專(zhuān)利名稱(chēng)：比色分析方法及其使用的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及比色分析方法及其使用的試劑。
背景技術(shù)：
在臨床檢查或生物化學(xué)檢查等的領(lǐng)域，使用比色分析作為進(jìn)行葡萄糖、膽固醇等的成分分析的一種方法。舉例來(lái)說(shuō)，葡萄糖的比色分析通常如下首先葡萄糖氧化酶與葡萄糖(底物)作用，產(chǎn)生葡糖酸內(nèi)酯和過(guò)氧化氫，在過(guò)氧化物酶的存在下，通過(guò)Trinder試劑等的發(fā)色劑檢測(cè)過(guò)氧化氫。這種借助過(guò)氧化氫間接測(cè)定底物濃度的方法不限于葡萄糖，也適用于膽固醇等其他的成分分析。
但是，以前的比色分析具有以下問(wèn)題。首先，因?yàn)椴皇侵苯訙y(cè)定分析對(duì)象，而是借助過(guò)氧化氫間接測(cè)定，所以測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，舉例來(lái)說(shuō)，在葡萄糖測(cè)定的情況下，需要30-60秒。其次，以前的比色分析法因?yàn)樾枰瑫r(shí)穩(wěn)定兩種酶反應(yīng)系統(tǒng)，所以條件設(shè)定難。最后，由于必需氧，以前的比色分析法在氧不足時(shí)有反應(yīng)不充分的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
考慮到這樣的事情，本發(fā)明的目的是提供分析時(shí)間短并且分析值可信的比色分析方法。
為了實(shí)現(xiàn)前述目的，本發(fā)明的比色分析方法通過(guò)氧化還原酶，借助介質(zhì)，將電子從分析對(duì)象轉(zhuǎn)移到通過(guò)還原而發(fā)色的發(fā)色劑上，通過(guò)測(cè)定因此而產(chǎn)生的所述發(fā)色劑的發(fā)色來(lái)對(duì)所述分析對(duì)象進(jìn)行定性或定量，其中所述介質(zhì)是選自鐵絡(luò)合物、釕絡(luò)合物、鋨絡(luò)合物和銅絡(luò)合物的至少一種。
由于該方法的酶反應(yīng)為一步反應(yīng)，因此反應(yīng)系統(tǒng)簡(jiǎn)單并且穩(wěn)定性良好。此外，酶反應(yīng)為一步反應(yīng)，因?yàn)樵谒霭l(fā)色劑的反應(yīng)中使用所述介質(zhì)，因此酶反應(yīng)至發(fā)色反應(yīng)之間的時(shí)間極短，結(jié)果是，測(cè)定時(shí)間也縮短。舉例來(lái)說(shuō)，在葡萄糖作為本發(fā)明的比色分析方法中的底物的情況下，可能在約5秒或5秒以?xún)?nèi)的短時(shí)間內(nèi)測(cè)定。另外，在本發(fā)明的比色分析方法中，由于至發(fā)色的反應(yīng)快速，因此能夠節(jié)約酶，從而在成本上有利。此外，本發(fā)明的比色方法由于不借助過(guò)氧化氫就使發(fā)色劑發(fā)色，并且不必需氧，因此分析值的可信度也高。
其次，本發(fā)明的試劑用于前述的本發(fā)明的比色分析方法，其含有氧化還原酶、介質(zhì)和通過(guò)還原而發(fā)色的發(fā)色劑。此外，本發(fā)明的試驗(yàn)片含有前述本發(fā)明的試劑。這種試驗(yàn)片與產(chǎn)生過(guò)氧化氫的以前的比色分析用試驗(yàn)片相比，可能在極短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行分析，其分析值的可信度也高。


圖1是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的葡萄糖濃度和發(fā)色之間的關(guān)系的圖。
圖2是表示本發(fā)明的另一實(shí)施例的葡萄糖濃度和發(fā)色之間的關(guān)系的圖。
圖3是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的葡萄糖濃度和發(fā)色之間的關(guān)系的圖。
圖4是表示本發(fā)明的油一實(shí)施例的葡萄糖濃度和發(fā)色之間的關(guān)系的圖。
圖5是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖6A、6B是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖7A、7B是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖8是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖9是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖10是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖11是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖12是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖13是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖14A、14B是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖15是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
圖16A、16B是表示本發(fā)明的又一實(shí)施例的發(fā)色劑的發(fā)色的圖。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明的比色分析方法、試劑和試驗(yàn)片中，如前所述，所述介質(zhì)優(yōu)選是鐵絡(luò)合物、釕絡(luò)合物、鋨絡(luò)合物或銅絡(luò)合物，或者是它們的兩種或兩種以上的混合物。所述絡(luò)合物的配體的配位原子優(yōu)選為選自氮、氧和硫的至少一種。作為所述配體，例如，選自氨、聯(lián)吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、聯(lián)喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物的至少一種是優(yōu)選的。所述絡(luò)合物可以具有兩種或兩種以上配體，即，也可以是混合配體。所述配體的配位位置以外的氫原子的至少一個(gè)可以被取代基取代。作為所述取代基，例如烷基、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、砜基、磺?；?、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、?；Ⅴ０坊望u素基團(tuán)。
在本發(fā)明的比色分析方法、試劑和試驗(yàn)片中，氧化還原酶優(yōu)選是脫氫酶或氧化酶。分析對(duì)象優(yōu)選是，例如葡萄糖、膽固醇、乳酸、尿酸、丙酮酸、肌酸、肌酸酐，在這種情況下優(yōu)選的氧化還原酶是對(duì)應(yīng)于前述各物質(zhì)的脫氫酶或氧化酶。優(yōu)選地，隨著酶量增多，反應(yīng)加速。所述發(fā)色劑優(yōu)選是四唑鎓鹽。所述四唑鎓鹽優(yōu)選具有選自硝基苯基、噻唑基和苯并噻唑基的至少一種基團(tuán)。所述四唑鎓鹽的具體實(shí)例為MTT、INT、Neo-TB、硝基-TB、TB、WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-8、2-(2-苯并噻唑基)-3，5-二苯基四唑鎓溴化物、2-(2-苯并噻唑基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓溴化物、2，3-二(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓氯化物、2，3-二(4-硝基苯基)四唑鎓高氯酸鹽、3-(3-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物，以及3-(4-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物。
本發(fā)明的試驗(yàn)片優(yōu)選含有無(wú)機(jī)凝膠和所述試劑。通過(guò)無(wú)機(jī)凝膠阻斷氧，能夠防止發(fā)色劑氧化，也能夠防止由于再氧化導(dǎo)致的發(fā)色后退色。
