專利名稱：核苷三磷酸衍生物、核酸探針、多標(biāo)記核酸探針、制備多標(biāo)記核酸探針的方法以及探測靶 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核苷三磷酸衍生物、核酸探針、多標(biāo)記核酸探針、制備多標(biāo)記核酸 探針的方法以及探測靶核酸的方法。
背景技術(shù)：
通過使用核酸探針，如帶有某種標(biāo)記的RNA探針，從而在細(xì)胞水平上探測和顯示 DNA或RNA的表達(dá)模式，可以解釋有關(guān)生命現(xiàn)象的許多問題。這種使基因表達(dá)模式在細(xì)胞水 平上可視化的技術(shù)被稱為原位雜交(ISH)，并且在該技術(shù)中使用的探針標(biāo)記方法可大體上 分為“放射性同位素標(biāo)記法”、“熒光抗體標(biāo)記法”和“酶抗體標(biāo)記法”。在歷史上，最先開發(fā) 了具有引入的放射性同位素的核酸探針，但近些年來，關(guān)于這種探針的操作已經(jīng)加入了很 多限制，因此，不需要使用放射性同位素成分的熒光抗體標(biāo)記法和酶抗體標(biāo)記法正在引起 廣泛的關(guān)注。在這些技術(shù)中，在核酸探針的制備過程中用抗原或抗生素進(jìn)行標(biāo)記，然后將核酸 探針和靶核酸進(jìn)行雜交后，采用由酶或熒光材料標(biāo)記的抗體或親和素的免疫染色法來進(jìn)行 探測。由于酶反應(yīng)可實現(xiàn)信號放大效應(yīng)，所以酶抗體標(biāo)記法具有良好的靈敏度，因此目前使 用最為廣泛。已知的應(yīng)用酶抗體標(biāo)記法的核酸探針的例子包括抗原-多標(biāo)記核酸探針，其中以 隨機排列的方式引入了在如地高辛(DIG)的抗體識別位點處進(jìn)行了修飾的多個核苷酸衍 生物。在將該抗原-多標(biāo)記核酸探針和靶核酸進(jìn)行原位雜交后，由識別抗體識別位點的酶 標(biāo)記抗體引導(dǎo)抗原-抗體反應(yīng)，并采取利用與堿性磷酸酶雜交的顯色反應(yīng)來進(jìn)行探測。然 而，這種方法有一些問題，包括酶標(biāo)記抗體極其貴，抗原-抗體反應(yīng)所需的操作復(fù)雜，以及 由非特異性吸附引起的背景值升高等等。另一方面，人們已經(jīng)知道一種方法，其中，使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)來實現(xiàn)外源 性分子與肽或蛋白質(zhì)的位點-特異性結(jié)合，其中，所述外源性分子為陰離子性的并且具有 TCase可識別的谷氨酰胺(Gln)殘基，而所述肽或蛋白質(zhì)具有TGase可識別的賴氨酸殘基或 伯胺(例如，見專利文獻(xiàn)1)。
現(xiàn)有技術(shù)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 JP 2008-54658A

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明提供了一種新型核苷三磷酸衍生物，一種核酸探針以及一種能方便并高靈 敏度地探測靶核酸的多標(biāo)記核酸探針，并且還提供了一種制備該多標(biāo)記核酸探針的方法，以及一種使用該多標(biāo)記核酸探針或該核酸探針探測靶核酸的方法。解決問題的方法本發(fā)明提供了一種具有谷氨酰胺(Gln)殘基的核苷三磷酸衍生物。而且，該核苷三磷酸衍生物優(yōu)選用下述式(1)表示。
權(quán)利要求
1.一種具有谷氨酰胺(Gln)殘基的核苷三磷酸衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷三磷酸衍生物，其用下式(1)表示 O
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷三磷酸衍生物，其用下式(2)表示 HN-A1
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷三磷酸衍生物，其用下式(3)表示 NH2 ‘
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷三磷酸衍生物，其用下式(4)表示 0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷三磷酸衍生物，其用下式(5)表示
