Ft3體外診斷試劑盒及其使用方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種FT3體外診斷試劑盒，本發(fā)明對(duì)于那些極性強(qiáng)，分子量小的半抗原無(wú)法包被于固相載體進(jìn)行檢測(cè)，提供了一種使用方便的試劑盒，解決了半抗原包被不佳的情況，便于快速、靈敏的進(jìn)行FT3的檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】FT3體外診斷試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種FT3檢測(cè)試劑盒，具體涉及一種FT3體外診斷試劑盒及其使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人下丘腦-垂體-甲狀腺軸通過(guò)分泌激素控制和調(diào)節(jié)機(jī)體代謝。其中由垂體分泌的促甲狀腺激素(TSH)促進(jìn)甲狀腺激素的合成與分泌，并受血液中的T3、T4含量的反饋調(diào)節(jié)，以保持血液中的游離Τ3、Τ4 (FT3、FT4)的濃度相對(duì)穩(wěn)定。
[0003]FT3、FT4是甲狀腺激素發(fā)揮活性作用的形式。血液循環(huán)中T4、T3的99.5%與血液中的TBG、白蛋白等結(jié)合，游離的Τ3只占0.2-0.4%。血清FT3正常值范圍因測(cè)定方法不同而異。FT3測(cè)定的臨床意義:甲亢、甲減的診斷，F(xiàn)T3升高是診斷甲亢和Τ3型甲亢最靈敏的指標(biāo)，不受血中TBG變化的影響。是評(píng)價(jià)甲狀腺功能和研究下丘腦一垂體一甲狀腺軸的主要指標(biāo)之一，可用于原發(fā)性及繼發(fā)性甲狀腺疾病的輔助診斷及療效評(píng)價(jià)。
[0004]FT3以前一直用放射免疫分析(RIA)，放射免疫分析它既具有免疫反應(yīng)的高特異性，又具有放射性測(cè)量的高靈敏度，因此能精確測(cè)定各種具有免疫活性的極微量的物質(zhì)，但是放射免疫分析存在放射線輻射和污染等問(wèn)題，用ELISA方法快速簡(jiǎn)便，既有放射免疫分析的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也減少了污染。
[0005]競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶標(biāo)抗體，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗體量與受檢抗原的量成反比。操作步驟如下:(1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原。洗滌。(2)待測(cè)管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗體的混合溶液，使之與固相抗原反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無(wú)抗原，則酶標(biāo)抗體能順利地與固相抗原結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗體以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗原結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗體與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗體與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗體，保溫后，酶標(biāo)抗體與固相抗原的結(jié)合可達(dá)最充分的量。洗滌。
(3)加發(fā)光液顯色:參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗體最多，信號(hào)值最高。參考管信號(hào)值與待測(cè)管信號(hào)值的大小，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測(cè)管信號(hào)值越低，表示標(biāo)本中抗原含量越多。
[0006]由于半抗原都是小分子，本身很難具有好的抗原性，只能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生很弱的免疫反應(yīng)，因而與載體蛋白耦聯(lián)是很重要的。