如上所述，在本發(fā)明中，所述介質(zhì)優(yōu)選是鐵絡(luò)合物、釕絡(luò)合物、鋨絡(luò)合物、銅絡(luò)合物，特別優(yōu)選鋨絡(luò)合物。
(鐵絡(luò)合物)鐵絡(luò)合物的配體的實(shí)例為氨、聯(lián)吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、聯(lián)喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物等。可以是它們中的兩種或兩種以上組合的混合配體。
在聯(lián)吡啶的情況下，配位數(shù)是6。聯(lián)吡啶可以是未取代的，或引入取代基的。通過(guò)引入取代基，例如，可能調(diào)節(jié)溶解度和氧化還原電位等。取代位置為4，4’位和5，5’位。取代基的實(shí)例為烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺?；⑾趸?、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和鹵素基團(tuán)(例如溴、氯、碘等)。
聯(lián)吡啶鐵絡(luò)合物的實(shí)例為[Fe(聯(lián)吡啶)3]、[Fe(4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(4，4’-二苯基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(4，4’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(4，4’-二羥基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(4，4’-二羧基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(4，4’-二溴-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(5，5’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(5，5’-二苯基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(5，5’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(5，5’-二羥基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(5，5’-二羧基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Fe(5，5’-二溴-2，2’-聯(lián)吡啶)3]等。
在咪唑的情況下，配位數(shù)是6。咪唑可以是未取代的，或引入取代基的。通過(guò)引入取代基，例如，可能調(diào)節(jié)溶解度和氧化還原電位等。取代位置為2位、4位和5位。取代基的實(shí)例為烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺?；⑾趸?、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、?；?、酰胺基和鹵素基團(tuán)(例如溴、氯、碘等)。
咪唑鐵絡(luò)合物的實(shí)例為[Fe(咪唑)6]、[Fe(4-甲基-咪唑)6]、[Fe(4-苯基-咪唑)6]、[Fe(4-氨基-咪唑)6]、[Fe(4-羥基-咪唑)6]、[Fe(4-羧基-咪唑)6]和[Fe(4-溴-咪唑)6]等。
氨基酸的實(shí)例為精氨酸(L-Arg)。精氨酸鐵絡(luò)合物通常具有溶解性高的優(yōu)點(diǎn)?；旌吓潴w的實(shí)例是聯(lián)吡啶和咪唑的組合、聯(lián)吡啶和氨基酸的組合。例如，[Fe(咪唑)2(聯(lián)吡啶)2]或[Fe(L-Arg)2(聯(lián)吡啶)2]。使用混合配體可以賦予絡(luò)合物各種性質(zhì)，例如使用精氨酸提高絡(luò)合物的溶解性。
(釕絡(luò)合物)釕絡(luò)合物的配體的實(shí)例為氨、聯(lián)吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、聯(lián)喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物等?？梢允撬鼈冎械膬煞N或兩種以上組合的混合配體。
在聯(lián)吡啶的情況下，配位數(shù)是6。聯(lián)吡啶可以是未取代的，或引入取代基的。通過(guò)引入取代基，例如，可能調(diào)節(jié)溶解度和氧化還原電位等。取代位置為4，4’位和5，5’位。取代基的實(shí)例為烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、?；?、酰胺基和鹵素基團(tuán)(例如溴、氯、碘等)。
聯(lián)吡啶釕絡(luò)合物的實(shí)例為[Ru(聯(lián)吡啶)3]、[Ru(4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(4，4’-二苯基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(4，4’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(4，4’-二羥基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(4，4’-二羧基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(4，4’-二溴-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(5，5’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(5，5’-二苯基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(5，5’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(5，5’-二羥基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(5，5’-二羧基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Ru(5，5’-二溴-2，2’-聯(lián)吡啶)3]等。
在咪唑的情況下，配位數(shù)是6。咪唑可以是未取代的，或引入取代基的。通過(guò)引入取代基，例如，可能調(diào)節(jié)溶解度和氧化還原電位等。取代位置為2位、4位和5位。取代基的實(shí)例為烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和鹵素基團(tuán)(例如溴、氯、碘等)。
咪唑釕絡(luò)合物的實(shí)例為[Ru(咪唑)6]、[Ru(4-甲基-咪唑)6]、[Ru(4-苯基-咪唑)6]、[Ru(4-氨基-咪唑)6]、[Ru(4-羥基-咪唑)6]、[Ru(4-羧基-咪唑)6]和[Ru(4-溴-咪唑)6]等。
氨基酸的實(shí)例為精氨酸(L-Arg)。精氨酸釕絡(luò)合物具有溶解性高的優(yōu)點(diǎn)?；旌吓潴w的實(shí)例為聯(lián)吡啶和咪唑的組合、聯(lián)吡啶和氨基酸的組合。例如，[Ru(咪唑)2(聯(lián)吡啶)2]、[Ru(L-Arg)2(聯(lián)吡啶)2]。使用混合配體可以賦予絡(luò)合物各種性質(zhì)，例如使用精氨酸提高絡(luò)合物的溶解性。
(鋨絡(luò)合物)鋨絡(luò)合物的配體的實(shí)例為氨、聯(lián)吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、聯(lián)喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物等?？梢允撬鼈冎械膬煞N或兩種以上組合的混合配體。
在聯(lián)吡啶的情況下，配位數(shù)是6。聯(lián)吡啶化合物可以是未取代的，或引入取代基的。通過(guò)引入取代基，例如，可能調(diào)節(jié)溶解度和氧化還原電位等。取代位置為4，4’位和5，5’位。取代基的實(shí)例為烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺?；?、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、?；Ⅴ０坊望u素基團(tuán)(例如溴、氯、碘等)。
