亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

血液處理方法及其裝置、血紅蛋白類測(cè)定方法及其裝置的制作方法

文檔序號(hào):6014100閱讀:484來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:血液處理方法及其裝置、血紅蛋白類測(cè)定方法及其裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及用于破壞紅細(xì)胞膜的血液處理方法以及血紅蛋白類測(cè)定。
背景技術(shù)
目前,在臨床檢查領(lǐng)域,即時(shí)檢驗(yàn)(以下略稱為POCT)倍受矚目。所謂POCT是指在醫(yī)療現(xiàn)場(chǎng)顯示臨床檢查,表示最重視從檢體采樣到出結(jié)果的時(shí)間的檢查的總稱。因此,一般在臨床檢查領(lǐng)域,要求操作的簡(jiǎn)便性、迅速判定、以及低價(jià)格。這當(dāng)然在血液中成分的測(cè)定中也不例外。
血液可以大致分為細(xì)胞成分和液體成分。在細(xì)胞成分中包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞以及血小板。液體成分包括血漿。
在血液檢體樣品中,紅細(xì)胞與全血的容積比(以后稱之為紅細(xì)胞壓積值或Ht值)是一個(gè)重要的因子。由于Ht值根據(jù)貧血的程度而變化,因此可以作為用于測(cè)定貧血的程度的尺度。另外,由于血液檢體樣品的物性(粘度)在測(cè)定中受到影響而因此有必要進(jìn)行其它測(cè)定值的補(bǔ)正,Ht值也可以作為關(guān)于這種必要性的尺度。
紅細(xì)胞大致為1.1×1010個(gè),占有1ml的體積,每一個(gè)的容積大致為90μm3。作為紅細(xì)胞的最大成分的水,在100ml的紅細(xì)胞中大致占63g。在紅細(xì)胞中剩余大致34g的大部分可以認(rèn)為是血紅蛋白類。在Ht值為45%時(shí),1L血液中的血紅蛋白類的量大致為150g。即,血紅蛋白類在血液中的濃度為150g/l,是生物體內(nèi)含量最大的蛋白質(zhì)。
人血紅蛋白(以后稱為Hb)是與α鏈以及非α鏈(β、γ、δ鏈)的球蛋白結(jié)合并締合的四聚物。在健康人的Hb中存在大致90%的HbA(α2β2)、大致3%的HbA2(α2δ2)、大致1%的HbF(α2γ2)以及大致百分之幾的HbA1(糖結(jié)合的HbA)。另外,在上述HbA1中含有HbA1a、HbA1b以及HbA1c。
以往,檢查上述Hb的組成比被認(rèn)為是臨床化學(xué)中重要的指標(biāo)。例如,上述HbF的值在顯示基準(zhǔn)范圍0.3~1.3%以外的異常值時(shí),被認(rèn)為懷疑有遺傳性高HbF癥、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病等。另外,當(dāng)上述HbA2的測(cè)定值顯示基準(zhǔn)范圍2~3.5%以外的異常值時(shí),被認(rèn)為懷疑有不穩(wěn)定性Hb癥或惡性貧血。
另外,近年來(lái),作為三大成人疾病之一的糖尿病成為了問(wèn)題。因此,作為用于控制糖尿病患者的1~3個(gè)月間的比較長(zhǎng)時(shí)間的血糖的標(biāo)準(zhǔn),HbA1或HbA1c作為被檢查項(xiàng)目倍受矚目。并且正在開(kāi)發(fā)HbA1c的測(cè)定裝置。
血紅蛋白類,例如可以利用等電點(diǎn)電泳法、離子交換層析法、膠乳免疫凝集法等測(cè)定。
與血液檢體樣品中的其它測(cè)定對(duì)象不同,血紅蛋白類由于存在于紅細(xì)胞中,因此要進(jìn)行測(cè)定就有必要使產(chǎn)生溶血。作為“溶血”是指紅細(xì)胞膜被破壞、血紅蛋白類排出紅細(xì)胞外的現(xiàn)象。更具體地說(shuō),紅細(xì)胞的大小受到相對(duì)于紅細(xì)胞的滲透壓的影響。紅細(xì)胞在鹽濃度高于生理鹽水(0.9%NaCl)鹽溶液中收縮。另一方面,在鹽濃度低于生理鹽水(0.9%NaCl)鹽溶液中,紅細(xì)胞膨脹。在這種紅細(xì)胞的收縮以及膨脹的過(guò)程中,紅細(xì)胞一旦被破壞,則血紅蛋白類排出紅細(xì)胞外。在當(dāng)血液完全被溶血的情況下,在Ht值45%時(shí),血紅蛋白濃度大致為150g/L。
血紅蛋白類測(cè)定結(jié)果是以相對(duì)于全部血紅蛋白量的比例來(lái)表示。因此,不僅僅要測(cè)定測(cè)定對(duì)象的血紅蛋白類的量,還要測(cè)定全部血紅蛋白量。如上述,全部血紅蛋白量因人而異,但是通常在血液中大致為150g/L。對(duì)于血紅蛋白類的測(cè)定,該濃度是不利于測(cè)定的非常高的濃度。血紅蛋白類,由于具有在長(zhǎng)波長(zhǎng)側(cè)含有吸收波長(zhǎng)的紅色色素,因此,只要高濃度,就很容易妨礙血紅蛋白類的測(cè)定。
例如,在通過(guò)免疫層析法測(cè)定血紅蛋白類時(shí),作為免疫反應(yīng)的其中一個(gè)特性而產(chǎn)生的抗原過(guò)剩量區(qū)域的測(cè)定值低下,成為操作失誤的原因。另外,由于大量血紅蛋白類造成的血液檢體樣品的粘度的增加,則產(chǎn)生免疫層析裝置的固相基質(zhì)中的血液檢體樣品的展開(kāi)速度或者變慢、或變得完全不展開(kāi)的不良現(xiàn)象。因此,例如特開(kāi)平3-46566號(hào)公報(bào)中公開(kāi)的那樣,為了準(zhǔn)確測(cè)定血紅蛋白類,在溶血操作后有必要用于稀釋血液檢體樣品的很多操作。即,為了測(cè)定血紅蛋白類,需要很多用于處理血液檢體樣品的操作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于上述事情而完成的,涉及血液處理方法、血液處理裝置、血紅蛋白類測(cè)定方法以及血紅蛋白類測(cè)定裝置,尤其是目的在于提供能夠更簡(jiǎn)便地對(duì)以血紅蛋白類為代表的紅細(xì)胞中成分進(jìn)行測(cè)定的方法以及裝置。
本發(fā)明的血液處理方法,包括準(zhǔn)備含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品及溶血?jiǎng)┑墓ば?a)、通過(guò)混合上述血液檢體樣品與上述溶血?jiǎng)┒{(diào)制混合樣品的工序(b),上述溶血?jiǎng)┦瞧茐募t細(xì)胞膜的固體藥劑。
在以往的方法中,為了測(cè)定以血紅蛋白類為代表的紅細(xì)胞中的成分,需要用于處理血液檢體樣品的很多操作。但是,若使用本發(fā)明的血液處理方法,在測(cè)定紅細(xì)胞中的成分時(shí),在溶血操作后不需要用于稀釋血液檢體樣品的很多操作。因此,根據(jù)本發(fā)明的血液處理方法,可以更簡(jiǎn)便地對(duì)紅細(xì)胞中的成分進(jìn)行測(cè)定。
在上述工序(b)中,優(yōu)選在上述混合樣品中殘存血細(xì)胞成分。
上述溶血?jiǎng)┛梢允歉淖兿鄬?duì)于紅細(xì)胞膜的滲透壓的藥劑。
上述溶血?jiǎng)┛梢允菬o(wú)機(jī)鹽。
上述混合樣品中的上述無(wú)機(jī)鹽的濃度優(yōu)選在0.05~10%(w/v)的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的血紅蛋白類的測(cè)定方法,包括準(zhǔn)備含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品及溶血?jiǎng)┑墓ば?a)、通過(guò)混合血液檢體樣品與溶血?jiǎng)┒{(diào)制混合樣品的工序(b)、測(cè)定上述混合樣品的血漿中的血紅蛋白類的工序(c),上述溶血?jiǎng)槠茐募t細(xì)胞膜的固體藥劑。
在以往的方法中,為了測(cè)定血紅蛋白類,需要用于處理血液檢體樣品的很多操作。但是,若使用本發(fā)明的血紅蛋白類測(cè)定方法,在測(cè)定血紅蛋白類時(shí),在溶血操作后不需要用于稀釋血液檢體樣品的很多操作。因此,根據(jù)本發(fā)明的血紅蛋白類測(cè)定方法,可以更簡(jiǎn)便地進(jìn)行測(cè)定。
在上述工序(c)中,作為測(cè)定上述混和樣品中含有的血紅蛋白類的方法,可以使用免疫層析法、免疫集中法、固相酶免疫測(cè)定法、比色玻片法、以及電極法玻片法中的任意一種。
