專利名稱：抑郁癥的gaba生物標記的制作方法
技術領域：
已經鑒定了與非抑郁受試者的腦組織樣品相比，在患有遲發(fā)性抑郁癥 (late-onset depression)的受試者腦組織樣品中被上調或被下調的生物標記。本發(fā)明提 供了篩選方法，以鑒定可用于治療、預防和診斷遲發(fā)性抑郁癥的化合物。本發(fā)明也提供可用 于治療、預防和診斷遲發(fā)性抑郁癥的方法。相關技術的描述有15%的美國人在其生命中的某一點受到抑郁癥的影響，在任意給定的某一天就 有1億人受到影響。發(fā)病年齡分布相當均勻并可突然在某些天發(fā)病或持續(xù)數年。超過半數 經歷重性抑郁癥的人僅有一次發(fā)作。然而，隨著每次連續(xù)發(fā)作，下次發(fā)作時有15%的危險將 成為躁狂癥，診斷變?yōu)殡p相性精神障礙。最終，大約15-20%重性抑郁癥患者變?yōu)槁砸钟?并且約15%重性抑郁癥患者可能自殺；男性自殺率通常是女性的2倍。目前，對于涉及抑郁癥的神經生物學僅有有限的了解，但是日益明確的是，該疾病 是多層面的并且可能涉及大量因素，這些因素或協(xié)同作用或獨立作用而導致情感變化。抑 郁癥是一種復雜障礙，并非受控于單一病理學，這樣單一病理學可用作標記，用于治療、診 斷和篩選的目的。涉及了許多神經遞質系統(tǒng)，對若干靶標已經進行了廣泛研究并導致產 生一定范圍的治療選項。目前可用的治療包括單胺氧化酶抑制劑(MAOI)、三環(huán)抗抑郁藥 (TCA)、特異性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRI)、去甲腎上腺素能再攝取抑制劑(NRI)、5-羥 色胺去甲腎上腺素能再攝取抑制劑(SNRI)和去甲腎上腺素多巴胺再攝取抑制劑(NDRI)。 然而，現有抗抑郁藥并不令人滿意，因為它們有許多副作用，而且因患者病史和所治療的確 切病癥的不同而具有不同功效。Y-氨基丁酸(GABA)受體是一類響應神經遞質GABA的受體，所述神經遞 質GABA是脊椎動物中樞神經系統(tǒng)中的主要抑制性神經遞質。GABA受體的綜述參見 Bormann (2000Trends Pharm. Sci. ；1(1) 16-19)。有 3 類 GABA 受體GABAa、GABAb 和 GABAC。 GABAa受體和GABA。受體是離子型受體(也稱為配體_門控離子通道)，而GABAb受體是代 謝型受體(也稱為G蛋白偶聯(lián)受體)。GABAa受體直接門控Cl—離子載體并具有苯并二氮雜 草類、巴比妥類、神經類固醇類和乙醇的調節(jié)結合位點。GABAc受體是對藥物荷包牡丹堿和 巴氯芬不敏感的Cl_孔。相反，GABAb受體通過G蛋白和第二信使系統(tǒng)與Ca2+通道和K+通 道偶聯(lián)；它們由激動劑巴氯芬激活并對調節(jié)GABAa受體的藥物具有抗性。GABA受體與心境障礙(包括抑郁癥)相關。Emrich 等(Archiv Psychiatrie Nervenkrankheiten 1980 ;229 1—16)證明了 丙戊酸鹽在治療躁狂抑郁患者中的功效。他們提出，丙戊酸鹽通過提高GABA腦濃度，可 補償潛在的GABA能缺乏。在Emrich的假說之后，一些動物和人類研究評價了 GABA能 異常在抑郁癥病理生理學中的可能作用(Krystal等，2002Mol. Psychiatry ；2 :S71_S80 ； Merali ^,2004J. Neurosci. ；24(6) 1478-1485 ；Bipolar Disorders, Basic Mechanisms and Therapeutic Implication. Marcel Dekker :New York, 2000,第 143-165 頁)。正如 Brambilla等(2003Molecular Psychiatry ；8 :721_737)的綜述，動物和臨床研究已經表明GABA能活性的缺乏可能涉及抑郁癥的病理生理學。 US 2005/0209181公開了經診斷患有精神分裂癥的病人尸體解剖腦的表達譜并提 出所鑒定的標記也可用于靶向抑郁癥。