[0007]通常在市面上比較多的FT3試劑盒有放免試劑盒以及ELISA試劑盒，放免試劑盒存在諸多的地方，包括以下方面:
一，放射性
某些放射性同位素由于半衰期短不利于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，同時(shí)由于放射性物質(zhì)的污染對(duì)工作人員的健康以及環(huán)境也造成了一定的危害，需要特殊的防護(hù)以及廢物處理等設(shè)備，大大的增加了成本。
[0008]二，靈敏度。通常ELISA試劑盒的分析靈敏度可達(dá)到l(T13mol/L，固相放免試劑盒的分析靈敏度刻達(dá)到10_16mOl/L。[0009]三，有效期
一般來(lái)說(shuō)，放免只能保存3個(gè)月，ELISA試劑盒保存6個(gè)月。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的就是針對(duì)上述存在的缺陷而提供一種FT3體外診斷試劑盒及其使用方法。本發(fā)明對(duì)于那些極性強(qiáng)，分子量小的半抗原無(wú)法包被于固相載體進(jìn)行檢測(cè)，提供了一種使用方便的試劑盒，解決了半抗原包被不佳的情況，便于快速、靈敏的進(jìn)行FT3的檢測(cè)。
[0011]本發(fā)明的一種FT3體外診斷試劑盒及其使用方法技術(shù)方案為，該FT3體外診斷試劑盒，包括微孔板、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、酶結(jié)合物、發(fā)光底物液和濃縮洗滌液；其中微孔板中含有小分子半抗原FT3耦聯(lián)載體蛋白得到的小分子耦聯(lián)蛋白；校準(zhǔn)品與質(zhì)控品為已知濃度的FT3抗原；酶結(jié)合物中含有FT3酶標(biāo)抗體。
[0012]發(fā)光底物液包括發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B，發(fā)光底物液A含有魯米諾，發(fā)光底物液B含有辣根過(guò)氧化物酶穩(wěn)定劑、過(guò)氧化氫；濃縮洗滌液中含有氯化鈉和吐溫-20。
[0013]微孔板中含有的小分子耦聯(lián)蛋白，是將小分子半抗原FT3耦聯(lián)載體蛋白BSA得到的小分子耦聯(lián)蛋白。
[0014]所述的小分子耦聯(lián)蛋白，為使用EDC將小分子半抗原FT3和載體蛋白BSA進(jìn)行耦聯(lián)得到的小分子耦聯(lián)蛋白。
[0015]將小分子半抗原FT3和載體蛋白BSA進(jìn)行耦聯(lián)具體方法為:
①平衡EDC，NHS至室溫；
②將EDC、NHS、BSA分別用活化緩沖液溶解；
③將2-4體積份的EDC溶液與5-10體積份BSA溶液混合后，加入與EDC等量的NHS溶液，室溫反應(yīng)10-20分鐘，后再加入1-2體積份的EDC ;再室溫反應(yīng)10-20分鐘；
④加入巰基乙醇終止EDC反應(yīng)，得到活化蛋白EDC-BSA；
⑤加入與活化蛋白等摩爾的目的小分子半抗原FT3，室溫反應(yīng)1.5-3小時(shí)；
⑥加入Tris終止反應(yīng)，得到耦聯(lián)蛋白BSA-FT3；
⑦加入脫鹽柱，將里面的儲(chǔ)存液排出，然后加入PBS以同樣的轉(zhuǎn)速離心3-5次后，加入反應(yīng)的耦聯(lián)蛋白，離心后，即為耦聯(lián)產(chǎn)物。
[0016]步驟②中活化緩沖液包括:0.1M的MES，0.5M的NAC1，調(diào)節(jié)pH為6.0。
[0017]步驟②中EDC用活化緩沖液溶解，終濃度為45-55mg/mL，NHS同樣用活化緩沖液溶解，終濃度為45-55mg/mL，BSA用活化緩沖液溶解，終濃度為4.5-5.5mg/mL。
[0018]步驟⑥中Tris 為 20-50 mmol/L。
[0019]耦聯(lián)好的蛋白包被方式制備試劑盒，步驟為:
①將含有定量小分子耦聯(lián)蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小時(shí)；
②甩干板條，加入封閉液，37度放置2小時(shí)；
③洗漆一次后，放入真空干燥箱4-6小時(shí)；
④真空封袋后，放入4度冰箱。
[0020]其中，步驟①中的包被液為，氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉的混合水溶液，其中還可以含有防腐劑。[0021]上述的FT3體外診斷試劑盒的使用方法，其特征在于，