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的核苷三磷酸衍生物，其中，X和Y各自獨立地代表具有1到 48個碳原子數(shù)的亞烷基或者具有2到48個碳原子數(shù)的亞烯基，并且Z代表具有1到48個 碳原子數(shù)的烷基、具有1到48個碳原子數(shù)的烷氧基、具有6到48個碳原子數(shù)的芳基、具有6 到48個碳原子數(shù)的芳氧基、具有7到48個碳原子數(shù)的芳烷基、或者具有7到48個碳原子 數(shù)的芳烷氧基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的核苷三磷酸衍生物，其中，X代表亞乙烯基，Y代表亞甲基，并 且Z代表芐氧基。
9.一種核酸探針，其為在其中已引入多個根據(jù)權(quán)利要求1 8中任一項的核苷三磷酸 衍生物作為結(jié)構(gòu)單元的核酸。
10.一種多標(biāo)記核酸探針，其包含具有賴氨酸(Lys)殘基或伯胺并含有標(biāo)記部分的標(biāo) 記化合物，該標(biāo)記化合物與根據(jù)權(quán)利要求9的核酸探針中的至少兩個谷氨酰胺(Gln)殘基 分別結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的多標(biāo)記核酸探針，其中，所述標(biāo)記部分為酶和熒光染料中 的至少一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的多標(biāo)記核酸探針，其中，所述酶為來源于超嗜熱菌的酶。
13.一種制備多標(biāo)記核酸探針的方法，該方法包括用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)使具有賴氨酸(Lys)殘基或伯胺并包含標(biāo)記部分的標(biāo)記化合 物與根據(jù)權(quán)利要求9的核酸探針中的至少兩個谷氨酰胺(Gln)殘基分別結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備多標(biāo)記核酸探針的方法，其中，所述標(biāo)記部分為酶和 熒光染料中的至少一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的制備多標(biāo)記核酸探針的方法，其中，所述酶為來源于超嗜 熱菌的酶。
16.一種探測靶核酸的方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求10 12中任一項所述的多標(biāo)記核酸探針和存在于靶材料中的靶核酸 通過核酸部分進(jìn)行特異性結(jié)合，以及通過標(biāo)記部分探測所結(jié)合的多標(biāo)記核酸探針。
17.—種探測靶核酸的方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要 求9所述的核酸探針和存在于靶材料中的靶核酸通過核酸部分進(jìn)行特 異性結(jié)合，隨后通過使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)使核酸探針內(nèi)的谷氨酰胺(Gln)殘基與具有賴氨 酸(Lys)殘基或伯胺并包含標(biāo)記部分的標(biāo)記化合物內(nèi)的賴氨酸(Lys)殘基或伯胺反應(yīng)，從 而引入多個標(biāo)記部分，以及通過標(biāo)記部分來探測所結(jié)合的核酸探針。
全文摘要
一種新的核苷三磷酸衍生物、一種核酸探針和一種能方便并高靈敏度地探測靶核酸的多標(biāo)記核酸探針，以及一種制備該多標(biāo)記核酸探針的方法，和一種使用該多標(biāo)記核酸探針或該核酸探針探測靶核酸的方法。通過使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)，并使用通過共價結(jié)合預(yù)先引入多個標(biāo)記部分的多標(biāo)記核酸探針，或者通過共價結(jié)合將多個標(biāo)記部分引入已與靶核酸雜交的核酸探針中，從而可以方便和高靈敏度地探測靶核酸。
文檔編號C12N15/09GK102105482SQ20098012900
公開日2011年6月22日 申請日期2009年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月24日
發(fā)明者平石佳之, 神谷典穗, 野地澄晴 申請人:國立大學(xué)法人九州大學(xué), 國立大學(xué)法人德島大學(xué), 阿洛卡株式會社