在其它靶標中，該專利出版物提出了 GABAa受體的 各種亞單位(艮P α 1、α 2、α 4、α 5、α 6、β 1、γ 2、δ )與抑郁癥的關系。在WO 2008/020435中，發(fā)現在抑郁癥的動物模型中GABAa受體各種亞單位(即 α 1、α 2、α 3、α 4、α 5、α 6、β 1、β 2、δ、ρ 3、θ )的改變的表達。也發(fā)現了 GABAb 受體 的改變的表達。在WO 02/20492中，教導四氫吲唑衍生物類在其它疾病中可用于診斷和治療抑郁 癥。WO 02/20492教導，四氫吲唑衍生物作為激動劑在α 2或α 3起作用并因此可用于治療 抑郁障礙或雙相性精神障礙。然而，這些已報告的異?？赡懿⒎鞘且钟舭Y所特有的，因為GABA能的改變也已經 在例如焦慮障礙(Kosel 等，2004Neurophsychopharmacol ；29 :347_50)、精神分裂癥(Int J Neuropsychopharmacol 2002 ;5 159—179)禾口原恐障礙(Biol Psychiatry 2000 ；47 96-106)的相關病理學中提出。此外，在 Kugaya 等(2003 Biol Psychiatry ；54 792~9)檢 查抑郁患者中GABAa結合[123I]碘西尼(iomazenil)的結合研究中，與非抑郁受試者相比， 在抑郁患者中并無顯著差異。遲發(fā)性抑郁癥的神經生物學基礎仍有大部分尚未研究過，阻礙了對有效治療的開 發(fā)。在老年人中，抑郁癥是僅次于癡呆的第二大最常見精神障礙，影響大約3%的65歲以 上的老人，還有12%罹患較輕的但仍會令人衰弱的抑郁癥(Beekman等，British Journal of Psychiatry 174, 307-311 (1999)) 0大約有三分之一的患者對初期抗抑郁藥治療無反 應，同時他們仍然對復發(fā)、慢性和癡呆具有非常高的危險(Cole等，American Journal of Psychiatry 1^,1182-1189 (1999)) 0因此，就發(fā)病率和致死率以及健康和社會護理負擔 而言，遲發(fā)性抑郁癥涉及相當高的費用。已經提出，與年輕患者的抑郁癥相比，對遲發(fā)性 抑郁癥的臨床管理應當根據其具體病理生理特征而定制(Thomas等，American Journal of Psychiatry 157,1682-1684(2000) ；Thomas φ, British Journal of Psychiatryl81, 129-134(2002))。因此，需要在遲發(fā)性抑郁癥的治療和診斷中具有特定應用的臨床策略。發(fā)明概述目前已經證明，與非抑郁受試者相比，在患有遲發(fā)性抑郁癥的患者腦中涉及GABA 系統(tǒng)的基因存在差異表達。提供篩選方法，用于鑒定可用于治療、預防或診斷遲發(fā)性抑郁癥 的化合物。也提供可用于治療、預防和診斷遲發(fā)性抑郁癥的方法。本發(fā)明具有如下優(yōu)勢其 提供了與遲發(fā)性抑郁癥病理生理學特異性相關的生物標記。發(fā)明詳述體內成像方法本發(fā)明提供用于判定受試者是否患有或易患遲發(fā)性抑郁癥的體內成像方法，所述 方法包括下列步驟(i)將體內成像劑給予所述受試者，其中所述體內成像劑包含與多核苷酸或多肽 選擇性締合的化合物，所述多核苷酸或多肽是由GABA能受體基因所編碼，并且其中所述化 合物用體內成像部分標記；