①分別往微孔板中加入校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測(cè)樣本，再往微孔板中加入酶結(jié)合物，充分混勻,37 0C反應(yīng)50-80分鐘；
②加入洗滌液洗滌3-6次，每次加洗滌液量為300-400uL；
③然后向微孔板中加入發(fā)光底物液，放入化學(xué)發(fā)光分析儀中讀數(shù)，計(jì)算數(shù)據(jù)，得出待測(cè)樣本中小分子半抗原FT3的量。
[0022]濃縮洗滌液加純水稀釋為洗滌液(例:20X濃縮洗滌液50ml+950ml的純水即為IX洗滌液)。
[0023]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的試劑盒使用方便，本發(fā)明運(yùn)用化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)，可以使其檢測(cè)范圍更加寬廣，增加其靈敏度，精密度實(shí)驗(yàn)也優(yōu)于一般的ELISA方法。而對(duì)比市面上的化學(xué)方法定量檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明試劑盒用的為間接法，通過(guò)包被小分子半抗原，采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)FT3。
[0024]小分子抗原，又稱(chēng)為半抗原，這些小分子本身沒(méi)有免疫原性，當(dāng)與載體結(jié)合后形成大分子，可以獲得免疫原性。半抗原與載體形成的免疫原，當(dāng)半抗原分子量極小，或則極性較大時(shí)，小分子抗原往往不容易直接固相吸附于板條上，使用BSA偶聯(lián)小分子，可以形成較大的分子量，通過(guò)疏水作用就容易吸附于固相載體上，這樣的方法靈敏度高，高度的特異性和靈敏性，能使分析過(guò)程簡(jiǎn)化。
[0025]EDC將FT3和載體進(jìn)行耦聯(lián)。EDC能與載體蛋白BSA形成一種活潑的酯結(jié)構(gòu)，半抗原FT3的基團(tuán)上有羧基基團(tuán)，能使之與BSA-EDC反應(yīng)，可以形成BSA-FT3偶聯(lián)物。
[0026]采用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)小分子半抗原FT3，該方法的好處在于操作簡(jiǎn)單，一步完成，包被一般不會(huì)出現(xiàn)過(guò)量包被造成IC50值(被抑制一半時(shí)抑制劑的濃度)較高，并且游離的抗原更容易和標(biāo)記的抗體進(jìn)行反應(yīng)，靈敏度和精確度較高。而采用包被抗體的方法很容易造成包被過(guò)量影響IC50值，并且小分子的標(biāo)記通常不能采用經(jīng)典的過(guò)碘酸鈉法，需要采用其他的化學(xué)方法，EDC, NHS/EDC等，對(duì)酶的活性有一定的影響。
[0027]本發(fā)明的試劑盒還有以下特點(diǎn):
1.非放射性化學(xué)發(fā)光試劑盒則完全拋棄了放射性同位素，因此不僅消除了對(duì)環(huán)境和操作者的危害，而且也使試劑的穩(wěn)定性和有效期大大的延長(zhǎng)。同時(shí)由于發(fā)光信號(hào)可以再短時(shí)間內(nèi)自行消失，因此容易實(shí)現(xiàn)連續(xù)，動(dòng)態(tài)，重復(fù)測(cè)定。
[0028]2.高靈敏度化學(xué)發(fā)光試劑盒的分析靈敏度可達(dá)到10_18mol/L。如果每次以加樣量為50ul，按摩爾常數(shù)為6.02X1023計(jì)算，此時(shí)樣本中僅有幾十個(gè)待測(cè)分子，這個(gè)靈敏度已經(jīng)達(dá)到了免疫檢測(cè)技術(shù)的極限了。
[0029]3.長(zhǎng)有效性化學(xué)發(fā)光完全拋棄了放射性同位素，因此徹底擺脫了半衰期的限制，使試劑的穩(wěn)定性以及有效期大大的延長(zhǎng)了?；瘜W(xué)發(fā)光的試劑盒可以達(dá)到I年多。
[0030]【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
圖1所示為競(jìng)爭(zhēng)法原理圖；
圖2所示為校準(zhǔn)品趨勢(shì)圖。
[0031]【具體實(shí)施方式】:
為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實(shí)例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。[0032]實(shí)施例1
材料:
活化緩沖液:0.1M MES, 0.5M NACl, ρΗ6.0 ；
載體蛋白=BSA ；
目的蛋白:小分子半抗原FT3;
NHS ;巰基乙醇；脫鹽柱 將小分子半抗原FT3和載體蛋白進(jìn)行耦聯(lián)，
①平衡EDC (1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，NHS (N-羥基丁二酰亞胺)至室溫。
[0033]②將EDC用活化緩沖液溶解，終濃度為50mg/mL，NHS同樣用活化緩沖液溶解，終濃度為50mg/mL，BSA (牛血清白蛋白)用活化緩沖液溶解，終濃度為5mg/mL。
[0034]③將200uL EDC溶液與500uL BSA溶液混合后，加入200uL NHS溶液，室溫反應(yīng)15分鐘，后加入IOOuL EDC0再反應(yīng)15分鐘。
[0035]④加入1.4uL巰基乙醇終止EDC反應(yīng)，得到活`化蛋白(EDC-BSA)。
[0036]⑤加入與活化蛋白等摩爾的目的蛋白(小分子半抗原FT3)，室溫反應(yīng)2小時(shí)。
[0037]⑥加入30 mmol/L Tris終止反應(yīng)，得到耦聯(lián)蛋白(BSA-FT3)。
[0038]⑦加入脫鹽柱，脫鹽柱先以1000g，2min將里面的儲(chǔ)存液排出，然后加入0.01MPBS以同樣的轉(zhuǎn)速離心4次后，加入反應(yīng)的耦聯(lián)蛋白，離心后，即為耦聯(lián)產(chǎn)物。
[0039]試劑盒微孔板制備:
①將含有定量小分子耦聯(lián)蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小時(shí)；
②甩干板條，加入封閉液200uL。37度放置2小時(shí)。
[0040]③洗滌一次后，放入真空干燥箱5小時(shí)。
[0041]④真空封袋后，放入4度冰箱。
[0042]其中，步驟①中的包被液為，IL純水中含有氯化鈉8.5g，磷酸二氫鈉0.58g，磷酸氫二鈉5.8g。
[0043]校準(zhǔn)品、質(zhì)控品制備:用FT3抗原、樣品稀釋液(1%BSA溶解于PH7.4的PBS溶液中)分別配制濃度為0.5、2、10、30、50、100 pmol /ml的6個(gè)校準(zhǔn)品、10、50pmol /ml的2個(gè)質(zhì)控
品O
[0044]酶結(jié)合物制備:
用FT3酶標(biāo)抗體、酶稀釋液(20%小牛血清混合于pH7.4的PBS溶液中)配制成一定濃度的酶結(jié)合物。
[0045]試劑盒的使用:
①分別向微孔板中加入50uL校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測(cè)樣本，再往微孔板中加入IOOuL酶標(biāo)抗體，分別與校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測(cè)樣本充分混勻，37°C反應(yīng)60分鐘。
[0046]②濃縮洗滌液加純水稀釋為I X洗滌液(例:20 X濃縮洗滌液50ml+950ml的純水即為IX洗滌液)，加入洗滌液洗滌四次，每次加洗滌液量為350UL。
[0047]③然后向微孔板中加入發(fā)光底物液，放入化學(xué)發(fā)光分析儀中讀數(shù)，計(jì)算數(shù)據(jù)得出待測(cè)樣本中FT3抗原的量。
[0048]發(fā)光底物液包括發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B，發(fā)光底物液A含有魯米諾，發(fā)光底物液B含有辣根過(guò)氧化物酶溫度劑、過(guò)氧化氫；濃縮洗滌液中含有氯化鈉和吐溫-20。
[0049]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