聯(lián)吡啶鋨絡(luò)合物的實(shí)例為[Os(聯(lián)吡啶)3]、[Os(4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(4，4’-二苯基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(4，4’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(4，4’-二羥基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(4，4’-二羧基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(4，4’-二溴-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(5，5’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(5，5’-二苯基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(5，5’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(5，5’-二羥基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(5，5’-二羧基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Os(5，5’-二溴-2，2’-聯(lián)吡啶)3]。
在咪唑的情況下，配位數(shù)是6。咪唑可以是未取代的，或引入取代基的。通過(guò)引入取代基，例如，可能調(diào)節(jié)溶解度和氧化還原電位等。取代位置為2位、4位和5位。取代基的實(shí)例為烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺?；?、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和鹵素基團(tuán)(例如溴、氯、碘等)。
咪唑鋨絡(luò)合物的實(shí)例為[Os(咪唑)6]、[Os(4-甲基-咪唑)6]、[Os(4-苯基-咪唑)6]、[Os(4-氨基-咪唑)6]、[Os(4-羥基-咪唑)6]、[Os(4-羧基-咪唑)6]和[Os(4-溴-咪唑)6]等。
氨基酸的實(shí)例為精氨酸(L-Arg)。精氨酸鋨絡(luò)合物具有溶解性高的優(yōu)點(diǎn)?；旌吓潴w的實(shí)例為聯(lián)吡啶和咪唑的組合、聯(lián)吡啶和氨基酸的組合。例如，[Os(咪唑)2(聯(lián)吡啶)2]或[Os(L-Arg)2(聯(lián)吡啶)2]。使用混合配體可以賦予絡(luò)合物各種性質(zhì)，例如使用精氨酸提高絡(luò)合物的溶解性。
(銅絡(luò)合物)銅絡(luò)合物的配體的實(shí)例為氨、聯(lián)吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、聯(lián)喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物等?？梢允撬鼈冎械膬煞N或兩種以上組合的混合配體。
在聯(lián)吡啶的情況下，配位數(shù)是4或6，但從穩(wěn)定性的角度而言，聯(lián)吡啶優(yōu)選為2配位。聯(lián)吡啶可以是未取代的，或引入取代基的。通過(guò)引入取代基，例如，可能調(diào)節(jié)溶解度和氧化還原電位等。取代位置為4，4’位和5，5’位。取代基的實(shí)例為烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺?；⑾趸?、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、?；?、酰胺基和鹵素基團(tuán)(例如溴、氯、碘等)。
聯(lián)吡啶銅絡(luò)合物的實(shí)例為[Cu(聯(lián)吡啶)2]、[Cu(4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(4，4’-二苯基-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(4，4’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(4，4’-二羥基-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(4，4’-二羧基-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(4，4’-二溴-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(5，5’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(5，5’-二苯基-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(5，5’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(5，5’-二羥基-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(5，5’-二羧基-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(5，5’-二溴-2，2’-聯(lián)吡啶)2]、[Cu(聯(lián)吡啶)3]、[Cu(4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(4，4’-二苯基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(4，4’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(4，4’-二羥基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(4，4’-二羧基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(4，4’-二溴-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(5，5’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(5，5’-二苯基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(5，5’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(5，5’-二羥基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(5，5’-二羧基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]、[Cu(5，5’-二溴-2，2’-聯(lián)吡啶)3]等。
在咪唑的情況下，配位數(shù)是4。咪唑可以是未取代的，或引入取代基的。通過(guò)引入取代基，例如，可能調(diào)節(jié)溶解度和氧化還原電位等。取代位置為2位、4位和5位。取代基的實(shí)例為烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、砜基、磺?；?、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基和鹵素基團(tuán)(例如溴、氯、碘等)。
咪唑銅絡(luò)合物的實(shí)例為[Cu(咪唑)4]、[Cu(4-甲基-咪唑)4]、[Cu(4-苯基-咪唑)4]、[Cu(4-氨基-咪唑)4]、[Cu(4-羥基-咪唑)4]、[Cu(4-羧基-咪唑)4]和[Cu(4-溴-咪唑)4]等。
氨基酸的實(shí)例為精氨酸(L-Arg)。精氨酸銅絡(luò)合物具有溶解性高的優(yōu)點(diǎn)。混合配體的實(shí)例為聯(lián)吡啶和咪唑的組合、聯(lián)吡啶和氨基酸的組合。例如，[Cu(咪唑)2(聯(lián)吡啶)]或[Cu(L-Arg)2(聯(lián)吡啶)]。使用混合配體可以賦予銅絡(luò)合物各種性質(zhì)，例如使用精氨酸提高絡(luò)合物的溶解性。