(ii)讓所述體內成像劑與在所述受試者組織中表達的所述多核苷酸和/或所述 多肽選擇性締合；(iii)通過體內成像方法檢測由所述體內成像部分所發(fā)射的信號；和，(iv)產生代表所述信號的位置和/或數量的圖像。 本文所用的術語“^M^”是指這樣的無創(chuàng)性技術該技術在給予體內成像劑之 后，產生受試者內部的全部或部分的圖像。本發(fā)明的“警試者(患者)”優(yōu)詵是哺乳動物,最優(yōu)詵是完整的哺乳動物機體體內。 在一個特別優(yōu)選的實施方案中，受試者是人，尤其是疑似患有或易患遲發(fā)性抑郁癥的人。術 語“―”是指受試者完全因為遺傳因素而具有發(fā)展疾病狀態(tài)的易感性；按照一般的說法是 “天然”而非“后天(nurture)，，的。“遲發(fā)件抑郁癥”是指首發(fā)于60歲以及以上人群的重性抑郁障礙。術語“重件抑郁 MH”是指涉及任何下列癥狀的心境障礙持續(xù)悲傷、焦慮或“空虛”感；絕望感或悲觀感； 負罪感、無價值感或無助感；對曾經享受的嗜好和活動(包括性)喪失興趣或愉悅、活力下 降，疲勞，“慢下來”，難以集中注意力、回憶或做決定，失眠、過早覺醒或嗜睡，食欲和/或體 重減輕或者過度飽食和體重增加，想死或自殺或有自殺企圖，煩躁或易激怒，或者對治療無 反應的持續(xù)的身體癥狀，例如頭痛、消化失調和慢性疼痛?！袄L乏”體內成像劑優(yōu)選通過胃腸外進行，最優(yōu)選通過靜脈內進行。靜脈內途徑代 表向所述受試者全身遞送體內成像劑的最有效方式。本發(fā)明的體內成像劑優(yōu)選以藥用組合 物形式來給予，所述組合物包會體內成像劑以及生物相容性載體?！吧锵嗳菪暂d體”是流 體，尤其是液體，其中懸浮或溶解了體內成像劑，使組合物是生理上可耐受的，即可給予哺 乳動物體內而沒有毒性或過度不適感。生物相容性載體介質適宜是注射用載體液，例如無 菌的、無熱原的注射用水；水溶液，例如鹽水(其可最好是經過平衡的，使注射用終產物是 等滲或不是低滲的)；一種或多種以下物質的水溶液張力調節(jié)劑(例如血漿陽離子與生物 相容性抗衡離子的鹽)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨醇或甘露醇)、二醇(例 如甘油)或其它非離子型多元醇物質(例如聚乙二醇、丙二醇等)。生物相容性載體介質也 可包括生物相容性有機溶劑，例如乙醇。這些有機溶劑可用于溶解更親脂的化合物或制劑。 優(yōu)選，生物相容性載體介質是無熱原的注射用水、等滲鹽水或乙醇水溶液。供靜脈內注射用 生物相容性載體介質的PH的合適范圍是4. 0-10. 5。體內成像劑所包含的“化合物”可以是生物分子、小分子、適體、反義mRNA、小干擾 RNA或抗體。術語“牛物分子”包括例如以下分子如脂質、核苷酸、多核苷酸、氨基酸、肽、多 肽、蛋白質、碳水化合物和無機分子。術語“小分子”是指分子量介于100-1000道爾頓之間 的有機化合物。術語“抗體”是指由免疫系統(tǒng)細胞產牛的蛋白質或是指其與抗原結合的片 段。術語“反義mRNA”是指與正常加工為mRNA并翻譯的鏈互補、或與其區(qū)域互補的RNA分 子。術語“適體”是指人工核酸結合齊U (參見例如Ellington和Szostak(1990)Nature346 818-822)。術語“小干擾RNA”是指誘導序列特異性轉錄后基因沉默的雙鏈RNA (參見例如 Elbashir等(2001)Genes Dev. 15 188-200)。優(yōu)選，體內成像劑所包含的化合物是小分子 或生物分子，最優(yōu)選小分子。適用于腦組織成像的體內成像劑的具體特征在以下有更詳細 討論。術語“選擇性締合”是指體內成像劑與目標靶標的結合，所述目標靶標即由GABA能受體基因優(yōu)先于其它組織而編碼的多核苷酸或多肽，以便有利于通過本發(fā)明的方法來鑒 別靶組織和非靶組織?？刹捎媒Y合測定，例如下述涉及本發(fā)明篩選方法的那些測定，來測定 體內成像劑與目標靶標的結合。術語“^MSM”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合 物。具體的核酸序列也包括其保守修飾的變體，例如簡并密碼子取代、等位基因、直向同源 物、單核苷酸多態(tài)性和互補序列以及明確指出的序列。具體地講，可通過產生一個或多個 所選(或所有)密碼子的第三位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列，達到簡并密 碼子取代(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19 5081 (1991) ；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 2605-2608(1985) ；Rossolini 等，Mol. Cell. Probes8 :91_98 (1994))。