專利名稱：染色試劑盒及其制備方法、染色方法、用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種染色試劑盒及其制備方法、染色方法和在生殖道感染/性傳播疾病的快速多項病原體及細胞學(xué)檢查中的應(yīng)用。
姬姆薩(Giemsa)快速染色法。Bryon-PA(Patnol Biol 9aris 1996；24(1)75-9)曾報告將Giemsa快速染色法用于骨髓涂片檢查。1977年Thatcher-RW等又用于眼結(jié)膜細胞學(xué)檢查，1978年Howell-WM(HumGenet.1978；43(1)53-6)用于細胞染色體檢查。同年，國內(nèi)學(xué)者金樹貞等用于快速細胞學(xué)診斷惡性腫瘤，1981年筆者也用于快速腫瘤細胞診斷。其染色速度快，僅需3分鐘，對細胞核著色較好，但對細胞漿及細胞膜和其中的中性顆粒則染色較差。
甲等胺藍酒精液快速染色法，1978年國內(nèi)學(xué)者龍凈(新醫(yī)學(xué)，1978；(8)416)曾用此方法染腫瘤組織印片，對手術(shù)中腫瘤進行診斷；1980年唐立吾(中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1980；3(1)42)亦以該液用于細胞學(xué)檢查。其染色快速，僅需3分鐘，但分色較差，細胞結(jié)構(gòu)不夠清晰。
Diff-Quik快速染色法，1984年Kass LG(NEWYorkIGAkusHOIN，1984；1546)用于穿刺涂片檢查。1989年Tollerud DJ{chest、1989；95(37494-7)}用于愛滋病患者肺束囊蟲鑒定。其染色快速，僅需2分鐘，但價格昂貴。
瑞氏-姬姆薩混合染色(《血液病學(xué)》王鳳計主編，天津科學(xué)技術(shù)出版社，1990年出版)主要用于血涂片檢查，染色方法為選用瑞氏液染色25分鐘，除去瑞氏染液，再用姬姆薩染液染色4分鐘。用自來水沖洗后，置空氣中自行干燥即可。瑞氏染液對胞漿著色良好。姬姆薩液則對核著色良好。該法染色速度較慢，需用30多分鐘。
對非淋菌性泌尿道感染，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法耗時過長，微量免疫熒光法不十分標準化，國際通過SyV2試劑昂貴，均不易推廣本發(fā)明的另一目的在于提供一種本發(fā)明試劑盒的制備方法。
本發(fā)明的進一步的目的在于提供一種本發(fā)明試劑盒的染色方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述試劑盒在一張宮頸刮片上對癌變細胞、紅血球、彎曲活菌、陰道清潔度、雌激素水平、加德納氏菌、滴蟲、霉菌、淋病雙球菌、沙眼衣原體等多個項目的檢測中的應(yīng)用。以適應(yīng)生殖道感染/性傳播疾病的快診快治，并解決量大面寬的計劃生育的“生殖道感染干預(yù)工程”的急切問題，以實現(xiàn)對癌瘤患者早診早治的技術(shù)目標。
本發(fā)明的WG法，即將瑞氏(Wright)法與姬姆薩(Giemsa)快速染色法結(jié)合后的方法的簡稱。
本發(fā)明的染色試劑盒，由固定液、染色液、分化液組成，
其中固定液含50％無水甲醇和50％無水乙醇(體積百分比)，染色液含瑞氏粉0.5-1.5g，姬姆薩氏粉0.5-1.5g，天青II0.2-0.6g，甘油33-100ml，甲醇(AR)600-900ml。
分化液無水磷酸二氫鉀6-7g，無水磷酸氫二鈉2.5-3g，蒸餾水1000ml。
本發(fā)明的染色試劑盒的制備方法為制備固定液將50％無水甲醇和50％無水乙醇(體積百分比)等量相加后即可使用，制備染色液將0.5-1.5g瑞氏粉和0.5-1.5g姬姆薩氏粉同放于潔凈的乳缽內(nèi)，加入少量甲醇充分研磨后，吸取上層液，再加入少量甲醇，繼續(xù)研磨，再吸上層液，如此連續(xù)數(shù)次，直至將乳缽內(nèi)染劑充分研溶洗凈，到入棕色玻璃瓶中，加入天青II0.2-0.6g，甘油33-100ml，補足甲醇至600-900ml。每日充分搖動一次，共一周，再存放一周后過濾，用棕色磨口玻璃瓶貯存?zhèn)溆谩?br> 制備分化液無水磷酸二氫鉀6-7g，無水磷酸氫二鈉2.5-3g，加蒸餾水1000ml，用磷酸鹽調(diào)整PH值為PH6.4-6.8即可。