在上述工序(c)中,可以至少測(cè)定2種血紅蛋白。
上述的至少兩種血紅蛋白可以是血紅蛋白與HbAlc的組合。
上述血紅蛋白類可以是糖化血紅蛋白。
本發(fā)明的血液處理裝置,具備基材與用于破壞紅細(xì)胞膜的固體溶血?jiǎng)?,在形成含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品與上述溶血?jiǎng)┑幕旌蜆悠窌r(shí),在上述基材上負(fù)載的所述固體溶血?jiǎng)┑牧?,是使血?xì)胞成分在上述混和樣品中有殘存的量。
根據(jù)本發(fā)明的血紅蛋白類測(cè)定裝置,可以更簡(jiǎn)便地進(jìn)行紅細(xì)胞中成分的測(cè)定。
本發(fā)明的血紅蛋白類的測(cè)定裝置,是用于測(cè)定含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品中的血紅蛋白類的血紅蛋白類測(cè)定裝置,具備具有上述血液檢體樣品的添加部的基材、用于破壞紅細(xì)胞膜的溶血?jiǎng)?、與上述血紅蛋白類特異結(jié)合的檢測(cè)物質(zhì)、與上述血紅蛋白類特異結(jié)合的固定化物質(zhì),在上述基材上負(fù)載的所述固體溶血?jiǎng)┑牧?,是使血?xì)胞成分在上述混和樣品中有殘存的量,上述溶血?jiǎng)?、上述檢測(cè)物質(zhì)、以及上述固定化物質(zhì)分別負(fù)載在上述基材上,從靠近上述基材的上述血液檢體樣品的添加部依次配置上述溶血?jiǎng)?、上述檢測(cè)物質(zhì)、上述固定化物質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的血紅蛋白類測(cè)定裝置,可以更簡(jiǎn)便地進(jìn)行血紅蛋白類的測(cè)定。
本發(fā)明的另一血紅蛋白類的測(cè)定裝置,是用于測(cè)定含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品中的血紅蛋白類的血紅蛋白類測(cè)定裝置,具備基板;設(shè)置于上述基板上的上述血液檢體樣品的添加部;溶血層,設(shè)置于上述基板上,含有用于破壞紅細(xì)胞膜的固體的溶血?jiǎng)糜诳刂粕鲜鲅簷z體樣品的溶血;標(biāo)記層,設(shè)置于上述基板上,含有與血紅蛋白類特異結(jié)合的檢測(cè)物質(zhì),用于標(biāo)記上述血紅蛋白類;檢測(cè)層,設(shè)置于上述基板上,含有與上述血紅蛋白類特異結(jié)合的固定化試劑,用于檢測(cè)上述血紅蛋白類,上述血液檢體樣品可以在上述溶血層、上述標(biāo)記層以及上述檢測(cè)層之間移動(dòng)。
根據(jù)本發(fā)明的血紅蛋白類測(cè)定裝置,可以更簡(jiǎn)便地進(jìn)行血紅蛋白類測(cè)定。
也可以進(jìn)一步設(shè)置在上述血液檢體樣品溶血后用于除去紅細(xì)胞殘留物的層。
上述溶血層、上述標(biāo)記層以及上述檢測(cè)層可以配置成單一的層。


圖1是本發(fā)明的血液處理方法的流程圖。
圖2是表示溶血率表示式的圖。
圖3(a)以及圖3(b)是表示本實(shí)施方式的血液處理裝置的圖。
圖4是表示本發(fā)明的一例單層式血紅蛋白類測(cè)定裝置的圖。
圖5是表示本發(fā)明的一例多層式血紅蛋白類測(cè)定裝置的剖面圖。
圖6是表示本發(fā)明的一實(shí)施例的KCl濃度(溶血?jiǎng)┑奶砑恿?與光透過(guò)率的圖。
圖7是表示本發(fā)明的一實(shí)施例的KCl濃度(溶血?jiǎng)┑奶砑恿?與Hb濃度以及HbAlc之間關(guān)系圖。
圖8是表示本發(fā)明的一實(shí)施例的KCl量的濃度(溶血?jiǎng)┑奶砑恿?與610nm的反射吸光度之間的關(guān)系圖。
圖9是表示本發(fā)明一實(shí)施例的Hb測(cè)定用裝置的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖。
圖10是表示本發(fā)明一實(shí)施例的HbA1c測(cè)定用裝置的標(biāo)準(zhǔn)曲線的圖。
圖11是表示用本發(fā)明的一實(shí)施例的測(cè)定裝置測(cè)定4.0%HbA1c、5.4%HbA1c、10.4%HbA1c時(shí)的結(jié)果的圖。
圖12是表示從基于本發(fā)明一實(shí)施例裝置的4.0%HbA1c、5.4%HbA1c、10.4%HbA1c的測(cè)定值,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行濃度換算后的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
以下邊參照?qǐng)D邊說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施方式。
(實(shí)施方式1)
在本實(shí)施方式中,邊參照?qǐng)D邊說(shuō)明本發(fā)明的血液處理方法。圖1是本發(fā)明血液處理方法的流程圖。
如圖1所示,本實(shí)施方式的血液處理方法,包括準(zhǔn)備血液檢體樣品與溶血?jiǎng)┑墓ば騍t1以及通過(guò)混和血液檢體樣品與溶血?jiǎng)┒{(diào)制混和樣品的工序St2。這里的溶血?jiǎng)┦瞧茐募t細(xì)胞膜的固體藥劑。
“血液檢體樣品”是指從含人在內(nèi)的被檢體通過(guò)普通的采血法(例如靜脈注射或刺血針)而采取的血液或在測(cè)定以前保存的血液。
溶血?jiǎng)┦褂闷茐募t細(xì)胞膜的固體藥劑。例如優(yōu)選通過(guò)冷凍干燥調(diào)制成粉末狀,使大致不含水分。
另外,本實(shí)施方式的血液處理方法,優(yōu)選在血紅蛋白類的測(cè)定中使用。即,本發(fā)明的血紅蛋白類測(cè)定方法,不僅包括如圖1所示的準(zhǔn)備血液檢體樣品與溶血?jiǎng)┑墓ば騍t1以及通過(guò)混和血液檢體樣品與溶血?jiǎng)┒{(diào)制混和樣品的工序St2,還含有對(duì)混和樣品的血漿中含有的血紅蛋白類進(jìn)行測(cè)定的工序。這里的溶血?jiǎng)┦瞧茐募t細(xì)胞膜的固體藥劑。
根據(jù)上述實(shí)施方式的血液處理方法,本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以通過(guò)周知的方法定量測(cè)定混和樣品的血漿中含有的血紅蛋白類。
如圖1所示,在工序St2中,若通過(guò)混和血液檢體樣品與溶血?jiǎng)┒{(diào)制混和樣品時(shí),則血液檢體樣品中紅細(xì)胞的紅細(xì)胞膜被破壞,紅細(xì)胞中的成分(以血紅蛋白類為代表)排出紅細(xì)胞外(即產(chǎn)生溶血)。因此,能夠測(cè)定紅細(xì)胞中成分(以血紅蛋白類為代表)。
如上述,為了測(cè)定以血紅蛋白類為代表的紅細(xì)胞中的成分,需要很多用于處理血液檢體樣品的很多操作。但是,若利用本實(shí)施方式的血液處理方法,在測(cè)定紅細(xì)胞中的成分時(shí),就不需要在溶血操作后用于稀釋血液檢體樣品的很多操作。因此,根據(jù)本實(shí)施方式的血液處理方法,可以更簡(jiǎn)便地進(jìn)行紅細(xì)胞中的成分測(cè)定。
在以免疫學(xué)方法測(cè)定血紅蛋白類時(shí),若要進(jìn)行完全溶血,則由于濃度非常高,因此進(jìn)入抗原過(guò)剩區(qū)域,也可能使測(cè)定靈敏度下降。因此,在工序St2中,優(yōu)選在混和樣品中殘存血細(xì)胞成分,即對(duì)血液檢體樣品進(jìn)行部分溶血。
所謂“對(duì)血液檢體樣品進(jìn)行部分溶血”,是指對(duì)低于完全溶血體積的紅細(xì)胞進(jìn)行溶血。例如,在Ht值45%的血液1L時(shí),對(duì)體積低于450ml的紅細(xì)胞進(jìn)行溶血。與此相對(duì),所謂“完全溶血”是指實(shí)質(zhì)上對(duì)全部紅細(xì)胞體積的紅細(xì)胞進(jìn)行溶血。例如,在Ht值45%的血液1L時(shí),對(duì)體積大致450ml的紅細(xì)胞進(jìn)行溶血。通過(guò)“進(jìn)行控制使對(duì)血液檢體樣品進(jìn)行部分溶血”,可以使樣品中部分紅細(xì)胞膜被破壞,使其中的血紅蛋白類溶出。此時(shí),血漿中的血紅蛋白類的濃度也比完全溶血時(shí)低。例如,在Ht值45%的血液1L中使相當(dāng)于1ml體積的紅細(xì)胞溶血時(shí),在血漿550ml中血紅蛋白類0.34g以及水0.63g被溶出。因此,由于在血漿水550.63ml中血紅蛋白類被溶解0.34g,因此血紅蛋白類濃度變?yōu)?.62g/L。完全溶血時(shí)的全部血紅蛋白濃度為150g/L。在本實(shí)施方式的血液處理方法中,無(wú)需緩沖液等而通過(guò)溶血,就可以獲得大致相當(dāng)于完全溶血時(shí)的250倍的稀釋效果。