術語“核酸”可用于 指基因、互補脫氧核糖核酸(cDNA)和由基因編碼的信使核糖核酸(mRNA)。術語“^li”是指氨基酸殘基的聚合物。該術語用于這樣的氨基酸聚合物其中一 個或多個氨基酸殘基是相應天然存在的氨基酸的人工化學模擬物；以及用于天然存在的氨 基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本文所用的該術語包括任何長度的氨基酸鏈， 包括全長蛋白質，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。術語“氨某酸”是指天然存在的和合 成的氨基酸、以及氨基酸類似物和氨基酸模擬物，后者以類似于天然存在的氨基酸的方式 起作用。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼所編碼的那些，以及后期被修飾的那些氨基酸，例 如羥脯氨酸、y-羧基谷氨酸鹽和0-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨 基酸相同的基本化學結構(即α-碳與氫、羧基、氨基和R基結合)的化合物，例如高絲氨 酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫 氨酸甲基锍。這些類似物具有修飾的R基(例如正亮氨 酸)或修飾的肽主鏈，但仍保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學結構。氨基酸在本文 中可以用公知的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所推薦的單字母符號來表示。當多核苷酸是由基因“編遇”時，這是指該基因包含以下所需的信息⑴通過復 制獲得脫氧核糖核酸(DNA)互補鏈，或(ii)通過轉錄獲得mRNA。也包括從mRNA逆轉錄 到cDNA。當多肽是由基因“編碼”時,這是指該基因包含以下所需信息(i)通過轉錄獲得 mRNAdn (ii)通過翻譯從所述mRNA獲得所述多肽。術語“復制”、“轉錄”和“翻譯”采用它 們在本發(fā)明領域中所接受的含義。也就是說，復制是DNA拷貝成DNA的過程，轉錄是DNA拷 貝成mRNA的過程，而翻譯則是當mRNA的信息用作蛋白質合成的模板時。“GABA能受體”是與Y-氨基丁酸(GABA)結合的受體。因此，“GABA能受體基 里”是編碼一部分GAGA能受體的基因。優(yōu)選，所述GABA能受體基因是編碼以下受體的 基因GABAa受體亞單位CI1(GABRAI) ；GABAa受體亞單位a4(GABRA4) ；GABAa受體亞單位 a 5 (GABRA5) ；GABAa 受體亞單位 β 3 (GABRB3) ；GABAa 受體亞單位 Y (GABRGl)，GABAa 受體亞 單位 y2(GABRG2) ；GABAa 受體亞單位 P1(GABRRl) ；GABAa 受體亞單位 δ (GABRD) ；GABAb 受 體2(GABBR2)；或者，甘氨酸受體β (GLRB)。術語“基因”是指渉及產牛多肽鏈的DNA區(qū)段；它包括前導區(qū)和隨后的編碼區(qū)(前 導區(qū)和拖曳區(qū))以及介于各編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內含子)。僅有少數例 夕卜，體內每個細胞都含有一整套染色體和相同的基因。然而，這些基因僅有一部分開啟，正 是這些的亞類給每種細胞類型賦予獨特性質?！盎虮磉_”是這樣的術語它用于描 述DNA內所含信息(儲存的遺傳信息)轉錄成為信使RNA (mRNA)分子，然后再翻譯為蛋白質而行使大部分關鍵性的細胞功能。細胞所產生的mRNA的種類和數量反映了哪些基因被 表達，這又提供了細胞對其改變的需求是如何反應的相關信息。