以上的過(guò)渡金屬絡(luò)合物的說(shuō)明基于過(guò)渡金屬類(lèi)型而舉例，但本發(fā)明并不限于它們。以下，將基于配體說(shuō)明過(guò)渡金屬絡(luò)合物。
具有N、O、S的配位原子的配體在分子中具有，例如，＝N-OH、-COOH、-OH、-SH、＞C＝O等基團(tuán)。具有這種配體的金屬絡(luò)合物的實(shí)例是NN螯合物、NO螯合物、NS螯合物、OO螯合物、OS螯合物、SS螯合物(二齒配位)、N螯合物(一齒)、NNN螯合物(三齒)等，組合是多種多樣的。當(dāng)配體具有雙鍵時(shí)，Cu、Fe、Ru和Os等金屬趨向于具有電子轉(zhuǎn)移/接受功能。配體優(yōu)選具有芳香環(huán)。如前所述，在配體中可以引入各種取代基。舉例來(lái)說(shuō)，如果引入砜基，則金屬絡(luò)合物的溶解度上升。在形成金屬絡(luò)合物中，可以混合兩種或兩種以上配體并用作混合配體。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)配體之一是氨基酸時(shí)，則與酶的親合性良好。另外，中心金屬的一部分的部位可以連接有各種鹵素(例如Cl、F、Br、I)。以下是按配體的類(lèi)型分類(lèi)的轉(zhuǎn)移金屬絡(luò)合物的實(shí)例。
(NN-配位型)菲咯啉衍生物Cu+1，10-菲咯啉Fe+1，10-菲咯啉Cu+紅菲繞啉Fe+紅菲繞啉Cu+紅菲繞啉磺酸Fe+紅菲繞啉磺酸聯(lián)吡啶衍生物Cu+2，2’-聯(lián)吡啶Fe+2，2’-聯(lián)吡啶Fe+4，4’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶Cu+4，4’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶三嗪衍生物Cu+TPTZ(2，4，6-三吡啶基-S-三嗪)Fe+TPTZ(2，4，6-三吡啶基-S-三嗪)Fe+PDTS(3-(2-吡啶基)-5，6-二(4-磺苯基)-1，2，4-三嗪)聯(lián)喹啉衍生物Cu+亞銅試劑(2，2’-聯(lián)喹啉)吡啶基偶氮衍生物Fe+硝基-PAPS(2-(5-硝基-2-吡啶基偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)(NO配位型)Fe+亞硝基-PSAP(2-亞硝基-5-[N-正丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)Fe+亞硝基-ESAP(2-亞硝基-5-[N-乙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚)Fe+1-亞硝基-2-萘酚(NS配位型)Fe+2-氨基-4-噻唑乙酸(OO配位型)Fe+1，2-萘醌-4-磺酸(混合配體型)Os+Cl，咪唑，4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶Os+咪唑，4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶Cu+L-精氨酸，2，2’-聯(lián)吡啶Cu+乙二胺，2，2’-聯(lián)吡啶Cu+咪唑，2，2’-聯(lián)吡啶在本發(fā)明中，所述的發(fā)色劑沒(méi)有特別的限制，可以是2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)、3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物(MTT)、3，3’-(1，1’-二苯基-4，4’-二基)-二(2，5-二苯基-2H-四唑鎓氯化物)(Neo-TB)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4’-二基]-二[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(硝基-TB)、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-二苯基)-4，4’-二基]-二(2，5-二苯基-2H-四唑鎓氯化物)(TB)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓，一鈉鹽(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓，一鈉鹽(WST-3)、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲?；?苯基]-2H-四唑鎓(WST-4)、2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-二[4-二(2-磺乙基)氨基甲?；交鵠-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-二亞苯基)二四唑鎓，二鈉鹽(WST-5)、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓，一鈉鹽(WST-8)、2-(2-苯并噻唑基)-3，5-二苯基四唑鎓溴化物、2-(2-苯并噻唑基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓溴化物、2，3-二(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓氯化物、2，3-二(4-硝基苯基)四唑鎓高氯酸鹽、3-(3-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物、3-(4-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物、鐵絡(luò)合物、銅絡(luò)合物。鐵絡(luò)合物、銅絡(luò)合物具有介質(zhì)的功能，但在本發(fā)明中，也可以用作發(fā)色劑。例如，如上所述，銅絡(luò)合物的實(shí)例為聯(lián)吡啶銅絡(luò)合物、咪唑銅絡(luò)合物、氨基酸(例如精氨酸)銅絡(luò)合物、咪唑·聯(lián)吡啶銅絡(luò)合物和咪唑·氨基酸銅絡(luò)合物等。銅絡(luò)合物通過(guò)電子轉(zhuǎn)移從藍(lán)色(Cu2+)變化為紅棕色(Cu+)。在銅絡(luò)合物用作發(fā)色劑的情況下，可以將銅絡(luò)合物以外的過(guò)渡金屬絡(luò)合物用作介質(zhì)，并且鋨絡(luò)合物和釕絡(luò)合物是優(yōu)選的。
以下，以將鋨絡(luò)合物用作介質(zhì)，將MTT用作發(fā)色劑，葡萄糖為分析對(duì)象的情況為例，說(shuō)明本發(fā)明的比色分析方法適用于試驗(yàn)片的例子。膽固醇等其它的成分分析除了相應(yīng)地改變氧化還原酶以外，基本上相同。
首先，準(zhǔn)備鋨絡(luò)合物。鋨絡(luò)合物可以使用市售品，也可以通過(guò)下述實(shí)施例的方法生產(chǎn)。將鋨絡(luò)合物溶解在緩沖溶液中，然后在溶液中溶解MTT、粘合劑等添加劑、葡萄糖脫氫酶(GDH)，得到試劑溶液。緩沖溶液為磷酸緩沖液、Good緩沖液等。相對(duì)于全部緩沖溶液，鋨絡(luò)合物的濃度例如為1-10wt％。粘合劑的實(shí)例為羥丙基纖維素(HPC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙烯酰胺和牛血清白蛋白(BSA)等，在它們中，HPC是優(yōu)選的。粘合劑的濃度例如在0.5-5wt％的范圍內(nèi)。GDH的濃度例如為1000-50000U/ml。MTT的濃度沒(méi)有特別的限制。通過(guò)將濾紙等多孔片在所述試劑溶液中浸漬，然后干燥，制得葡萄糖分析用試驗(yàn)片。在所述試劑溶液浸漬前，優(yōu)選將所述多孔片在無(wú)機(jī)凝膠溶液中浸漬并干燥。無(wú)機(jī)凝膠的實(shí)例為蒙脫石等。所述無(wú)機(jī)凝膠溶液的無(wú)機(jī)凝膠濃度例如為1-5wt％，優(yōu)選為1-3wt％，更優(yōu)選為1.5-2wt％。所述無(wú)機(jī)凝膠溶液還可以含有CHAPS等兩性表面活性劑。相對(duì)于全部所述無(wú)機(jī)凝膠溶液，兩性表面活性劑的濃度例如為0.1-2wt％，優(yōu)選為0.1-1wt％，更優(yōu)選為0.2-0.4wt％。以多孔片的空隙體積為基準(zhǔn)，所述無(wú)機(jī)凝膠對(duì)所述多孔片的浸漬量例如為1-50mg/cm3，優(yōu)選為10-30mg/cm3，15-20mg/cm3。所述多孔片可以是孔徑在厚度方向或者在片表面方向上變化的不對(duì)稱(chēng)多孔膜。當(dāng)將血液等含有葡萄糖的樣品滴到該試驗(yàn)片上時(shí)，所述MTT對(duì)應(yīng)于其濃度而發(fā)色。通過(guò)測(cè)定這種發(fā)色的程度，可能進(jìn)行葡萄糖的定性或定量分析。分析所需要的時(shí)間為滴樣后約1～3秒。如果該試驗(yàn)片中浸漬有無(wú)機(jī)凝膠，能夠得到更均一且穩(wěn)定的發(fā)色。