如在背景技術(shù)欄所述那樣,Ht值是相對(duì)于全血的紅細(xì)胞的容積比。因此通過(guò)Ht值就可以獲得紅細(xì)胞的量以及全部血紅蛋白的量。需要說(shuō)明的是,Ht值可以通過(guò)包括毛細(xì)管法以及Wintrobe法在內(nèi)的周知的方法測(cè)定。在用毛細(xì)管法測(cè)定時(shí),成人男性的Ht值為36~48%、女性為34~43%。在幼兒中,新生兒(臍帶血)44~64%、三個(gè)月為32~44%,一歲兒為36~44%、10~12歲為37~44%(參照Dacie等,臨床檢查法提要,改訂31版,金原出版株式會(huì)社)。因此,關(guān)于血紅蛋白測(cè)定,可以考慮被檢體的性別以及年齡對(duì)Ht值進(jìn)行設(shè)定。
全血紅蛋白濃度在Ht值等中存在個(gè)人差異,但是幾乎所有的人都具有多于100mg/ml的Hb(男性大致為130~170mg/ml、女性大致為120~150mg/ml)。根據(jù)以往的測(cè)定機(jī)器,不進(jìn)行稀釋,不能測(cè)定超過(guò)100mg/ml濃度的Hb。因此,基于部分溶血的Hb濃度優(yōu)選在100mg/ml以下。
溶血的控制,例如可以通過(guò)改變?nèi)苎獎(jiǎng)┑牧縼?lái)進(jìn)行。例如,在1.5mg或7.5mg的氯化鉀血液中添加1.5ml血液時(shí),全血紅蛋白濃度,前者變?yōu)?.0g/L,后者變?yōu)?5g/L。這樣,若溶血?jiǎng)┑牧孔兇?,則溶血的比例也變大。因此,對(duì)達(dá)成血漿中最適血紅蛋白濃度(最適溶血率)的溶血?jiǎng)┑牧康拇_定進(jìn)行簡(jiǎn)單闡述。
首先,以任意量的溶血?jiǎng)┦寡簷z體樣品溶血,通過(guò)分離作業(yè)取出上清液。然后,測(cè)定上清液中的血紅蛋白濃度。接著,確定溶血?jiǎng)┑奶砑恿颗c血紅蛋白濃度之間的關(guān)系。最后,根據(jù)上述關(guān)系來(lái)確定達(dá)到血漿中的最適血紅蛋白濃度的溶血?jiǎng)┑奶砑恿俊?br> 更具體地說(shuō),通過(guò)進(jìn)行與后述實(shí)施例2中記載的操作大致相同的操作,根據(jù)獲得的溶血?jiǎng)┑牧颗c血紅蛋白濃度之間的關(guān)系圖來(lái)確定。
血漿中最適血紅蛋白濃度(最適溶血率),由于依賴于其測(cè)定方法,因此添加的溶血?jiǎng)┑牧恳惨蕾囉跍y(cè)定方法。另外,在本說(shuō)明書中,溶血率用圖2所示式來(lái)表示。
在Ht值為40~50%的情況、血紅蛋白類的測(cè)定方法是吸光法的情況下,優(yōu)選添加的溶血?jiǎng)┑牧渴鞘谷苎首優(yōu)?.01~1%(血紅蛋白濃度0.01~1mg/ml)的量,在測(cè)定方法是免疫層析法時(shí),優(yōu)選添加的溶血?jiǎng)┑牧渴鞘谷苎首優(yōu)?.0001~0.1%(血紅蛋白濃度0.1~10mg/dl)的量。
在以吸光法進(jìn)行測(cè)定時(shí),由于Hb的最大摩爾吸光系數(shù)大致為105M-1,因此溶血?jiǎng)┑奶砑恿績(jī)?yōu)選是使血紅蛋白濃度變?yōu)?.1~1mg/ml(吸光度變?yōu)榇笾?.1~2的濃度)的量。
在以免疫層析法進(jìn)行測(cè)定時(shí),溶血?jiǎng)┑奶砑恿咳Q于依賴該免疫層析法中使用的抗體的性能(結(jié)合親和力等)的血紅蛋白濃度。
例如,在作為溶血?jiǎng)┦褂寐然洉r(shí),一般相對(duì)于血液檢體樣品的全血量的溶血?jiǎng)┑奶砑颖壤?濃度),優(yōu)選在0.05~10%(w/v)(在本說(shuō)明書中(w/v)的單位取g/ml)的范圍內(nèi)。尤其是相對(duì)于血液檢體樣品的全容量的溶血?jiǎng)┑奶砑颖壤?濃度),在吸光法的情況下優(yōu)選在0.05~1%(w/v)的范圍內(nèi),在免疫層析法的情況下,雖然在一定程度上依賴于層析裝置的大小、或負(fù)載在層析裝置中的固定化抗體、標(biāo)記抗體的試劑量等,但是優(yōu)選在0.05~3%(w/v)的范圍內(nèi)。尤其在5mm×10cm的層析裝置時(shí),優(yōu)選在0.1~1%((w/v)的范圍內(nèi)。
在使用其它鹽時(shí),也可以添加與氯化鉀情況下的濃度大致相等的濃度。另外,例如,也可以使用月桂酸鈉等的表面活性劑或如抗紅細(xì)胞抗體的直接作用于紅細(xì)胞膜的藥劑。在這種情況下,同樣也可以利用上述全血紅蛋白濃度的測(cè)定方法,在確定為了達(dá)成血漿中最適血紅蛋白濃度所必須得溶血?jiǎng)┑牧亢?,利用確定量的溶血?jiǎng)瑢?duì)血液檢體樣品進(jìn)行部分溶血。
一旦確定為了達(dá)成血漿中的最適血紅蛋白濃度所需的溶血?jiǎng)┑牧?,控制使用該量的溶血?jiǎng)?,以便使血液檢體樣品部分溶血。然后,為了測(cè)定血液檢體樣品中的全血紅蛋白濃度,目前使用臨床檢查中所用的任意血紅蛋白定量法。作為這種血紅蛋白定量法,例如可以舉出氰化高鐵血紅蛋白法、氧化血紅蛋白法、以及SLS-血紅蛋白法(例如參照臨床檢查法提要,改訂31版、金原初版株式會(huì)社)。在上述血紅蛋白定量法中所用的專用體外診斷藥有市售品。
若根據(jù)本實(shí)施方式的血液處理方法以及血紅蛋白類測(cè)定方法,在測(cè)定血紅蛋白類時(shí),可以省略以往必須的在溶血操作后用于稀釋血液檢體試劑的很多操作,可以簡(jiǎn)便地實(shí)現(xiàn)測(cè)定中最適的血紅蛋白濃度。
在本實(shí)施方式中,作為溶血?jiǎng)?,使用使相?duì)于紅細(xì)胞膜的滲透壓發(fā)生變化的藥劑。紅細(xì)胞在鹽濃度高于生理鹽水(0.9%NaCl)鹽溶液中收縮。另一方面,在鹽濃度低于生理鹽水(0.9%NaCl)鹽溶液中,紅細(xì)胞膨脹。通過(guò)這種紅細(xì)胞的收縮以及膨脹,紅細(xì)胞被破壞,血紅蛋白類排出紅細(xì)胞外。例如可以舉出無(wú)機(jī)鹽(例如氯化鉀、氯化鈉、或者氟化鈉等)。尤其優(yōu)選氯化鉀。如上所述,溶血是在將紅細(xì)胞置于生理?xiàng)l件即0.9%NaCl以外的環(huán)境下而發(fā)生。因此,在上述血液檢體樣品中添加上述藥劑的量是使血液中的鹽濃度在這種條件下(即除0.9%NaCl或與之等價(jià)的鹽濃度之外的濃度)并且在血漿中溶出所需量的血紅蛋白的濃度或量。例如,對(duì)于血液量50μl,若使用250μg的氯化鉀,則溶血率大致為2%。
另外,溶血?jiǎng)┮怨腆w使用。作為溶血?jiǎng)梢允褂檬紫葴?zhǔn)備含有所需量溶血性試劑的溶液,然后通過(guò)冷凍干燥該溶液而得到的固體。另外,例如可以使用首先在含有所需量的溶血性試劑的溶液中含浸基材(膜等),然后通過(guò)冷凍干燥而負(fù)載在基材上的固體。
血液檢體樣品,在開(kāi)始測(cè)定血紅蛋白類之前用溶血?jiǎng)┨幚?。或在測(cè)定血紅蛋白類的同時(shí)用溶血?jiǎng)┨幚硌簷z體樣品。無(wú)論哪一種情況,通過(guò)溶血而溶出的血紅蛋白類,可以通過(guò)以下詳細(xì)敘述的該領(lǐng)域所用的手段或技術(shù)來(lái)測(cè)定。作為實(shí)施這種方法的方式,在溶血?jiǎng)槿芤籂顟B(tài)時(shí),在測(cè)定血液檢體樣品中血紅蛋白類之前,向血液檢體樣品中添加溶血?jiǎng)?。在溶血?jiǎng)┮怨腆w而負(fù)載在基材上時(shí),可以將血液檢體樣品導(dǎo)入基材后供給測(cè)定機(jī)構(gòu),或?qū)⑦@種基材供給測(cè)定機(jī)構(gòu)時(shí)將樣品導(dǎo)入基材。