基因表達是一種高度復雜 并受到嚴格控制的過程，允許細胞對環(huán)境刺激和其自身變化需求產生動態(tài)反應。該機制起 到開/關轉換作用，以控制在細胞中哪些基因被表達以及體量控制，即如有必要，增加或降 低特定基因的表達水平。“體內成像部分”是在將其給予所述受試者之后，可在該受試者機體外部檢測的任 何物質。體內成像部分的存在提供了所成像的組織中多肽或多核苷酸數量的檢測指標。術 語“用體內成像部分來標記，，是指體內成像部分可以是化合物的組成部分，或者可以是與化 合物綴合的單獨實體。當體內成像部分與化合物綴合時，任選的接頭部分將載體和體內成 像部分連 接在一起。在給予步驟之后和檢測步驟之前，允許體內成像劑與所述多核苷酸和/或所述多 肽選擇性締合。例如，當受試者是完整哺乳動物時，體內成像劑將會在哺乳動物體內動態(tài)移 動，與其中的不同組織接觸。一旦體內成像劑接觸表達所述多核苷酸和/或所述多肽的組 織時，就會發(fā)生特異性相互作用，使體內成像劑從所述組織中清除比從其它組織中清除需 要更長時間，因此確保產生代表特異性締合的體內成像劑的圖像。術語“_”用于描述締合在一起，以行使特定生物學功能的細胞集合。本發(fā)明受 試者的基本組織類型是上皮組織、神經組織、結締組織、肌肉組織和脈管組織。本發(fā)明體內 成像方法上下文中優(yōu)選的組織是腦組織。通過所述體內成像部分的存在，來保證與所述受試者的所述多核苷酸或多肽選擇 性締合的體內成像劑水平的“·”步驟。合適的體內成像技術是這樣的技術該技術可檢 測由所述體內成像部分發(fā)射的信號，并產生表示所述受試者所述組織中存在的體內成像部 分的位置和/或數量的數據。例如，SPECT可用作體內成像部分發(fā)射γ射線的檢測技術。本發(fā)明體內成像方法上下文中優(yōu)選的腦組織位于前扣帶和伏隔核中。這兩個腦 區(qū)都與抑郁癥的臨床癥狀相關，并且在本文被證明與遲發(fā)性抑郁癥中改變的GABA能基因 的表達有關。當成像的腦組織是在前扣帶中時，優(yōu)選的GABA能受體基因是GABBR2、GABRG1 或GABRRl的編碼基因，最優(yōu)選的是GABBR2或GABRRl的編碼基因。當成像的腦組織是在伏 隔核中時，優(yōu)選的GABA能受體基因是GABRA4、GABRB3或GABRG2的編碼基因，最優(yōu)選的是 GABRB3的編碼基因。具體的需求要求體內成像劑適用于成像腦組織。與身體的其它部分相比，在腦中， 內皮細胞通過“緊密連接(tight junction)”的方式更緊密地包裹在一起，所述緊密連接是 形成相鄰上皮細胞間的密封，阻止大部分溶解分子從上皮層的一側跨越到另一側的多功能 復合物。這個所謂的血腦屏障(BBB)阻止所有分子運動，除了通過脂溶性方式跨越細胞膜 的那些分子(例如氧氣、二氧化碳、乙醇和留體激素)和通過特殊轉運系統(tǒng)而允許的那些分 子(例如糖和某些氨基酸)之外。分子量大于500道爾頓的物質通常不能通過被動擴散方 式跨越BBB，而較小分子通常是可以的。除了緊密連接的作用阻止了在內皮細胞間的轉運之 夕卜，還有兩種機制可阻止被動擴散。在腦內圍繞毛細血管的神經膠質細胞是親水性分子的 第二屏障，而且腦內的低濃度間隙蛋白也能阻止親水性分子通過。 通過測定辛醇_水的分配系數(P)，通?？稍u價脂溶性，通常表示為IoglO值，在本 文中稱為“l(fā)ogP”。辛醇-水的分配系數表示物質在有機相與水相之間的分布。IogP提供了測定化合物的 親脂性或親水性的簡單方式。比例定義為分配=[辛醇中存在的化合物]/[水中存在的化合物]該等式可表示為Log分配=Iogltl[辛醇中存在的化合物]/[水中存在的化合物]簡而言之，IogP計算的正數越大，化合物親脂性就越大。對于潛在的新型藥用化 合物而言，通常求出IogP的計算值，因為它提供了化合物在給予后在體內將會怎樣分配到 各區(qū)室(compartmentalised)的相關知識。適用于本發(fā)明的體內成像劑的IogP范圍為1. 0-4. 5，優(yōu)選范圍為1. 0-3. 