本發(fā)明的的染色試劑盒的染色方法，其步驟為固定在宮頸刮片上滴固定液7-10滴，優(yōu)選4-10滴；固定21-30秒，優(yōu)選15-30秒；側(cè)動玻片倒去固定液。
染色滴染色液1-4滴，優(yōu)選2-3滴；將染液鋪蓋標本，染5-8秒鐘。
分化立即滴加分化液4-14滴，優(yōu)選8-12滴；輕輕轉(zhuǎn)動玻片，使之與染色液混均，分化30-38秒。
水洗用細小流水緩緩沖去殘液及其沉淀物，擦去玻片背面水分，濕片鏡檢。
病理細胞學(xué)及病原體診斷，貴在準快，非此難以使生殖感染及癌瘤患者獲得早診早治，而快速診斷的技術(shù)關(guān)鍵，是要有一個快速的染色方法。本發(fā)明WGRS一分鐘染色法，達到了快速、準確、簡單、廉價、檢查項目多的醫(yī)學(xué)檢測方法，它將兩個檢查重點(癌變細胞+病原體)相結(jié)合，形成既用于防癌普查又能用于生殖道感染性疾病檢查的“宮頸刮片快十項”，即可以在一張宮頸刮片上對癌變細胞、紅血球、彎曲活菌、陰道清潔度、雌激素水平、加德納氏菌、滴蟲、霉菌、淋病雙球菌、沙眼衣原體等多個項目的檢測。
對WG染色下惡性腫瘤細胞形態(tài)學(xué)特征，從細胞病理學(xué)角度，對各種腫瘤細胞進行快速定性診斷，已經(jīng)過手術(shù)室、內(nèi)窺鏡室、防癌及性傳播疾病普查現(xiàn)場的13346例的臨床檢查驗證。
對生殖道感染性疾病，在WG染色下，可以清楚顯示生殖道感染/性傳播疾病的各種病原體的形態(tài)特征，通過12205例宮頸刮片檢查結(jié)果表明，可以快速診斷引起生殖道感染的多種疾病。如細菌性陰道炎、淋病性陰道炎、非淋病性陰道炎、滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎等。
下表以巴氏染色12531例，HE染色13746例，WG快速染色10185例的宮頸刮片作對比觀察，其對比結(jié)果如附表所示
經(jīng)過了三萬多例的檢查驗證，證明該方法突出的優(yōu)點是1.制片速度快，僅需兩分鐘；2.準確率高，全診斷準確率可達98％；3.設(shè)備簡單操作簡便，可在手術(shù)室現(xiàn)場，內(nèi)窺鏡室現(xiàn)場，防癌及性傳播疾病普查現(xiàn)場進行；4.費用低廉，適合國情，便于推廣；5.染色效果良好，能清楚地顯示子宮陰道上皮的細胞層次，細胞級別和雌激素水平的影響程度，還因用固定脫水劑少，顯得細胞較大，伸展良好，形態(tài)自然，變形輕微，尤其是分化差的腫瘤細胞，惡性特征突出，易于診斷。
隨著本發(fā)明的普遍推廣應(yīng)用，將為廣大育齡婦女的生殖健康和適應(yīng)量大面寬的“生殖道感染干預(yù)工程”的實施起到推動作用。
實施例1取50％無水甲醇和50％無水乙醇(體積百分比)等量相加后作為固定液；將瑞氏粉1.5g和姬姆薩氏粉1.5g，同放于潔凈的乳缽內(nèi)，加入少量甲醇充分研磨后，吸取上層液，再加入少量甲醇，繼續(xù)研磨，再吸上層液，如此連續(xù)數(shù)次，直至將乳缽內(nèi)染劑充分研溶洗凈，到入棕色玻璃瓶中，加入天青II0.6g，甘油100ml，補足甲醇至900ml作為染色液。每日充分搖動一次，共一周，再存放一周后過濾，用棕色磨口玻璃瓶貯存?zhèn)溆谩?br> 取無水磷酸二氫鉀7g，無水磷酸氫二鈉3g，加蒸餾水1000ml作為分化液，用磷酸鹽調(diào)整PH值為PH6.8即可。
試劑盒組成(50人份)，固定液20ML一瓶，染色液10ML一瓶，分化液20ML二瓶。
實施例2在宮頸刮片上滴固定液6滴，固定20秒鐘，側(cè)動玻片倒去固定液。滴染色液2滴，將染液鋪蓋標本，染5秒鐘。立即滴加分化液8滴，輕輕轉(zhuǎn)動玻片，使之與染色液混均，分化38秒鐘。用細小流水緩緩沖去殘液及其沉淀物，擦去玻片背面水分，濕片鏡檢。
