以及15μL 10％SDS溶液，混和使反應(yīng)停止。
(6)加入200μL酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，混勻后12000r/min離心10分鐘。
(7)向水相中加入200μL氯仿/異戊醇(24∶1)，混勻后12000r/min離心10分鐘。
(8)取水相，加入150μL 4M醋酸銨和850μL無(wú)水乙醇，充分混勻，室溫放置10分鐘。
(9)4℃ 15000r/min離心5分鐘，用70％乙醇洗滌兩次，用20μL TE Buffer溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 圖3是cDNA合成過(guò)程中單鏈和雙鏈cDNA的電泳圖。
泳道1為TaKaRa的DL2000核酸分子量Marker；泳道2為雙鏈cDNA；泳道3為單鏈cDNA。
6.EcoRI接頭的加接EcoRI接頭(EcoRI Adaptor)在T4DNA連接酶(T4DNA Ligase)的作用下連接72小時(shí)，摩爾比為10∶1。
7.雙鏈cDNA末端的磷酸化和XhoI酶切加完接頭的cDNA雙鏈先在T4PNK(T4多聚核糖苷激酶)的作用下進(jìn)行末端磷酸化，然后經(jīng)內(nèi)切酶XhoI酶切消化后，產(chǎn)生XhoI粘性末端。
8.膠回收目的片斷采用寶生物瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit)回收0.5-2kb的目的片斷。
(1)使用TAE緩沖液配置1％瓊脂糖凝膠，電泳合成的灰樹(shù)花cDNA。
(2)在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，切碎，裝入1.5mL離心管中。
(3)加入800μL膠塊融化液DR-I Buffer，混勻后75℃水浴10分鐘，使膠塊完全融化。
(4)加入400μL DR-II Buffer，均勻混和，轉(zhuǎn)移至Spin Column中，3600r/min離心1分鐘，棄濾液。將500μL的Rinse A加入Spin Column中，3600r/min離心30秒，棄濾液。
(5)將700μL的Rinse B加入Spin Column中，3600r/min離心30秒，棄濾液，并重復(fù)此步驟。
(6)將Spin Column安置于新的1.5mL離心管上，在Spin Column膜的中央處加入25μL的無(wú)菌蒸餾水，室溫靜置1分鐘。
(7)12000r/min離心1分鐘洗脫DNA。
圖4和圖5為目的片段切膠回收的過(guò)程。
圖中兩側(cè)泳道為TaKaRa的DL2000核酸分子量Marker；中間泳道為回收的片段。
圖6為切膠回收的雙鏈cDNA目的片段。
泳道1為TaKaRa的DL2000核酸分子量Marker；泳道2為切膠回收的0.5-2kb長(zhǎng)度的片段；泳道3為切膠回收的大于2kb長(zhǎng)度的片段。
9.連接和轉(zhuǎn)化(cDNA文庫(kù)構(gòu)建完成)以Insert∶vector＝3∶1的比例將insert和載體pBluescript II SK(+)在T4DNA Ligase的作用下連接過(guò)夜。所有的連接產(chǎn)物在做轉(zhuǎn)化前通過(guò)Millipore的膜純化去除鹽離子，純化后得到14μL連接產(chǎn)物。取1μL連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化商品感受態(tài)細(xì)胞DH10B，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后觀察生長(zhǎng)情況。
轉(zhuǎn)化結(jié)果20μL涂板長(zhǎng)了289個(gè)白色單菌落，藍(lán)白斑比例為61∶289，轉(zhuǎn)化后共得1000μL菌液，所以庫(kù)容為289×50×14＝2.0×105個(gè)克隆。
10.灰樹(shù)花疏水蛋白基因的篩選隨機(jī)篩選50個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行核苷酸序列分析，其中兩個(gè)序列相同，含有八個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，其水源性圖譜(圖7)及核苷酸序列說(shuō)明它是疏水蛋白的基因。
11.灰樹(shù)花疏水蛋白的序列分析通過(guò)http://au.expasy.org網(wǎng)站推測(cè)，所得到的灰樹(shù)花疏水蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為10561.22Da，等電點(diǎn)為4.23。
通過(guò)http://www.cbs.dtu.dk網(wǎng)站推測(cè)，所得到的灰樹(shù)花疏水蛋白編碼的蛋白質(zhì)前19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽(圖8，圖9)，則除去信號(hào)肽后成熟的疏水蛋白分子量約為8664.90，等電點(diǎn)為3.96。
實(shí)施例3灰樹(shù)花疏水蛋白的分離1.菌絲的預(yù)處理用2％的SDS沸水浴處理灰樹(shù)花菌絲10分鐘，用蒸餾水清洗干凈，用氯仿/甲醇(3∶1)65℃水浴處理10分鐘，冷凍干燥得到備用菌絲。
2.灰樹(shù)花疏水蛋白的抽提將備用菌絲用100％的TFA冰水浴超聲波處理1分鐘，12000r/min離心除去菌絲，用氮?dú)鈱FA吹干后，溶解于50％的乙醇中，冷凍干燥后得到灰樹(shù)花疏水蛋白。
3.灰樹(shù)花疏水蛋白的鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)灰樹(shù)花疏水蛋白，得到8.5kDa的條帶，經(jīng)過(guò)氨基酸序列測(cè)定，為灰樹(shù)花疏水蛋白。
圖10為灰樹(shù)花疏水蛋白的電泳結(jié)果。
泳道1為上海生工低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品；泳道2和泳道3為分離得到的疏水蛋白樣品SEQUENCE LISTING<110>天津森喬生物科技發(fā)展有限公司
<120>灰樹(shù)花疏水蛋白及其基因<130>20060125<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>324<212>DNA<213>真菌灰樹(shù)花<220>
<221>CDS<222>(1)..(324)<400>1atg ttc tcc aag ctc gcc atc ttc gct act gcg gcc ttc gcc gtt ctt48Met Phe Ser Lys Leu Ala Ile Phe Ala Thr Ala Ala Phe Ala Val Leu1 5 10 15gcg gct gcc acc cct gtc cgc cgc caa cag tgc acc act ggc cag ctc96Ala Ala Ala Thr Pro Val Arg Arg Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu20 25 30cag tgc tgc gag tct acc tcc act gcg aac gac ccg gcc acc agc gag144Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu35 40 45ctc ctc ggt ctg atc ggc gtc gtc atc tct gat gtc gac gca ctc gtc192Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val50 55 60ggt ctc acc tgc tcg ccg atc tcc gtc atc ggc gtt ggc agt ggc tct240Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser65 70 75 80gcg tgc acc gcg aac cca gtg tgc tgt gac tcg tcg ccc att ggt gga288Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly85 90 95ctc gtc tcc atc gga tgt gtt ccg gtt aac gtc tga324Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val100 105<210>2<211>107<212>PRT<213>真菌灰樹(shù)花