5，最優(yōu)選 范圍為2. 0-3. 5。在體外和體內評價之前，可以先獲取估計IogP值(AlogP98)，例如使用DS MedChem Explorer軟件(Accelerys)。除了有利于CNS穿透之外，該范圍內的親脂性還允許 體內成像的快速清除，這在放射性鹵素是相對短壽命的放射性同位素例如18F時特別重要?？赏ㄟ^使用Accelerys DS MedChem Explorer軟件，與文獻比較體內腦穿透數據， 用計算機(in silico)評價特定體內成像劑的BBB穿透特性?！發(fā)ogBbR”是[腦濃度]/[血 濃度]的log1(l。用于本發(fā)明方法的體內成像劑的IogBbR的合適范圍為0.0-1.0，優(yōu)選范圍 為0. 3-1. 0，最優(yōu)選范圍為0. 5-0. 7。用于本發(fā)明體內成像方法的優(yōu)選的體內成像部分選自(i)放射性金屬離子；(ii)順磁性金屬離子；(iii)發(fā)射、射線的放射性鹵素；(iv)發(fā)射正電子的放射性非金屬；和，(ν)超極化NMR-活性核。當體內成像部分是放射性金屬離子即射電金屬時，合適的射電金屬可以是正電子 發(fā)射體，例如64Cu、48V、52Fe、55C0、94mTc或68Ga;或者 Y -發(fā)射體，例如99mTC、mIn、113mIn或67Ga。 優(yōu)選的射電金屬是99mTc、64CU、68Ga和mIn。最優(yōu)選的射電金屬是Y _發(fā)射體，尤其是99mTc。當體內成像部分是順磁性金屬離子時，合適的這類金屬離子包括Gd(III)、 Mn (II)、Cu (II)、Cr (III)、Fe (III)、Co (II)、Er (II)、Ni (II)、Eu (III)或 Dy(III)。優(yōu)選的 順磁性金屬離子是Gd(III)、Mn (II)和Fe (III)，尤其優(yōu)選Gd (III)。當體內成像部分是發(fā)射Y射線的放射性鹵素時，放射性鹵素適宜選自1231、1311或 77Br。125I雖然在本文所述的體外篩選方法適用于作為可檢測標記，但不適用于作為體內成 像部分。優(yōu)選的發(fā)射Y射線的放射性鹵素是1231。當體內成像部分是發(fā)射正電子的放射性非金屬時，合適的這類正電子發(fā)射體包 括=Hd15CK17FJ8FJ5BiN76Br或124L優(yōu)選的發(fā)射正電子的放射性非金屬是"C、13N、18F和 124I，尤其是11C和18F,最尤其是18F。當體內成像部分是超極化NMR-活性核時，這類NMR-活性核具有非零核自旋，包括 13C、15N、19F、29Si和31P。這其中，優(yōu)選13C。術語“超極化”是指NMR-活性核的極化度增強，超 出了它的飽和極化(equilibrium polarisation) 0 13C的天然豐度(相對于12C)約為1%, 在超極化之前，合適的13C標記的化合物可適當地富集到至少5%的豐度，優(yōu)選至少50%，最 優(yōu)選至少90%。本發(fā)明體內成像劑的至少一個碳原子適宜富集13C,然后再超極化。
本發(fā)明優(yōu)選的體內成像部分是在以無創(chuàng)性方式體內給予之后，能夠在外部檢測的那些，例如通過SPECT、PET和MRI。體內成像用的最優(yōu)選的體內成像部分是放射性的，尤其 是放射性金屬離子、發(fā)射Y射線的放射性鹵素和發(fā)射正電子的放射性非金屬，尤其是那些 適合用SPECT或PET來成像的那些。本發(fā)明優(yōu)選的體內成像劑在體內不容易進行代謝，因此最優(yōu)選在人體內的半衰期 為60-240分鐘。體內成像劑優(yōu)選通過腎臟排泄(即表現出尿排泄)。體內成像劑在患病病 灶處的優(yōu)選信號-背景比至少為1. 5，最優(yōu)選至少為5，尤其優(yōu)選至少為10。當體內成像劑 包含放射性同位素時，體內成像劑(其是非特異性結合或在體內游離)峰水平的一半的清 除，優(yōu)選發(fā)生的時間周期小于等于體內成像部分的放射性同位素的放射性衰變半衰期。