注意1.用前必須將瓶口用針扎通，以便染液能暢通滴出。2.刮(涂)片時，位置要適當，標本量要足，手法要輕，涂抹要薄。標本過少往往是漏診的主要原因。3.染色時間可根據(jù)氣溫，標本薄厚，適當延長，但不能縮短。4.試劑盒應(yīng)置陰涼處，最好是2-8℃冰箱內(nèi)保存，有效期3-4年。
染色反應(yīng)上皮細胞呈紫紅色，胞漿呈淡蘭色，白細胞核呈紫紅色，漿中嗜堿性顆粒呈紫藍色，嗜酸性顆粒呈橙紅色，嗜中性顆粒微帶紅色，紅血球為橙紅色。滴蟲為淡蘭色，于頭部的梭性核呈淡紅色。霉菌菌絲為深棕色，芽孢顯色同菌絲。衣原體為淡黃至深棕色。雙球菌及加得納氏菌為淡灰色。
權(quán)利要求
1.一種染色試劑盒，由固定液、染色液、分化液組成，其中固定液含50％無水甲醇和50％無水乙醇(體積百分比)，染色液含瑞氏粉0.5-1.5g，姬姆薩氏粉0.5-1.5g，天青II0.2-0.6g，甘油33-100ml，甲醇(AR)600-900ml。分化液無水磷酸二氫鉀6-7g，無水磷酸氫二鈉2.5-3g，蒸餾水1000ml。
2.權(quán)利要求1染色試劑盒的制備方法為制備固定液將50％無水甲醇和50％無水乙醇(體積百分比)等量相加后即可使用，制備染色液將0.5-1.5g瑞氏粉和0.5-1.5g姬姆薩氏粉同放于潔凈的乳缽內(nèi)，加入少量甲醇充分研磨后，吸取上層液，再加入少量甲醇，繼續(xù)研磨，再吸上層液，如此連續(xù)數(shù)次，直至將乳缽內(nèi)染劑充分研溶洗凈，到入棕色玻璃瓶中，加入天青II0.2-0.6g，甘油33-100ml，補足甲醇至600-900ml。每日充分搖動一次，共一周，再存放一周后過濾，用棕色磨口玻璃瓶貯存?zhèn)溆谩Ｖ苽浞只簾o水磷酸二氫鉀6-7g，無水磷酸氫二鈉2.5-3g，加蒸餾水1000mL，用磷酸鹽調(diào)整PH值為PH6.4-6.8即可。
3.權(quán)利要求1的染色試劑盒的染色方法，其步驟為固定在宮頸刮片上滴固定液7-10滴，固定21-30秒，側(cè)動玻片倒去固定液。染色滴染色液1-4滴，將染液鋪蓋標本，染5-8秒鐘。分化立即滴加分化液4-14滴，輕輕轉(zhuǎn)動玻片，使之與染色液混均，分化30-38秒。水洗用細小流水緩緩沖去殘液及其沉淀物，擦去玻片背面水分，濕片鏡檢。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的染色方法，其步驟為固定在宮頸刮片上滴固定液4-10滴，固定15-30秒，側(cè)動玻片倒去固定液。染色滴染色液2-3滴，將染液鋪蓋標本，染5-8秒鐘。分化立即滴加分化液8-12滴，輕輕轉(zhuǎn)動玻片，使之與染色液混均，分化30-38秒。水洗用細小流水緩緩沖去殘液及其沉淀物，擦去玻片背面水分，濕片鏡檢。
5.權(quán)利要求1的染色試劑盒在一張宮頸刮片上對癌變細胞、紅血球、彎曲活菌、陰道清潔度、雌激素水平、加德納氏菌、滴蟲、霉菌、淋病雙球菌、沙眼衣原體等多個項目的檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種染色試劑盒及其制備方法、染色方法和在一張宮頸刮片上對癌變細胞、紅血球、彎曲活菌、陰道清潔度、雌激素水平、加德納氏菌、滴蟲、霉菌、淋病雙球菌、沙眼衣原體等多個項目的檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明試劑盒由固定液、染色液、分化液組成，染色方法的步驟是固定、染色、分化、水洗。本發(fā)明的優(yōu)點是，制片速度快，僅需兩分鐘；準確率高，全診斷準確率可達98％；設(shè)備簡單操作簡便，可在手術(shù)室現(xiàn)場，內(nèi)窺鏡室現(xiàn)場，防癌及性傳播疾病普查現(xiàn)場進行；費用低廉，適合國情，便于推廣；染色效果良好，還因用固定脫水劑少，顯得細胞較大，伸展良好，形態(tài)自然，變形輕微，尤其是分化差的腫瘤細胞，惡性特征突出，易于診斷。
文檔編號C12Q1/04GK1434127SQ02102739
公開日2003年8月6日 申請日期2002年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月22日
發(fā)明者裴芳君 申請人:裴芳君