所述無(wú)機(jī)凝膠，例如，優(yōu)選使用膨潤(rùn)性粘土礦物。在膨潤(rùn)性粘土礦物中，膨潤(rùn)土、蒙脫石、蛭石或合成的氟云母是更優(yōu)選的，特別優(yōu)選合合成鋰蒙脫石或合成滑石粉等蒙脫石，或者以合成氟云母為代表的膨潤(rùn)性合成云母(或Na型云母)等的合成云母(天然的云母通常是非膨潤(rùn)性的粘土礦物)。
接下來(lái)，以將鋨絡(luò)合物用作介質(zhì)，將MTT用作發(fā)色劑，葡萄糖為分析對(duì)象的情況為例，說(shuō)明本發(fā)明的比色分析方法適用于液體系統(tǒng)分析的例子。膽固醇等其它的成分分析除了相應(yīng)地改變氧化還原酶以外，基本上相同。
通過(guò)在緩沖液中溶解鋨絡(luò)合物、GDH和MTT來(lái)制備試劑溶液。盡管可以在水中溶解，但是在緩沖液中溶解是優(yōu)選的。緩沖液的pH例如在pH6-8的范圍內(nèi)，優(yōu)選在pH6.5-7的范圍內(nèi)。鋨絡(luò)合物的濃度例如為0.1-60mM，優(yōu)選為0.2-10mM，更優(yōu)選為0.3-0.6mM。GDH的濃度例如為10-1000U/ml，優(yōu)選為50-500U/ml，更優(yōu)選為100-200U/ml。MTT的濃度沒(méi)有特別的限制。當(dāng)將血液等含有葡萄糖的樣品添加到該試驗(yàn)溶液中時(shí)，例如，在5秒或5秒以?xún)?nèi)的短時(shí)間內(nèi)，所述試驗(yàn)溶液對(duì)應(yīng)于樣品的葡萄糖濃度而發(fā)色。這種變化可以通過(guò)目視確認(rèn)，或者用分光光度計(jì)等光學(xué)測(cè)定裝置來(lái)測(cè)定。相對(duì)于1毫升所述試劑溶液，所述樣品的添加量例如在1-100微升的范圍內(nèi)，優(yōu)選在3-10微升的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在5-10微升的范圍內(nèi)。
實(shí)施例以下將說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例。在下文中，PQQ代表任何含有一個(gè)吡咯環(huán)及一個(gè)喹啉環(huán)的醌，其它試劑在下表中詳細(xì)闡明。

實(shí)施例1首先，合成了鋨絡(luò)合物[OsCl(Him)(dmbpy)2]。首先，將2.00克(4.56毫摩爾)的(NH4)2[OsCl6]和1.68克(9.11毫摩爾)的二甲基聯(lián)吡啶(dmbpy)在氮?dú)饬飨掠谝叶?60毫升)中回流1小時(shí)。在冷卻至室溫后，在30分鐘內(nèi)加入1M亞硫酸氫鈉水溶液(120毫升)，接著在冰浴中冷卻30分鐘。減壓過(guò)濾得到的沉淀，用水充分洗滌(使用500-1000毫升)。接著用乙醚洗滌兩次后，減壓干燥。這樣得到1.5-1.7克[OsCl2(dmbpy)2]。將1.56克(2.60毫摩爾)的所得[OsCl2(dmbpy)2]和0.36克(5.2毫摩爾)的咪唑(Him)在氮?dú)饬飨掠谒?甲醇混合溶劑(50毫升)中回流2小時(shí)。在冷卻至室溫后，加入飽和NaCl水溶液(300毫升)。減壓過(guò)濾得到的沉淀，用飽和NaCl水溶液洗滌后，再減壓干燥，得到[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2。將所得[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2溶解在盡可能少量的乙腈/甲醇(1∶1 v/v)中，并且通過(guò)柱色譜(吸收劑活性鋁土，展開(kāi)溶劑乙腈/甲醇)。蒸發(fā)溶劑后，在少量丙酮中溶解，用乙醚再沉淀。減壓過(guò)濾所得的沉淀后，通過(guò)減壓干燥得到純化的[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2。
制備含有鋨絡(luò)合物的下述試劑溶液。將5微升各種濃度的葡萄糖(GLU)水溶液(濃度0、200、400、600mg/100ml)放入光路長(zhǎng)10毫米的微量吸收池(材質(zhì)·聚甲基丙烯酸酯)中，接著加入1000微升以下試劑溶液，同時(shí)在600納米的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。圖1示出了其結(jié)果。如圖所示，發(fā)色與葡萄糖濃度對(duì)應(yīng)。因?yàn)榉磻?yīng)快速進(jìn)行，所以至底物完全消耗基本上只花了2秒種。
試劑溶液組成MTT(同仁化學(xué)公司生產(chǎn)) 0.5mM[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl20.1mMPIPES(pH7.0) 40mMPQQGDH200U/ml實(shí)施例2制備含有鋨絡(luò)合物的以下試劑溶液。將5微升各種濃度的葡萄糖(GLU)水溶液(濃度0、200、400、600mg/100ml)放入光路長(zhǎng)10毫米的微量吸收池(材質(zhì)·聚甲基丙烯酸酯)中，接著加入1000微升以下試劑溶液，同時(shí)在600納米的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。圖2示出了其結(jié)果。如圖所示，發(fā)色與葡萄糖濃度對(duì)應(yīng)。因?yàn)榉磻?yīng)快速進(jìn)行，所以至底物完全消耗基本上只花了1秒種。
試劑溶液組成WST-5(同仁化學(xué)公司生產(chǎn))0.5mM[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl20.1mMPIPES(pH7.0) 40mMPQQGDH 200U/ml
實(shí)施例3制備含有釕絡(luò)合物的以下試劑溶液。將5微升各種濃度的葡萄糖(GLU)水溶液(濃度0、200、400、600mg/100ml)放入光路長(zhǎng)10毫米的微量吸收池(材質(zhì)·聚甲基丙烯酸酯)中，接著加入1000微升以下試劑溶液，同時(shí)在600納米的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。圖3示出了其結(jié)果。如圖所示，發(fā)色與葡萄糖濃度對(duì)應(yīng)。因?yàn)榉磻?yīng)快速進(jìn)行，所以至底物完全消耗基本上只花了2秒種。
試劑溶液組成WST-5(同仁化學(xué)公司生產(chǎn)) 0.5mM[Ru(NH3)6Cl3](Aldrich公司生產(chǎn))10mMPIPES(pH7.0) 40mMPQQGDH 200U/ml實(shí)施例4在約80℃的溫浴中，將CuCl2和2，2’-聯(lián)吡啶(bpy)以1∶2的摩爾比混合，合成[Cu(bpy)2]Cl2，接著制備含有該銅絡(luò)合物的以下試劑溶液。將5微升各種濃度的葡萄糖(GLU)水溶液(濃度0、200、400、600mg/100ml)放入光路長(zhǎng)10毫米的微量吸收池(材質(zhì)·聚甲基丙烯酸酯)中，接著加入1000微升以下試劑溶液，同時(shí)在600納米的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。圖4示出了其結(jié)果。如圖所示，發(fā)色與葡萄糖濃度對(duì)應(yīng)。因?yàn)榉磻?yīng)快速進(jìn)行，所以至底物完全消耗基本上只花了2秒種。
試劑溶液組成WST-5(同仁化學(xué)公司生產(chǎn)) 0.5mM[Cu(bpy)2]Cl21mMPIPES(pH7.0)40mMPQQGDH 200U/ml
實(shí)施例5制備具有各種配體的銅絡(luò)合物。將氯化銅(II)和以下配體以1∶2的摩爾比混合，溶解在純水中，在約80℃的溫浴中保溫10分鐘來(lái)配位，得到絡(luò)合物溶液。

實(shí)施例6使用以下所示的配體和聯(lián)吡啶作為配體，制備銅的混合配體絡(luò)合物。將銅∶以下配體∶聯(lián)吡啶以1∶2∶1的摩爾比混合，溶解在純水中，在約80℃的溫浴中保溫10分鐘來(lái)配位，得到以下配體。