作為被測(cè)定的血紅蛋白類,可以舉出Hb、HbA(α2β2)、HbA2(α2δ2)、HbF(α2γ2)、以及HbA1(HbA與糖的結(jié)合體),以及HbA1被進(jìn)一步分類的HbA1a、HbA1b以及HbA1c。這里Hb是指含有上述血紅蛋白類的全血紅蛋白。HbA1以及該HbA1被進(jìn)一步分類的HbA1a、HbA1b以及HbA1c被稱為糖基化血紅蛋白或“糖化血紅蛋白”,具有相同的一維結(jié)構(gòu),但是β鏈的N末端纈氨酸的氨基被糖或其衍生物封閉。在本說(shuō)明書中使用的用語(yǔ)“糖化血紅蛋白”包括HbA1以及該HbA1被進(jìn)一步分類的HbA1a、HbA1b以及HbA1c。尤其HbA1c是葡萄糖非酶結(jié)合的糖化血紅蛋白。
在臨床化學(xué)上檢查Hb的組成比是非常重要的。為了臨床意義,也可以測(cè)定通過(guò)上述處理的血液檢體樣品中的至少兩種血紅蛋白類。
尤其,在本實(shí)施方式中通過(guò)控制部分溶血,可以將血液檢體樣品中的Hb(全血紅蛋白)抑制為低濃度。因此,測(cè)定的血紅蛋白類的濃度不是絕對(duì)值。即,HbA、HbA2、HbF、HbA與糖結(jié)合的HbA1、以及HbA1被進(jìn)一步分類的HbA1a、HbA1b以及HbA1c等的測(cè)定值,是以相對(duì)于全Hb量的比例表示。并且,相對(duì)于這些全Hb量的比例,由于因溶血率而變化,因此,可以充分地成為本發(fā)明的測(cè)定對(duì)象。另外,血紅蛋白濃度的絕對(duì)值,與溶血率存在相關(guān)關(guān)系,因此也可以從測(cè)定值進(jìn)行反算。
糖化血紅蛋白(尤其HbA1或HbA1c),作為糖尿病患者的血糖控制指標(biāo),更詳細(xì)地說(shuō),作為糖尿病患者的長(zhǎng)期(主要1~3個(gè)月)的血糖控制指標(biāo)而倍受矚目。例如,正常時(shí),HbA1是Hb(全血紅蛋白)的7~8%,正常時(shí),HbA1c是Hb(全血紅蛋白)的6%以下(例如4.7~5.7%)。但是,這些糖化的血紅蛋白,在糖尿病患者中有所增加。例如HbA1c達(dá)到Hb的20%。因此,通過(guò)測(cè)定糖化血紅蛋白,可以將本實(shí)施方式的測(cè)定方法很好地應(yīng)用于糖尿病的診斷、治療等。另外,根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定方法,也可以測(cè)定Hb(全血紅蛋白)以及HbA1c。
另外,根據(jù)本實(shí)施方式的測(cè)定方法,也可以將HbF作為相對(duì)于Hb的比例進(jìn)行測(cè)定。相對(duì)于Hb的HbF的比例,在正常成年中為0.3~1.3%。相對(duì)于Hb的HbF的比例,通常在遺傳性高胎兒血紅蛋白血癥、慢性骨髓性白血病、凡科尼貧血、紅白血病、發(fā)作性夜間血紅蛋白尿癥、不應(yīng)性貧血、妊娠、葡萄胎、地中海貧血(β、δβ)、不穩(wěn)定血紅蛋白癥中,很少在再生不良性貧血、白血病、多血癥(紅細(xì)胞增加癥)、骨髓纖維癥、惡性腫瘤、甲狀腺中毒癥中,比該標(biāo)準(zhǔn)范圍有所增加。因此,也可以在上述疾病的診斷中利用本實(shí)施方式的測(cè)定方法。
另外,根據(jù)本實(shí)施方式的測(cè)定方法,也可以將HbA2作為相對(duì)于Hb的比例進(jìn)行測(cè)定。相對(duì)于Hb的HbA2的比例,在正常人中為2~3.5%。在β地中海貧血、不穩(wěn)定血紅蛋白癥、鐮狀紅細(xì)胞性貧血異型、巨成紅細(xì)胞性貧血、甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)癥中,相對(duì)于Hb的HbA2的比例均比標(biāo)準(zhǔn)范圍有所增加,另一方面,在α-、δ-、δβ-地中海貧血、遺傳性高胎兒血色素癥、缺鐵性貧血、鐵芽球性貧血中,比標(biāo)準(zhǔn)范圍有所減少。因此,也可以在上述疾病的診斷中利用本實(shí)施方式的測(cè)定方法。
上述的Hb組成成分,由于等電點(diǎn)不同,因此可以通過(guò)離子交換層析法進(jìn)行定量地分離。離子交換層析法,可以使用從CYPRESS社購(gòu)入的柱子(商品名PolyCATATM)進(jìn)行實(shí)施,但是,只要是具有與該柱相同的分離能力,可以使用市售的任何柱子。上述的Hb組成成分,也可以使用能夠分別識(shí)別它們成分的抗體,利用免疫學(xué)方法進(jìn)行測(cè)定。作為免疫學(xué)方法,例如可以舉出免疫層析法、免疫集中法、固相酶免疫測(cè)定法(ELISA法)、比色玻片法、以及電極法玻片法等。
全血紅蛋白濃度,如上所述,可以使用目前臨床檢查中所用的任意的血紅蛋白定量法。作為這種血紅蛋白定量法,可以舉出氰化高鐵血紅蛋白法、氧化血紅蛋白法、以及SLS-血紅蛋白法(例如參照臨床檢查法提要,改訂31版、金原初版株式會(huì)社)。在上述血紅蛋白定量法中所用的專用體外診斷藥有市售品。
另外,血紅蛋白類的測(cè)定,可以根據(jù)基于干式化學(xué)法的測(cè)定方法進(jìn)行。所謂基于干式化學(xué)法的測(cè)定方法,是指在以干燥狀態(tài)負(fù)載試劑的固相基質(zhì)中添加液狀樣品(通常基于點(diǎn)接),使在該基質(zhì)上與試劑反應(yīng),然后通過(guò)檢測(cè)該反應(yīng)而測(cè)定樣品中的被檢物質(zhì)的方法。基于干式化學(xué)的測(cè)定方法,由于是迅速、簡(jiǎn)便并且精度良好的測(cè)定方法,因此在日常臨床檢查中可以很好地使用。作為基于干式化學(xué)的測(cè)定方法,例如可以舉出免疫層析法、免疫集中法、固相酶免疫測(cè)定法等的免疫法;比色玻片法;以及電極法玻片法。關(guān)于干式化學(xué),例如被公開(kāi)在“臨床病理,干式化學(xué)·簡(jiǎn)易檢查的新展開(kāi)(日本臨床病理學(xué)會(huì)集編、平成9年11月發(fā)行)”中。
(實(shí)施方式2)在本實(shí)施方式中,參照

可以在上述實(shí)施方式1中所述的血液處理方法以及血紅蛋白類測(cè)定方法中使用的血液處理裝置。圖3(a)以及圖3(b)是表示本實(shí)施方式的血液處理裝置的圖。
如圖3(a)所示,本實(shí)施方式的血液處理裝置10a,具備供給血液檢體樣品的基材11和負(fù)載于基材11上的對(duì)血液檢體樣品進(jìn)行部分溶血的量的溶血?jiǎng)?未圖示)。另外,溶血?jiǎng)槠茐募t細(xì)胞膜的固體藥劑。溶血?jiǎng)┦紫纫匀芤籂顟B(tài)添加在基材上,然后進(jìn)行冷凍干燥,從而以干燥狀態(tài)負(fù)載于基材上。優(yōu)選溶血?jiǎng)┰谀軌蚺c血液檢體樣品接觸的區(qū)域,以干燥狀態(tài)負(fù)載于基材上。
作為供給血液檢體樣品的基材11,可以是從用于使血液檢體樣品以點(diǎn)狀接觸的平版狀態(tài)(不溶性單層基材(例如THERALIZA(Ames)、試紙、免疫層析儀(plastic card型)等)或多層基材(例如EKUTAKEM(Kodak)、DRYKEM(富士)等)到裝樣品液體的容器形態(tài)(例如小玻璃瓶、試管、安瓶、shino-test、離心旋轉(zhuǎn)器、piccolo等)的各種基材。在本實(shí)施方式的裝置中所用的基材,可以使用紙巾(例如leedcookingpaper(注冊(cè)商標(biāo))的紙漿無(wú)紡布)、網(wǎng)眼布帛(例如紗布綿布帛)、以及玻璃纖維濾紙式的能夠吸收并保持液體的材料而制作。
作為用于測(cè)定血紅蛋白類的機(jī)構(gòu),可以舉出基于離子交換層析法或免疫學(xué)的方法(例如膠乳免疫凝集法)的測(cè)定機(jī)構(gòu)。
另外,可以代替圖3(a)所示的血液處理裝置10a,而使用圖3(b)所示的血液處理裝置10b。在血液處理裝置10b中使用的基材11,具有側(cè)面和底面(未圖示),成為具備開(kāi)口部13的適用于測(cè)定機(jī)構(gòu)的容器12。此時(shí),溶血?jiǎng)┮愿稍餇顟B(tài)被負(fù)載在容器中的能夠與血液檢體樣品接觸的區(qū)域(例如容器12內(nèi)的底部以及側(cè)面的表面等(這些可以根據(jù)測(cè)定的血液檢體樣品容積進(jìn)行適宜選擇))。血液處理裝置10b,在負(fù)載溶血?jiǎng)┑娜萜?2內(nèi)可以在投入血液檢體樣品后導(dǎo)入測(cè)定手段中,也可以將血液檢體樣品投入容器12內(nèi)。另外,也可以以間歇式或連續(xù)式將血液檢體樣品導(dǎo)入容器內(nèi)。