表1:校準(zhǔn)品結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種FT3體外診斷試劑盒，其特征在于，包括微孔板、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、酶結(jié)合物、發(fā)光底物液和濃縮洗滌液；其中微孔板中含有小分子半抗原FT3耦聯(lián)載體蛋白得到的小分子耦聯(lián)蛋白；校準(zhǔn)品與質(zhì)控品為已知濃度的FT3抗原；酶結(jié)合物中含有FT3酶標(biāo)抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FT3體外診斷試劑盒，其特征在于，發(fā)光底物液包括發(fā)光底物液A和發(fā)光底物液B，發(fā)光底物液A含有魯米諾，發(fā)光底物液B含有辣根過(guò)氧化物酶穩(wěn)定劑、過(guò)氧化氫；濃縮洗滌液中含有氯化鈉和吐溫-20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的FT3體外診斷試劑盒，其特征在于，微孔板中含有的小分子耦聯(lián)蛋白，是將小分子半抗原FT3耦聯(lián)載體蛋白BSA得到的小分子耦聯(lián)蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種FT3體外診斷試劑盒，其特征在于，所述的小分子耦聯(lián)蛋白，為使用EDC將小分子半抗原FT3和載體蛋白BSA進(jìn)行耦聯(lián)得到的小分子耦聯(lián)蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的FT3體外診斷試劑盒，其特征在于，將小分子半抗原FT3和載體蛋白BSA進(jìn)行耦聯(lián)具體方法為: ①平衡EDC，NHS至室溫； ②將EDC、NHS、BSA分別用活化緩沖液溶解； ③將2-4體積份的EDC溶液與5-10體積份BSA溶液混合后，加入與EDC等量的NHS溶液，室溫反應(yīng)10-20分鐘，后再加入1-2體積份的EDC ;再室溫反應(yīng)10-20分鐘； ④加入巰基乙醇終止EDC反應(yīng)，得到活化蛋白EDC-BSA； ⑤加入與活化蛋白等摩爾的目的小分子半抗原FT3，室溫反應(yīng)1.5-3小時(shí)； ⑥加入Tris終止反應(yīng)，得到耦`聯(lián)蛋白BSA-FT3； ⑦加入脫鹽柱，將里面的儲(chǔ)存液排出，然后加入PBS以同樣的轉(zhuǎn)速離心3-5次后，加入反應(yīng)的耦聯(lián)蛋白，離心后，即為耦聯(lián)產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的FT3體外診斷試劑盒，其特征在于，步驟②中活化緩沖液包括:0.1M 的 MES，0.5M 的 NACl，調(diào)節(jié) pH 為 6.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的FT3體外診斷試劑盒，其特征在于，步驟②中EDC用活化緩沖液溶解，終濃度為45-55mg/mL，NHS同樣用活化緩沖液溶解，終濃度為45_55mg/mL，BSA用活化緩沖液溶解，終濃度為4.5-5.5mg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的FT3體外診斷試劑盒，其特征在于，步驟⑥中Tris為20-50mmol /I,η
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的FT3體外診斷試劑盒，其特征在于，耦聯(lián)好的蛋白包被方式制備試劑盒，步驟為: ①將含有定量小分子耦聯(lián)蛋白的包被液加入到微孔板中，37度放置2小時(shí)； ②甩干板條，加入封閉液，37度放置2小時(shí)； ③洗漆一次后，放入真空干燥箱4-6小時(shí)； ④真空封袋后，放入4度冰箱。
10.如權(quán)利要求1所述的FT3體外診斷試劑盒的使用方法，其特征在于， ①分別往微孔板中加入校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和待測(cè)樣本，再往微孔板中加入酶結(jié)合物，充分混勻,37 0C反應(yīng)50-80分鐘； ②加入洗滌液洗滌3-6次，每次加洗滌液量為300-400uL； ③然后向微孔板中加入發(fā)光底物液，放入化學(xué)發(fā)光分析儀中讀數(shù)，計(jì)算數(shù)據(jù)，得出待測(cè)樣本中小分子半抗原FT3的量 。
【文檔編號(hào)】G01N33/78GK103499697SQ201310403123
【公開(kāi)日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】穆海東, 汪寧梅, 陳福美, 沈玨璟 申請(qǐng)人:上海裕隆醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所股份有限公司