實(shí)施例7使用各種配體制備鐵絡(luò)合物。將氯化鐵(III)和以下配體以1∶3的摩爾比混合，溶解在純水中，在約80℃的溫浴中保溫10分鐘來(lái)配位，得到絡(luò)合物溶液。

實(shí)施例8如以下制備兩種釕絡(luò)合物。
首先，在水中溶解市售的釕絡(luò)合物(Aldrich公司，六氨合氯化釕(III)，得到[Ru(NH3)6]的絡(luò)合物溶液。
<配體>在120毫升冰浴冷卻的濃硫酸中緩慢溶解11.8克(63.0毫摩爾)的2，2’-聯(lián)吡啶-N，N’-二氧化物(Aldrich公司生產(chǎn))，將反應(yīng)溶液加熱至100℃。然后，緩慢滴加64.0克(630毫摩爾)硝酸鉀的100毫升濃硫酸溶液，其后加熱攪拌1小時(shí)。反應(yīng)后，將溶液放冷至室溫，倒入碎冰中，過(guò)濾得到4，4’-二硝基-2，2’-聯(lián)吡啶-N，N’-氧化物的固體。在氬氣流下，將7.0克(25毫摩爾)的4，4’-二硝基-2，2’-聯(lián)吡啶-N，N’-氧化物和6.0克10％的鈀炭懸浮于23毫升乙醇中。向該溶液中滴加6.3克(126毫摩爾)一水合肼的47毫升乙醇溶液，回流8小時(shí)。將反應(yīng)溶液放冷后，過(guò)濾，濃縮濾液。通過(guò)硅膠柱進(jìn)行純化，得到4，4’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶。
<合成>在50毫升的兩頸瓶中放入乙二醇(10毫升)，并于攪拌下依次溶解DA-bpy(0.2克)、RuCl3(0.1克)，在N2氣流下，用覆套式電阻加熱器于劇烈攪拌下加熱，回流約4小時(shí)。
<純化>在N2氣流下攪拌并放冷后，轉(zhuǎn)入100毫升的茄形瓶中，用丙酮(5毫升)+乙醚(20毫升)洗滌反應(yīng)溶液。重復(fù)用丙酮(5毫升)+乙醚(20毫升)洗滌，直至溶劑的乙二醇完全除去。將充分洗滌的目的物溶解在乙醇中，通過(guò)加入乙醚來(lái)沉淀目的物。過(guò)濾并用乙醚洗滌，減壓干燥，得到[Ru(4，4’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)3]的固體。將其水溶得到絡(luò)合物溶液。
實(shí)施例9如以下制備兩種鋨絡(luò)合物。
<合成>將2.00克(4.56毫摩爾，Aldrich)的(NH4)2[OsCl6]和1.68克(9.11毫摩爾)的4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶(dmbpy，和光純藥)在氮?dú)饬飨掠谝叶?60毫升)中回流1小時(shí)。在冷卻至室溫后，在30分鐘內(nèi)加入120毫升1M亞硫酸氫鈉水溶液，在冰浴中冷卻30分鐘。減壓過(guò)濾得到的沉淀，用水充分洗滌(使用500-1000毫升)。接著用乙醚洗滌兩次，減壓干燥。這樣得到1.5-1.7克[OsCl2(dmbpy)2]。將1.56克(2.60毫摩爾)的所得[OsCl2(dmbpy)2]和0.36克(5.2毫摩爾)的咪唑(Him)在氮?dú)饬飨掠谒?甲醇混合溶劑(50毫升)中回流2小時(shí)。在冷卻至室溫后，加入300毫升飽和NaCl溶液。減壓過(guò)濾得到的沉淀，用飽和NaCl水溶液洗滌后，減壓干燥，得到[OsCl(Him)(dmbpy)2]Cl2。
<純化>將[OsCl(Him)(dmpyy)2]Cl2溶解在盡可能少量的乙腈/甲醇(1∶1 v/v)中，通過(guò)柱色譜(吸收劑活性鋁土，展開(kāi)溶劑乙腈/甲醇)純化。蒸發(fā)溶劑后，在少量丙酮中溶解，用乙醚再沉淀。減壓過(guò)濾所得的沉淀，減壓干燥。將其水溶，得到絡(luò)合物溶液。
<合成>將2.00克(4.56毫摩爾)的(NH4)2[OsCl6]和1.68克(9.11毫摩爾)dmbpy在氮?dú)饬飨掠?0毫升乙二醇中回流1小時(shí)。在冷卻至室溫后，在30分鐘內(nèi)加入120毫升1M亞硫酸氫鈉水溶液，在冰浴中冷卻30分鐘。減壓過(guò)濾得到的沉淀，用水充分洗滌(500-1000毫升)。接著用乙醚洗滌兩次，減壓干燥。這樣得到1.5-1.7克[OsCl2(dmbpy)2]。將1.56克(2.60毫摩爾)的所得[OsCl2(dmbpy)2]和0.36克(5.2毫摩爾)的Him在氮?dú)饬飨掠?0毫升1，2-乙二醇溶劑中回流2小時(shí)。在冷卻至室溫后，加入300毫升飽和NaCl水溶液。減壓過(guò)濾得到的沉淀，用飽和NaCl水溶液洗滌后，減壓干燥，得到[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2。
<純化>將[Os(Him)2(dmbpy)2]Cl2溶解在盡可能少量的乙腈/甲醇(1∶1 v/v)中，通過(guò)柱色譜(吸收劑活性鋁土，展開(kāi)溶劑乙腈/甲醇)純化。蒸發(fā)溶劑后，在少量丙酮中溶解，用乙醚再沉淀。減壓過(guò)濾所得的沉淀后，減壓干燥。將其水溶，得到絡(luò)合物溶液。
實(shí)施例10以以下所示組成混合絡(luò)合物、酶、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液。所述絡(luò)合物使用上述實(shí)施例中合成的。以下實(shí)施例也是同樣的。測(cè)定所述試劑溶液的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖5示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原WST-5，所以顯示還原型WST-5特有的光譜。
試劑溶液組成PQQ-GDH 50U/ml[Ru(NH3)6]0.8mMWST-5 0.2mM
PIPES pH750mMTriton X-100 0.5％實(shí)施例11以以下所示組成混合絡(luò)合物、酶、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液，測(cè)定它們的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖6A、6B示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原MTT，所以顯示還原型MTT特有的光譜。
試劑溶液組成1圖6APQQ-GDH 50U/ml[Cu(1，10-菲咯啉)2]1mMMTT 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％試劑溶液組成2圖6BPQQ-GDH 50U/ml[Fe(紅菲繞啉)3]1mMMTT 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(紅菲繞啉＝4，7-二苯基菲咯啉)實(shí)施例12以以下所示組成混合絡(luò)合物、酶、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液，測(cè)定它們的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖7A、7B示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原MTT，所以顯示還原型MTT特有的光譜。
試劑溶液組成1圖7APQQ-GDH 50U/ml[Fe(2，2’-聯(lián)吡啶)3] 1mMMTT 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％試劑溶液組成2圖7BPQQ-GDH 50U/ml[Fe(4，4’-二氨基-2，2’-聯(lián)吡啶)3] 0.1mMMTT 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％實(shí)施例13以以下所示組成混合絡(luò)合物、酶、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液，測(cè)定它們的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖8示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原MTT，所以顯示還原型MTT特有的光譜。