如背景技術(shù)欄所述那樣,為了測(cè)定血紅蛋白類需要很多用于處理血液檢體樣品的操作。
尤其,在以往為了測(cè)定HbA1c,使用基于離子交換層析法以及膠乳免疫凝集法的測(cè)定原理的自動(dòng)化機(jī)器。血液中大致150g/l的全血紅蛋白量是用上述以往的自動(dòng)化機(jī)器進(jìn)行測(cè)定中非常高的濃度。因此,一般來(lái)說(shuō)在上述自動(dòng)化機(jī)器中,嚴(yán)格設(shè)定為對(duì)血液檢體樣品進(jìn)行完全溶血的階段、將完全溶血后的樣品稀釋至可以獲得最適測(cè)定結(jié)果的濃度的階段、以及根據(jù)上述測(cè)定原理測(cè)定稀釋后的樣品的階段。作為代表的HbA1c專用測(cè)定機(jī)器,可以舉出TOSO制的Alc2.2以及BIOER制的DLS2000。前者是根據(jù)離子交換層析法原理,后者是基于膠乳免疫凝集阻止法。這些機(jī)器中的血液檢體樣品的處理方法,在完全溶血階段和稀釋階段被自動(dòng)化這一點(diǎn)是一致的。如上述的自動(dòng)化機(jī)器多使用于臨床檢查領(lǐng)域,但是為了對(duì)各種操作進(jìn)行自動(dòng)化,機(jī)器規(guī)模大并且價(jià)錢高。
這樣,在血紅蛋白類的測(cè)定中,使用上述的處理操作被自動(dòng)化的裝置時(shí),成本變高,或在不使用這種裝置時(shí),要基于很多階段操作,檢查變得麻煩。另外,在以免疫學(xué)方法測(cè)定血紅蛋白類時(shí),一旦進(jìn)行完全溶血,則濃度變得非常高,因此進(jìn)入抗原過(guò)剩區(qū)域,有時(shí)降低測(cè)定靈敏度。
但是,若使用本實(shí)施方式的血液處理裝置10a,僅通過(guò)在基材11上供給血液檢體樣品并設(shè)置于測(cè)定手段,就能夠迅速開(kāi)始紅細(xì)胞內(nèi)的成分的測(cè)定。另外,若使用本實(shí)施方式的血液處理裝置10b,僅通過(guò)在容器12內(nèi)投入血液檢體樣品并將容器12設(shè)置于測(cè)定機(jī)構(gòu),就能夠迅速開(kāi)始紅細(xì)胞內(nèi)的成分測(cè)定。
(實(shí)施方式3)在本實(shí)施方式中,對(duì)用于通過(guò)干式化學(xué)的測(cè)定方法測(cè)定血液檢體樣品中的血紅蛋白類的裝置(以下稱為血紅蛋白類測(cè)定裝置)進(jìn)行說(shuō)明。血紅蛋白類測(cè)定裝置包括對(duì)血液檢體樣品進(jìn)行部分溶血的量的溶血?jiǎng)?、與血紅蛋白類特異結(jié)合的能夠溶出的檢測(cè)物質(zhì)、與血紅蛋白類特異結(jié)合的固定化物質(zhì)。
這里使用的“能夠部分溶血的量的溶血?jiǎng)迸c上述實(shí)施方式1中敘述的相同。
上述檢測(cè)物質(zhì)是與測(cè)定對(duì)象的血紅蛋白類特異結(jié)合的被標(biāo)記的物質(zhì)。這種標(biāo)記在該技術(shù)領(lǐng)域中是公知的,例如膠質(zhì)金、酶(例如西洋辣根過(guò)氧化物酶、葡萄氧化酶)、放射性同位素(例如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(112In)以及锝(99mTc))、熒光標(biāo)記(例如熒光素、若丹明)以及生物素。這種標(biāo)記可以通過(guò)結(jié)合在相對(duì)于測(cè)定對(duì)象的血紅蛋白類的抗體而形成檢測(cè)物質(zhì)。只要與測(cè)定對(duì)象的血紅蛋白類結(jié)合,可以使用任何抗體??贵w可以是單克隆抗體也可以是多克隆抗體。優(yōu)選單克隆抗體。
固定化物質(zhì)可以是與測(cè)定對(duì)象的血紅蛋白類特異結(jié)合的任意物質(zhì)。作為這種物質(zhì),在使用免疫學(xué)方法時(shí),是相對(duì)于測(cè)定對(duì)象的血紅蛋白類的單克隆抗體。優(yōu)選對(duì)與在上述檢測(cè)物質(zhì)中使用的抗體的抗原表位不同的抗原表位反應(yīng)的單克隆抗體。
在本實(shí)施方式的血紅蛋白類測(cè)定裝置中,溶血?jiǎng)?、檢測(cè)物質(zhì)、以及固定化物質(zhì),在從裝置的血液檢體樣品的添加部位開(kāi)始依次以干燥狀態(tài)被負(fù)載。
因此,若根據(jù)本實(shí)施方式的血紅蛋白類測(cè)定裝置,添加于裝置的血液檢體樣品,邊在負(fù)載有溶血?jiǎng)z測(cè)物質(zhì)、以及固定化物質(zhì)的層間移動(dòng),邊進(jìn)行基于溶血的血紅蛋白溶出至溶出的血紅蛋白的測(cè)定。
在本實(shí)施方式的血紅蛋白類測(cè)定裝置中,溶血?jiǎng)?,例如為了?fù)載在基材上,在浸漬在層中后被冷凍干燥。溶血?jiǎng)┯捎谕ㄟ^(guò)與添加的血液接觸而反應(yīng),因此優(yōu)選在整個(gè)基材上都含有溶血?jiǎng)员悴挥妙A(yù)先決定添加血液的部位而可以測(cè)定。當(dāng)然,此時(shí),在整個(gè)基材上含有的溶血?jiǎng)┑牧?,是使溶出后的血紅蛋白類在血漿中濃度與完全溶血相比較低的濃度的量。
含有溶出后的血紅蛋白類的血液檢體樣品,一旦在負(fù)載有檢測(cè)物質(zhì)的層中移動(dòng),則負(fù)載于該層的檢測(cè)物質(zhì)溶出,溶出的血紅蛋白類與該溶出的檢測(cè)物質(zhì)發(fā)生特異反應(yīng)。因此,檢測(cè)物質(zhì)雖然在不使用裝置的狀態(tài)下以干燥狀態(tài)被負(fù)載于層中并形成固相,但是在遇著溶液時(shí),能夠在該溶液中溶出。例如,為了負(fù)載于這種層中,可以將檢測(cè)物質(zhì)含浸在層中后進(jìn)行冷凍干燥。
與檢測(cè)物質(zhì)結(jié)合的血紅蛋白類,與負(fù)載于基材(固相基質(zhì))中的固定化物質(zhì)結(jié)合。固相基質(zhì)中的檢測(cè)物質(zhì),通過(guò)檢測(cè)血紅蛋白類以及固定化物質(zhì)的夾層特異反應(yīng),可以測(cè)定血液檢體樣品中的血紅蛋白類的量。作為檢測(cè)場(chǎng)所的固相基質(zhì),可以使用通常免疫測(cè)定等中使用的基質(zhì)材料(例如纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯等)。該固相基質(zhì)也可以是膠片、試紙以及試劑片。
根據(jù)基于干式化學(xué)的測(cè)定方法的血紅蛋白類測(cè)定裝置,可以是單層方式也可以是多層方式。無(wú)論是單層方式還是多層方式,一旦使靠近血液檢體樣品的添加部位的一方作為上游,則從上游到下游,依次負(fù)載溶血?jiǎng)?、檢測(cè)物質(zhì)以及固定化物質(zhì)。
在單層方式中,如圖4所示,通過(guò)溶血?jiǎng)┛刂蒲簷z體樣品的溶血的層(本說(shuō)明書中以下也稱為溶血層)、通過(guò)檢測(cè)物質(zhì)標(biāo)記血紅蛋白類的層(本說(shuō)明書中以下也稱為標(biāo)記層)、以及檢測(cè)結(jié)合在固定化試劑中的血紅蛋白類的層(本說(shuō)明書中以下也稱為檢測(cè)層)被配置在單一(相同)層中。在單層方式中,溶血?jiǎng)?、檢測(cè)物質(zhì)以及固定化物質(zhì),從添加血液檢體樣品的部分A側(cè)開(kāi)始依次負(fù)載在可以作為血紅蛋白類檢測(cè)場(chǎng)所的基材(固相基質(zhì))41上。固相基質(zhì)41可以使用通常免疫測(cè)定等中使用的基質(zhì)材料(例如硝酸纖維素薄膜)。該固形基質(zhì)還可以是膠片、試紙以及試驗(yàn)片。
通過(guò)這種配置,添加的血液檢體樣品在固相基質(zhì)上展開(kāi)的過(guò)程中,首先最初與溶血?jiǎng)┙佑|并對(duì)血液進(jìn)行部分溶血。然后,基于部分溶血的血漿水中的血紅蛋白類與能夠溶出的檢測(cè)物質(zhì)特異結(jié)合。接著血紅蛋白類-檢測(cè)物質(zhì)的復(fù)合體育固定化試劑特異結(jié)合,生成檢測(cè)物質(zhì)-血紅蛋白類-固定化物質(zhì)。