<400>2Met Phe Ser Lys Leu Ala Ile Phe Ala Thr Ala Ala Phe Ala Val Leu1 5 10 15Ala Ala Ala Thr Pro Val Arg Arg Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu20 25 30Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu35 40 45Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val50 55 60Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser65 70 75 80Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly85 90 95Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val100 105<210>3<211>107<212>PRT<213>真菌灰樹(shù)花<220>
<221>PROPEP<222>(1)..(107)<400>3Met Phe Ser Lys Leu Ala Ile Phe Ala Thr Ala Ala Phe Ala Val Leu1 5 10 15Ala Ala Ala Thr Pro Val Arg Arg Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu20 25 30Gln Cys Cys Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu35 40 45Leu Leu Gly Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val50 55 60Gly Leu Thr Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser65 70 75 80Ala Cys Thr Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly85 90 95Leu Val Ser Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val100 105
<210>4<211>88<212>PRT<213>真菌灰樹(shù)花<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(88)<400>4Thr Pro Val Arg Arg Gln Gln Cys Thr Thr Gly Gln Leu Gln Cys Cys1 5 10 15Glu Ser Thr Ser Thr Ala Asn Asp Pro Ala Thr Ser Glu Leu Leu Gly20 25 30Leu Ile Gly Val Val Ile Ser Asp Val Asp Ala Leu Val Gly Leu Thr35 40 45Cys Ser Pro Ile Ser Val Ile Gly Val Gly Ser Gly Ser Ala Cys Thr50 55 60Ala Asn Pro Val Cys Cys Asp Ser Ser Pro Ile Gly Gly Leu Val Ser65 70 75 80Ile Gly Cys Val Pro Val Asn Val8權(quán)利要求
1.食用真菌灰樹(shù)花的疏水蛋白，其特征在于，其編碼基因含324個(gè)核苷酸，編碼107個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，含有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，該基因序列如下ATGTTCTCCAAGCTCGCCATCTTCGCTACTGCGGCCTTCGCCGTTCTTGCGGCTGCCACCCCTGTCCGCCGCCAACAGTGCACCACTGGCCAGCTCCAGTGCTGCGAGTCTACCTCCACTGCGAACGACCCGGCCACCAGCGAGCTCCTCGGTCTGATCGGCGTCGTCATCTCTGATGTCGACGCACTCGTCGGTCTCACCTGCTCGCCGATCTCCGTCATCGGCGTTGGCAGTGGCTCTGCGTGCACCGCGAACCCAGTGTGCTGTGACTCGTCGCCCATTGGTGGACTCGTCTCCATCGGATGTGTTCCGGTTAACGTCTGA編碼蛋白的序列如下MFSKLAIFATAAFAVLAAATPVRRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV成熟蛋白的序列如下TPVRRQQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食用真菌灰樹(shù)花的疏水蛋白，其特征在于，還包括與上述序列同源性等于或大于85％的核酸和蛋白序列。
3.食用真菌灰樹(shù)花的疏水蛋白在蛋白質(zhì)的固定化方面的應(yīng)用，包括生物芯片和生物傳感器，和在生物膜活性材料方面的應(yīng)用，包括果蔬保鮮、保濕美容和醫(yī)療衛(wèi)生中的創(chuàng)面保護(hù)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了真菌灰樹(shù)花疏水蛋白及其基因，屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明分離并測(cè)定了含有324個(gè)核苷酸的灰樹(shù)花疏水蛋白基因，分離并純化了灰樹(shù)花疏水蛋白?；覙?shù)花疏水蛋白基因編碼107個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，含有19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。該蛋白可以安全地用于蛋白質(zhì)的固定化，包括生物芯片和生物傳感器；也可以作為生物膜活性材料，應(yīng)用于果蔬保鮮、保濕美容和醫(yī)療衛(wèi)生中的創(chuàng)面保護(hù)等方面。
文檔編號(hào)C07K14/37GK1944650SQ20061001311
公開(kāi)日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2006年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月24日
發(fā)明者喬明強(qiáng), 于雷, 徐海津, 張強(qiáng) 申請(qǐng)人:天津森喬生物科技發(fā)展有限公司