試劑溶液組成PQQ-GDH 50U/ml[Fe(TPTZ)3]0.1mMMTT 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-1000.5％(TPTZ＝2，4，6-三吡啶基-s-三嗪)實(shí)施例14以以下所示組成混合絡(luò)合物、酶、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液，測(cè)定它們的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖9示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原MTT，所以顯示還原型MTT特有的光譜。
試劑溶液組成PQQ-GDH 50U/ml[Cu(亞銅試劑)2] 1mMMTT 1mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％(亞銅試劑＝2，2’-聯(lián)喹啉)實(shí)施例15以以下所示組成混合絡(luò)合物、酶、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液，測(cè)定它們的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖10示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原MTT，所以顯示還原型MTT特有的光譜。
試劑溶液組成PQQ-GDH 50U/ml[Fe(硝基-PAPS)3]0.02mMMTT 1mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％實(shí)施例16以以下所示組成混合絡(luò)合物、酶、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液，測(cè)定它們的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖11示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原MTT，所以顯示還原型MTT特有的光譜。
試劑溶液組成PQQ-GDH 50U/ml[Fe(1-亞硝基-2-萘酚)3] 0.1mMMTT 1mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％實(shí)施例17以以下所示組成混合絡(luò)合物、酶、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液，測(cè)定它們的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖12示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原MTT，所以顯示還原型MTT特有的光譜。
試劑溶液組成PQQ-GDH 50U/ml[Fe(2-氨基-4-噻唑乙酸)3]1mMMTT 1mMPIPES pH750mMTriton X-100 0.5％實(shí)施例18以以下所示組成混合絡(luò)合物、酶、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液，測(cè)定它們的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖13示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原MTT，所以顯示還原型MTT特有的光譜。
試劑溶液組成PQQ-GDH50U/ml[Fe(1，2-萘醌-4-磺酸)3] 1mMMTT1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％實(shí)施例19以以下所示組成1、2混合絡(luò)合物、酶、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液，測(cè)定它們的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖14A、14B示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原MTT，所以顯示還原型MTT特有的光譜。
試劑溶液組成1圖14APQQ-GDH50U/ml[OsCl(Him)(dmbpy)2] 0.1mMMTT1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％(Him＝咪唑)(dmbpy＝4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)試劑溶液組成2圖14BPQQ-GDH50U/ml[Os(Him)2(dmbpy)2] 0.1mMMTT1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％(Him＝咪唑)
(dmbpy＝4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)實(shí)施例20以以下所示組成混合絡(luò)合物、酶(丙酮酸氧化酶)、發(fā)色劑、緩沖液而制備試劑溶液，測(cè)定它們的光譜作為空白，接著添加與所述絡(luò)合物等量的葡萄糖，在顏色改變后測(cè)定光譜。圖15示出了其結(jié)果。如圖所示，因?yàn)榻饘俳j(luò)合物作為電子轉(zhuǎn)移試劑來(lái)還原MTT，所以顯示還原型MTT特有的光譜。
試劑溶液組成丙酮酸氧化酶 100U/ml[OsCl(Him)(dmbpy)2] 0.1mMMTT 1mMPIPES pH7 50mMTriton X-100 0.5％(Him＝咪唑)(dmbpy＝4，4’-二甲基-2，2’-聯(lián)吡啶)實(shí)施例21該實(shí)施例證明試劑的反應(yīng)速度可以通過(guò)增加酶量來(lái)提高。首先，將兩塊網(wǎng)狀纖維(10厘米×10厘米)用1毫升以下組成1、2的試劑溶液浸泡，用熱風(fēng)干燥。將這些纖維附著到聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜上，裁成預(yù)定形狀，制得酶量不同的兩種試驗(yàn)片。將血清基的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、200、400、600mg/dl作為樣品滴到該試驗(yàn)片上，通過(guò)反射率測(cè)定裝置(LED/波長(zhǎng)660納米)來(lái)觀察30秒內(nèi)的K/S變化。所述血清基的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液如下制備冷凍并熔化經(jīng)糖酵解的人全血的血漿，向得到的血清中加入葡萄糖溶液。圖16A和16B示出了其結(jié)果。如圖所示，與1000U/ml的情況相比，在酶量為5000U/ml的情況下，反應(yīng)速度提高，反應(yīng)在約5秒時(shí)達(dá)到終點(diǎn)。在認(rèn)為反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)時(shí)的5秒鐘附近時(shí)取樣信號(hào)，可能進(jìn)行葡萄糖定量，從反應(yīng)開(kāi)始到終了時(shí)的時(shí)程斜率也可能進(jìn)行葡萄糖定量。
試劑溶液組成1圖16APQQ-GDH 1000U/ml[OsCl(Him)(dmbpy)2] 1mMMTT 30mMPIPES pH6.5 80mMMEGA-8(同仁化學(xué)公司生產(chǎn)) 1％聚丙烯酰胺0.1％BSA 1％試劑溶液組成2(圖16B)PQQ-GDH 5000U/ml[OsCl(Him)(dmbpy)2] 1mMMTT 30mMPIPES(pH 6.5) 80mMMEGA-8(同仁化學(xué)公司生產(chǎn)) 1％聚丙烯酰胺0.1％BSA 1％工業(yè)實(shí)用性如上所述，本發(fā)明的比色分析方法可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單且可信的分析。
權(quán)利要求