在多層方式中,通過(guò)溶血?jiǎng)┛刂蒲簷z體樣品的溶血的層、通過(guò)檢測(cè)物質(zhì)標(biāo)記血紅蛋白類的層、以及檢測(cè)結(jié)合在固定化試劑中的血紅蛋白類的層,分別作為獨(dú)立的個(gè)別層存在,這些層以血液檢體樣品能夠在其間移動(dòng)的方式被疊層。在多層方式中,溶血?jiǎng)?、檢測(cè)物質(zhì)以及固定化物質(zhì)分別負(fù)載于各個(gè)層中,這些層從添加血液檢體樣品的一側(cè)開(kāi)始依次被疊層。負(fù)載溶血?jiǎng)┑膶?,由使添加于表面的液體浸透到其對(duì)側(cè)表面的材料構(gòu)成。例如可以使用紙漿無(wú)紡布、網(wǎng)眼布帛(例如紗布綿布帛)以及玻璃纖維濾紙式的材料,制作通過(guò)溶血?jiǎng)┛刂蒲簷z體樣品的溶血的層。溶血?jiǎng)├缈梢酝ㄟ^(guò)將溶血?jiǎng)┑娜芤汉谶@些層中,然后通過(guò)冷凍干燥而負(fù)載在層中。檢測(cè)物質(zhì)也可以負(fù)載在由使添加于表面的液體浸透到其對(duì)側(cè)表面的材料構(gòu)成的層中。檢測(cè)物質(zhì)例如也可以通過(guò)將檢測(cè)物質(zhì)的溶液含浸在這些層中,然后通過(guò)冷凍干燥而負(fù)載在層中。固定化物質(zhì)可以負(fù)載在能夠作為血紅蛋白檢測(cè)場(chǎng)所的固相基質(zhì)上。作為這種固相基質(zhì)可以舉出硝酸纖維素薄膜。這些層可以接觸配置,以便使血液檢體樣品可以在這些層間移動(dòng)。通過(guò)這種配置,添加的血液檢體樣品,在這些層間移動(dòng)的過(guò)程中,首先與溶血?jiǎng)┙佑|并對(duì)血液進(jìn)行部分溶血。然后,基于部分溶血的血漿水中的血紅蛋白類與能夠溶出的檢測(cè)物質(zhì)特異結(jié)合。接著血紅蛋白類-檢測(cè)物質(zhì)的復(fù)合體育固定化試劑特異結(jié)合,生成檢測(cè)物質(zhì)-血紅蛋白類-固定化物質(zhì)。
本實(shí)施方式的血紅蛋白類測(cè)定裝置,具備除去血液檢體樣品被溶血后的紅細(xì)胞殘留物的層。該除去紅細(xì)胞殘留物的層,可以與通過(guò)溶血?jiǎng)┛刂蒲簷z體樣品溶血的層相同?;蛘撸诒狙b置中,可以與通過(guò)溶血?jiǎng)┛刂蒲簷z體樣品溶血的層不同地另外設(shè)置除去紅細(xì)胞殘留物的層。例如可以使用紙漿無(wú)紡布、網(wǎng)眼布帛(例如紗布綿布帛)以及玻璃纖維濾紙式的材料構(gòu)成的層。本層可以吸收含有基于干式化學(xué)的血紅蛋白類測(cè)定中不需要的紅細(xì)胞膜殘骸的血漿溶液。因此,在本說(shuō)明書中也將本層稱為“吸收層”。
圖5表示本實(shí)施方式的多層式的一例血紅蛋白類測(cè)定裝置。圖5是表示本實(shí)施方式的多層式血紅蛋白類測(cè)定裝置的剖面圖。在基板(21)(基板可以是聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET))上疊層固定有抗體(23)的抗體固定化表層(22),接著在其上疊層標(biāo)記抗體冷凍干燥抗體負(fù)載層(24),然后在其上疊層溶血?jiǎng)┴?fù)載層(25)。這里,如圖2所示,溶血?jiǎng)┴?fù)載層(25)、標(biāo)記抗體冷凍干燥抗體負(fù)載層(24)、以及固定化表層(22),配置為與其下面的層部分重疊。通過(guò)這種重疊,血液檢體樣品在各層間移動(dòng),因此產(chǎn)生溶血、標(biāo)記抗體結(jié)合以及固定化抗體結(jié)合。在抗體固定化表層(22)的剝出區(qū)域(即溶血?jiǎng)┴?fù)載層(25)以及標(biāo)記抗體冷凍干燥負(fù)載層(24)沒(méi)有重疊的區(qū)域)上固定與血紅蛋白類特異結(jié)合的抗體,在該區(qū)域,可以檢測(cè)血液檢體樣品中的血紅蛋白類的反應(yīng)。另外,吸收層(26)疊層在抗體固定化表層(22)上的與血液檢體樣品的添加側(cè)相反側(cè)(即標(biāo)記抗體冷凍干燥抗體負(fù)載層(24)沒(méi)有重疊的側(cè))的區(qū)域。吸收層吸收存在于反應(yīng)檢測(cè)區(qū)域的含有在檢測(cè)中不需要的紅細(xì)胞殘骸的血漿溶液,可以輔助反應(yīng)的檢測(cè)。另外,從溶血?jiǎng)┴?fù)載層(25)、標(biāo)記抗體冷凍干燥抗體負(fù)載層(24)、以及抗體固定化表層(22)的三層重疊的區(qū)域至反應(yīng)檢測(cè)區(qū)域,為了防止基于添加的樣品的濕潤(rùn)的干燥以及為了避免妨礙樣品測(cè)定的物質(zhì)的混入,可以被覆不透過(guò)性片材(27)。作為這種不透過(guò)性片材,可以舉出玻璃紙。溶血?jiǎng)┴?fù)載層(25)的重疊部分以外,不用不透過(guò)性片材被覆。在該非被覆部分上可以添加血液檢體樣品。不透過(guò)性片材(27)也可以被覆抗體固定化表層(22)與吸收層(26)重疊的區(qū)域以及沒(méi)有與抗體固定化表層(22)重疊的吸收層(26)的至少一部分。通過(guò)這種被覆,可以不妨礙從抗體固定化表層(22)向吸收層(26)的吸收。
如以上所示,在測(cè)定血細(xì)胞中的成分時(shí),通過(guò)使血液檢體樣品部分溶血,可以去除以往必須的稀釋階段。在手動(dòng)情況下,通過(guò)使用本發(fā)明的方法,可以省略稀釋操作。另外,在目前稀釋階段自動(dòng)化的情況下,可以從自動(dòng)化機(jī)器省略自動(dòng)稀釋階段,從而可以使機(jī)器小型化以及降低成本。
因此,根據(jù)本發(fā)明可以提供能夠更容易測(cè)定血紅蛋白類等的血細(xì)胞中成分的血液處理方法、血紅蛋白類測(cè)定方法、血液處理裝置以及血紅蛋白類測(cè)定裝置。根據(jù)本發(fā)明可以簡(jiǎn)便快速地測(cè)定血紅蛋白類。
實(shí)施例以下根據(jù)HbA1c的測(cè)定例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例。需要說(shuō)明的是本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。在實(shí)施例中所用的材料、試劑等,只要沒(méi)有特殊限定均可以從市場(chǎng)獲取。
(實(shí)施例1吸光法中的溶血?jiǎng)┨砑恿康淖钸m范圍)
分別在1.5、7.5、15、75以及150mg的氯化鉀中添加全血檢體樣品(HbA1c值4.8%)1.5ml(即各個(gè)氯化鉀比例為0.1%、0.5%、1%、5%、以及10%,這些比例是重量/體積),混濁,然后進(jìn)行離心分離,取出上清液1.0ml。對(duì)于它們的各個(gè)上清液,測(cè)定350~800nm的透光率,結(jié)果表示在圖6中。例如在500nm,溶血?jiǎng)?這里是指氯化鉀)的添加量以0.1~0.5%左右為宜,在700nm以0.1~10%左右為宜。
(實(shí)施例2溶血?jiǎng)┑牧颗cHb濃度以及HbA1c值的關(guān)系)分別在1.5、7.5、15、75以及150mg的氯化鉀中添加全血檢體樣品(HbA1c值4.8%)1.5ml(即各個(gè)氯化鉀比例為0.1%、0.5%、1%、5%、以及10%,這些比例是重量/體積),混濁,然后進(jìn)行離心分離,取出上清液1.0ml。通過(guò)SLS-血紅蛋白法測(cè)定存在于該上清液中的Hb濃度。對(duì)于SLS-血紅蛋白法進(jìn)行闡述。作為專用試劑使用和光純藥出售的血紅蛋白B-檢測(cè)和純實(shí)施SLS-血紅蛋白法。對(duì)于血紅蛋白的發(fā)色原液即0.67mM月桂酸鈉5.0ml,加入血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(1、5、10、50、100以及150g/L)0.02ml,充分混合,然后再室溫下放置大致3分鐘,制作血紅蛋白對(duì)照溶液。在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定這些對(duì)照溶液的吸光度。利用所得值,制作關(guān)于血紅蛋白濃度的吸光度(540nm)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后,在以各種溶血率處理的樣品中,利用上述上清液0.02ml,經(jīng)過(guò)同樣的處理并測(cè)定吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各血紅蛋白濃度。