1.通過(guò)氧化還原酶，借助介質(zhì)，將電子從分析對(duì)象轉(zhuǎn)移到通過(guò)還原而發(fā)色的發(fā)色劑上，通過(guò)測(cè)定因此而產(chǎn)生的所述發(fā)色劑的發(fā)色來(lái)對(duì)所述分析對(duì)象進(jìn)行定性或定量的比色分析方法，其中所述介質(zhì)是選自銅絡(luò)合物、鐵絡(luò)合物、鋨絡(luò)合物和釕絡(luò)合物的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的比色分析方法，其中所述絡(luò)合物的配體的配位原子為選自氮、氧和硫的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的比色分析方法，其中所述絡(luò)合物的配體為選自氨、聯(lián)吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、聯(lián)喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的比色分析方法，其中配體的配位位置以外的氫原子的至少一個(gè)被取代基取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的比色分析方法，其中取代基為選自烷基、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、砜基、磺?；⑾趸?、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、?；?、酰胺基和鹵素基團(tuán)的至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的比色分析方法，其中絡(luò)合物具有兩種或兩種以上配體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的比色分析方法，其中氧化還原酶是脫氫酶或氧化酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之任一項(xiàng)的比色分析方法，其中發(fā)色劑是四唑鎓鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的比色分析方法，其中四唑鎓鹽具有選自硝基苯基、噻唑基和苯并噻唑基的至少一種基團(tuán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的比色分析方法，其中四唑鎓鹽是選自MTT、INT、Neo-TB、硝基-TB、TB、WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-8、2-(2-苯并噻唑基)-3，5-二苯基四唑鎓溴化物、2-(2-苯并噻唑基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓溴化物、2，3-二(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓氯化物、2，3-二(4-硝基苯基)四唑鎓高氯酸鹽、3-(3-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物，以及3-(4-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物的至少一種發(fā)色劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的比色分析方法，其中分析對(duì)象是葡萄糖、膽固醇、尿酸、丙酮酸或乳酸，而氧化還原酶是對(duì)應(yīng)于前述各物質(zhì)的脫氫酶或氧化酶。
12.用于權(quán)利要求1的比色分析方法的試劑，該試劑含有氧化還原酶、介質(zhì)和通過(guò)還原而發(fā)色的發(fā)色劑，其中所述介質(zhì)是選自銅絡(luò)合物、鐵絡(luò)合物、鋨絡(luò)合物和釕絡(luò)合物的至少一種試劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑，其中絡(luò)合物的配體的配位原子為選自氮、氧和硫的至少一種。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑，其中所述絡(luò)合物的配體為選自氨、聯(lián)吡啶化合物、咪唑化合物、菲咯啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、聯(lián)喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亞硝基化合物、8-羥基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫噸化合物、草酸，以及所述各化合物的衍生物的至少一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑，其中配體的配位位置以外的氫原子的至少一個(gè)被取代基取代。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的試劑，其中取代基為選自烷基、芳基、烯丙基、苯基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、砜基、磺酰基、硝基、亞硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、?；?、酰胺基和鹵素基團(tuán)的至少一種。
17.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑，其中絡(luò)合物具有兩種或兩種以上配體。
18.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑，其中氧化還原酶是脫氫酶或氧化酶。
19.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑，其中發(fā)色劑是四唑鎓鹽。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的試劑，其中四唑鎓鹽具有選自硝基苯基、噻唑基和苯并噻唑基的至少一種基團(tuán)。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的試劑，其中四唑鎓鹽是選自MTT、INT、Neo-TB、硝基-TB、TB、WST-1、WST-3、WST-4、WST-5、WST-8、2-(2-苯并噻唑基)-3，5-二苯基四唑鎓溴化物、2-(2-苯并噻唑基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓溴化物、2，3-二(4-硝基苯基)-5-苯基四唑鎓氯化物、2，3-二(4-硝基苯基)四唑鎓高氯酸鹽、3-(3-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物，以及3-(4-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基四唑鎓氯化物的至少一種發(fā)色劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求12的試劑，其中分析對(duì)象是葡萄糖、膽固醇、尿酸、丙酮酸或乳酸，而氧化還原酶是對(duì)應(yīng)于前述各物質(zhì)的脫氫酶或氧化酶。
23.含有權(quán)利要求12的試劑的比色分析用試驗(yàn)片。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的試驗(yàn)片，進(jìn)一步含有無(wú)機(jī)凝膠。
全文摘要
本發(fā)明提供能在短時(shí)間內(nèi)簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)可信的分析的比色分析方法。通過(guò)氧化還原酶，借助介質(zhì)，將電子從分析對(duì)象轉(zhuǎn)移到通過(guò)還原而發(fā)色的發(fā)色劑上，通過(guò)測(cè)定因此而產(chǎn)生的所述發(fā)色劑的發(fā)色來(lái)進(jìn)行所述分析對(duì)象的定性或定量。該比色分析方法的酶反應(yīng)是一步反應(yīng)，由于借助介質(zhì)發(fā)生發(fā)色反應(yīng)，因此可能在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。由于該反應(yīng)不需要過(guò)氧化氫和氧，所以測(cè)定值的可信度也高。
文檔編號(hào)G01N33/66GK1522302SQ0380060
公開(kāi)日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2003年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月28日
發(fā)明者永川健兒, 辻本朋吾, 西野進(jìn), 寺元正明, 川瀨喜幸, 吾, 幸, 明 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社