另一方面,利用專用HPLC(Alc2.2、TOSO制)測(cè)定HbA1c值。將溶血處理的樣品放入試管內(nèi),設(shè)在該裝置上,進(jìn)行自動(dòng)測(cè)定。這里所得HbA1c值,相當(dāng)于相對(duì)全血紅蛋白的HbA1c的比例(%)。
圖7表示以上的結(jié)果。在圖7中,下方的橫軸表示添加的氯化鉀的濃度(%),左面的縱軸表示Hb濃度(mg/ml),另外,右面的縱軸表示HbA1c值(%)。另外,圖7中的黑圈表示Hb濃度的結(jié)果,并且白圈表示HbA1c值的結(jié)果。
圖7表示Hb濃度依賴于KCl濃度并且基于溶血而變高。另外,Hb濃度依賴于溶血?jiǎng)┑牧慷兓荋bA1c顯示不變。因此,在測(cè)定相對(duì)于全血紅蛋白的血紅蛋白類的比例(%)時(shí),沒(méi)有必要完全溶血,因此也暗示沒(méi)有稀釋階段的必要性。
(實(shí)施例3利用免疫層析法的HbA1c的測(cè)定)(2.1.Hb測(cè)定用裝置以及HbA1c測(cè)定用裝置的制作)在本實(shí)施例中,制作可以用于HbA1c測(cè)定的裝置。如圖5所示,該裝置是分別在各層上進(jìn)行基于溶血?jiǎng)┑娜苎?、與抗體的反應(yīng)以及該反應(yīng)的檢測(cè)的多層式。圖5是本發(fā)明的多層式裝置的一例剖面圖。首先對(duì)于各層的制作進(jìn)行說(shuō)明。
<膠質(zhì)金標(biāo)記抗體冷凍干燥固定化物(24)>
在三角燒瓶中放入蒸餾水198ml以及1%氯金酸水溶液2ml,使所得混合水溶液沸騰,在沸騰的水溶液中快速添加1%檸檬酸三鈉水溶液4ml。添加后,在確認(rèn)混合水溶液的顏色變?yōu)榧t紫色后,再以沸騰狀態(tài)放置15分鐘。之后,取出三角燒瓶,通過(guò)在室溫下放置,進(jìn)行自然冷卻,得到膠質(zhì)金液。在所得膠質(zhì)金液中添加0.2M碳酸鉀水溶液,調(diào)整pH為8.9。在該膠質(zhì)金液中,添加1.55mg/ml的通過(guò)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄存中心收藏編號(hào)FERM BP-7288號(hào)細(xì)胞株產(chǎn)生的抗Hb單克隆抗體的溶液1.6ml,攪拌3分鐘。進(jìn)而添加10%牛血清白蛋白(BSA)水溶液(pH8.9)20ml,進(jìn)一步攪拌3分鐘。之后,為了去除未標(biāo)記的抗體以及BSA,進(jìn)行離心,通過(guò)抽吸器除去上清液。用0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾所得的膠質(zhì)金標(biāo)記抗Hb單克隆抗體1%BSA·PBS懸濁液,除去凝集塊。之后,使膠質(zhì)金標(biāo)記抗Hb抗體21懸濁液含浸在玻璃纖維濾紙上,利用液態(tài)氮進(jìn)行冷凍,通過(guò)在冷凍干燥機(jī)中放置24小時(shí)制作冷凍干燥固定化物。
<Hb測(cè)定用/抗體固定化表層(22)>
在硝酸纖維素性表層上對(duì)通過(guò)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄存中心收藏編號(hào)FERM BP-7289號(hào)細(xì)胞株產(chǎn)生的抗Hb單克隆抗體的溶液(PBS)進(jìn)行固定。固定后,用脫脂乳進(jìn)行封閉。接著,用0.1MTris(PH8.2)清洗2次,使干燥。
<HbA1c測(cè)定用/抗體固定化表層(22)>
在硝酸纖維素性表層上對(duì)通過(guò)獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄存中心收藏編號(hào)FERM BP-7636號(hào)細(xì)胞株產(chǎn)生的抗HbA1c單克隆抗體的溶液進(jìn)行固定。固定后,用脫脂乳進(jìn)行封閉。接著,用0.1M Tris(PH8.2)清洗2次,使干燥。
<溶血?jiǎng)┴?fù)載固相(25)>
在Leedcookingpaper(注冊(cè)商標(biāo)) (LION社出售)上,使含浸相對(duì)于全樣品量的0.5%(w/v)的KCl,進(jìn)行冷凍干燥。
<Hb測(cè)定用裝置以及HbA1c測(cè)定用裝置的構(gòu)建>
利用上述制作的膠質(zhì)金標(biāo)記抗體冷凍干燥負(fù)載層、Hb測(cè)定用抗體固定化表層或HbA1c測(cè)定用抗體固定化表層、以及溶血?jiǎng)┴?fù)載層,如圖5所示,構(gòu)建Hb測(cè)定用裝置以及HbA1c測(cè)定用裝置。以下說(shuō)明該裝置的構(gòu)建。
在基板(21)(聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯松本制作所制)上疊層固定有抗體(23)的抗體固定化表層(22),接著在其上疊層膠質(zhì)金標(biāo)記抗體冷凍干燥負(fù)載層(24),然后再在其上疊層溶血?jiǎng)┴?fù)載層(25)。這里,如圖5所示,溶血?jiǎng)┴?fù)載層(25)、膠質(zhì)金標(biāo)記抗體冷凍干燥抗體負(fù)載層(24)、以及抗體固定化表層(22),配置為與其下面的層重疊。在抗體固定化表層(22)的剝出區(qū)域(即溶血?jiǎng)┴?fù)載層(25)以及膠質(zhì)金標(biāo)記抗體冷凍干燥負(fù)載層(24)沒(méi)有重疊的區(qū)域)上固定與血紅蛋白類特異結(jié)合的抗體,該區(qū)域,可以作為用于檢測(cè)血液檢體樣品中的血紅蛋白類的反應(yīng)的區(qū)域。另外,玻璃纖維濾紙吸收層(26)疊層在抗體固定化表層(22)上的與血液檢體樣品的添加側(cè)相反側(cè)(即膠質(zhì)金標(biāo)記抗體冷凍干燥抗體負(fù)載層(24)沒(méi)有重疊的側(cè))的區(qū)域。另外,從溶血?jiǎng)┴?fù)載層(25)、膠質(zhì)金標(biāo)記抗體冷凍干燥抗體負(fù)載層(24)、以及抗體固定化表層(22)的三層重疊的區(qū)域至反應(yīng)檢測(cè)區(qū)域,被覆不透過(guò)性片材(27)(玻璃紙)。溶血?jiǎng)┴?fù)載層(25)的重疊部分以外暴露。該暴露部分是點(diǎn)上血液檢體樣品的區(qū)域。不透過(guò)性片材(27)也可以被覆抗體固定化表層(22)與吸收層(26)重疊的區(qū)域以及沒(méi)有與抗體固定化表層(22)重疊的吸收層(26)的一部分。通過(guò)這種被覆,可以不妨礙從抗體固定化表層(22)向吸收層(26)的吸收。
<利用Hb測(cè)定用裝置以及HbA1c測(cè)定用裝置的血紅蛋白類測(cè)定>
對(duì)于含有負(fù)載0、0.05、0.1、0.5、0.7、1.0、3.0%(w/v)的KCl溶血?jiǎng)┴?fù)載層的各個(gè)裝置,點(diǎn)上160μl的血液,5分鐘后,測(cè)定610nm的反射吸光度。其結(jié)果顯示在圖8中。
在圖8中,通過(guò)顯示從0.1~1.0%(w/v)KCl中的顯色強(qiáng)度,可以推知KCl量的最適范圍為0.1~1.0%(w/v)。在該裝置中,優(yōu)選作為半值的0.5%(w/v)KCl,如在上述<溶血?jiǎng)┴?fù)載固相(25)>中所述那樣,在本實(shí)施例中,使0.5%(w/v)KCl負(fù)載于溶血?jiǎng)┕潭ㄏ?25)上來(lái)進(jìn)行HbA1c的測(cè)定。
首先,利用Hb標(biāo)準(zhǔn)液或HbA1c標(biāo)準(zhǔn)液制作稀釋系列。將該稀釋系列160μl點(diǎn)在裝置上,5分鐘后測(cè)定610nm的反射吸光度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖9表示Hb測(cè)定用裝置的標(biāo)準(zhǔn)曲線,圖10表示HbA1c測(cè)定用裝置的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖9中,橫軸表示Hb濃度(mg/dl),縱軸表示610nm的反射吸光度的值。另外,圖9中的黑圈表示各稀釋系列的Hb濃度的吸光度的結(jié)果。圖10中,橫軸表示HbA1c濃度(mg/dl),縱軸表示610nm的反射吸光度的值。另外,圖10中的黑圈表示各稀釋系列中的HbA1c濃度的吸光度的結(jié)果。
下面,將含有4.0、5.4或10.4%HbA1c的血液檢體樣品160μl的血液點(diǎn)在裝置上,5分鐘后,測(cè)定反射吸光度。其結(jié)果顯示在圖11中。在圖11中,橫軸表示HbA1c的值(%),左面的縱軸表示對(duì)于Hb的反射吸光度,另外,右面的縱軸表示對(duì)于HbA1c的反射吸光度。另外,圖11中的黑圈表示Hb濃度的結(jié)果,并且白圈表示HbA1c值的結(jié)果。從圖9以及圖10分別根據(jù)所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)圖11的結(jié)果的各吸光度值進(jìn)行回歸,計(jì)算出Hb濃度以及HbA1c濃度(圖12)。圖12中橫軸表示610nm的反射吸光度,左面的縱軸表示通過(guò)換算計(jì)算出的Hb濃度(mg/dl),右面的縱軸表示通過(guò)換算計(jì)算出的HbA1c濃度(mg/dl)。另外,圖12中的黑圈表示Hb濃度的結(jié)果,并且白圈表示HbA1c濃度(mg/dl)的結(jié)果。在上述任一血液檢體樣品中,Hb濃度大致相同。由此可知在上述任一血液檢體樣品中可以使溶血程度大致相同。利用通過(guò)該裝置測(cè)定所得的Hb濃度(mg/dl)以及HbA1c濃度(mg/dl)來(lái)確定各HbA1c值的樣品的HbA1c值(%) (通過(guò)HbA1c濃度(mg/dl)/Hb濃度(mg/dl)×100來(lái)計(jì)算)。其結(jié)果分別算出HbA1c值4.0%的檢體為3.9%,HbA1c值5.4%的檢體為5.7%,HbA1c值10.4%的檢體為11.2%。由此可以確認(rèn),通過(guò)控制使血液檢體樣品部分溶血,可以測(cè)定血紅蛋白類。
根據(jù)以上結(jié)果,可以制作不需要稀釋階段而在一個(gè)階段可以簡(jiǎn)便地進(jìn)行測(cè)定的裝置。
根據(jù)本發(fā)明可以簡(jiǎn)便并且迅速地測(cè)定血紅蛋白類。
產(chǎn)業(yè)上的利用本發(fā)明可以用于營(yíng)養(yǎng)管理以及醫(yī)療診斷的領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種血液處理方法,包括準(zhǔn)備含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品及溶血?jiǎng)┑墓ば?a)、通過(guò)混合上述血液檢體樣品與上述溶血?jiǎng)┒{(diào)制混合樣品的工序(b),上述溶血?jiǎng)┦瞧茐募t細(xì)胞膜的固體藥劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血液處理方法,其中,在上述工序(b)中,在上述混合樣品中殘存血細(xì)胞成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血液處理方法,其中,上述溶血?jiǎng)┦鞘瓜鄬?duì)于紅細(xì)胞膜的滲透壓變化的藥劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血液處理方法,其中,上述溶血?jiǎng)┦菬o(wú)機(jī)鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的血液處理方法,其中,上述混合樣品中的上述無(wú)機(jī)鹽的濃度在0.05~10%(w/v)的范圍內(nèi)。
6.一種血紅蛋白類測(cè)定方法,包括準(zhǔn)備含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品及溶血?jiǎng)┑墓ば?a)、通過(guò)混合血液檢體樣品與溶血?jiǎng)┒{(diào)制混合樣品的工序(b)、測(cè)定上述混合樣品的血漿中的血紅蛋白類的工序(c),上述溶血?jiǎng)槠茐募t細(xì)胞膜的固體藥劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的血紅蛋白類測(cè)定方法,其中,在上述工序(c)中,作為測(cè)定上述混合樣品中的血漿中含有的血紅蛋白類的方法,使用免疫層析法、免疫集中法、固相酶免疫測(cè)定法、比色玻片法、以及電極法玻片法中的任意一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的血紅蛋白類測(cè)定方法,其中,在上述工序(c)中,至少測(cè)定2種血紅蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的血紅蛋白類測(cè)定方法,其中,上述至少2種血紅蛋白是血紅蛋白與HbA1c的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的血紅蛋白類測(cè)定方法,其中,上述血紅蛋白類是糖化血紅蛋白。
11.一種血液處理裝置,具備基材與用于破壞紅細(xì)胞膜的固體溶血?jiǎng)?,在形成含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品與上述溶血?jiǎng)┑幕旌蜆悠窌r(shí),在上述基材上負(fù)載的所述固體溶血?jiǎng)┑牧?,是使血?xì)胞成分在上述混和樣品中有殘存的量。
12.一種血紅蛋白類測(cè)定裝置,用于測(cè)定含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品中的血紅蛋白類,具備具有上述血液檢體樣品的添加部的基材、用于破壞紅細(xì)胞膜的溶血?jiǎng)?、與上述血紅蛋白類特異結(jié)合的檢測(cè)物質(zhì)、與上述血紅蛋白特異結(jié)合的固定化物質(zhì),在上述基材上負(fù)載的所述固體溶血?jiǎng)┑牧?,是使血?xì)胞成分在上述混和樣品中有殘存的量,上述溶血?jiǎng)?、上述檢測(cè)物質(zhì)、以及上述固定化物質(zhì)分別以固體負(fù)載在上述基材上,從靠近上述基材的上述血液檢體樣品的添加部依次配置上述溶血?jiǎng)?、上述檢測(cè)物質(zhì)、上述固定化物質(zhì)。
13.一種血紅蛋白類的測(cè)定裝置,用于測(cè)定含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品中的血紅蛋白類,具備基板;設(shè)置于上述基板上的上述血液檢體樣品的添加部;溶血層,設(shè)置于上述基板上,含有用于破壞紅細(xì)胞膜的固體的溶血?jiǎng)?,用于控制上述血液檢體樣品的溶血;標(biāo)記層,設(shè)置于上述基板上,含有與血紅蛋白類特異結(jié)合的檢測(cè)物質(zhì),用于標(biāo)記上述血紅蛋白類;檢測(cè)層,設(shè)置于上述基板上,含有與上述血紅蛋白類特異結(jié)合的固定化試劑,用于檢測(cè)上述血紅蛋白類,上述血液檢體樣品可以在上述溶血層、上述標(biāo)記層以及上述檢測(cè)層之間移動(dòng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的血紅蛋白類測(cè)定裝置,其中,還具備在上述血液檢體樣品被溶血后用于除去紅細(xì)胞殘留物的層。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的血紅蛋白類測(cè)定裝置,其中,上述溶血層、上述標(biāo)記層、以及上述檢測(cè)層配置在單一層中。
全文摘要
一種血液處理方法,如圖1所示,包括準(zhǔn)備含有紅細(xì)胞的血液檢體樣品及溶血?jiǎng)┑墓ば?St1)、通過(guò)混合血液檢體樣品與溶血?jiǎng)┒{(diào)制混合樣品的工序(St2),這里的溶血?jiǎng)┦瞧茐募t細(xì)胞膜的固體藥劑。
文檔編號(hào)G01N33/72GK1522369SQ0380059
公開(kāi)日2004年8月18日 申請(qǐng)日期2003年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者北脅文久, 重藤修行, 河村達(dá)朗, 朗, 行 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1