此外，體內成像劑的分子量適宜至多為5000道爾頓。優(yōu)選，分子量范圍為 100-3000道爾頓，最優(yōu)選為200-1000道爾頓。此外，和如上所述，對于適用于腦組織成像的 體內成像劑而言，需要體內成像劑的分子量小于500道爾頓。體內成像劑的尤其優(yōu)選的分 子量范圍因此為200-500道爾頓。當體內成像劑包含多肽和體內成像部分時，體內成像部分通過多肽的N-端或 C-端、或者通過任何氨基酸側鏈來綴合。優(yōu)選，體內成像部分通過N-端或C-端與多肽綴 合，任選通過接頭，例如聚乙二醇接頭?；蛘?，體內成像劑的官能團可包含體內成像部分。當官能團包含體內成像部分時， 這表明體內成像部分構成體內成像劑的部分化學結構。例如，體內成像部分可以是其水平 顯著超過所述同位素天然豐度水平的放射性同位素。同位素的這類升高或富集水平適宜為 所述同位素天然豐度水平的至少5倍，優(yōu)選至少10倍，最優(yōu)選至少20倍，和理想的是至少 50倍；或以這樣的水平存在其中所述同位素富集水平為90-100%。這類官能團的實例包 括具有升高水平的123I的碘代苯基，具有升高水平的11C的CH3基團，和具有升高水平的18F 的氟代烷基，使得成像部分是在化學結構內的同位素標記的11C原子或18F原子?？墒褂帽景l(fā)明的篩選方法，鑒定并獲取與由GABA能受體基因所編碼的多核苷 酸或多肽選擇性締合的化合物，所述方法在下文有更詳細描述。當所述篩選方法是結合 測定時，需要化合物與目標靶標的結合具有納摩爾濃度的效力，即其解離常數(Kd)介于 0. Ol-IOOnM之間，優(yōu)選介于0. Ol-IOnM之間，和最優(yōu)選介于0. 01-1. OnM之間。可便利地通 過使前體化合物與合適來源的所需體內成像部分反應，進行這樣的化合物標記，以提供體 內成像劑?！扒绑w化合物，，包括成像劑的未標記衍牛物,其經設計使得與體內成像部分的便 利化學形式的化學反應以位點特異性方式發(fā)生；可以在最少數量的步驟中進行(理想的是 單個步驟)；和無需顯著的純化(理想的是無需進一步純化)，以得到所需的體內成像劑。 這類前體化合物是合成的，并可便利地以良好的化學純度而獲取。前體化合物可任選包含 保護基團，用于保護前體化合物的某些官能團。術語“保護基團”導指這樣的基團所述基團可抑制或阻止不想要的化學反應，但 其經設計具有足夠的反應性，使其可在不改變分子的其它部分的足夠溫和的條件下，從所 述官能團上裂解下來。脫保護后，就得到所需體內成像劑。保護基團是本領域技術人員眾所 周知的并適宜選自對于胺基，Boc (其中Boc是叔丁氧基羰基)、Fmoc (其中Fmoc是芴基甲 氧基羰基)、三氟乙?；?、烯丙氧基羰基、Dde [即1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亞環(huán)己基)乙 基]或Npys (即3-硝基-2-吡啶亞磺?；?；和對于羧基，甲酯、叔丁酯或芐酯。對于羥基，合適的保護基團是甲基、乙基或叔丁基；烷氧基甲基或烷氧基乙基；芐基；乙?；槐郊柞?基；三苯甲基(Trt)或三烷基甲硅烷基，例如四丁基二甲基甲硅烷基。對于巰基，合適的保 護基團是三苯甲基和4-甲氧基芐基。其它保護基團的使用描述于‘Protective Groups in Organic Synthesis', Theorodora W. Greene 禾口 Peter G. M. Wuts,(第 3 版，John Wiley & Sons，1999)。當體內成像部分是金屬離子(例如用于SPECT的99mTc或用于MRI的Gd(III)) 時，體內成像劑優(yōu)選包含放射性金屬離子與合成配體的金屬絡合物。術語“金屬絡合物” 是指金屬離子與一個或多個配體的配位絡合物。強烈優(yōu)詵金屬絡合物是“杭轉移盩合 (transchelation)，，的，即不容易與其它可能的競爭性配體對金屬配位位置進行配體交換。 可能的競爭性配體包括在體外制備中的其它賦形劑(例如用于制備的輻射防護劑或抗微 生物防腐劑)，或體內的內源化合物(例如谷胱甘肽、轉鐵蛋白或血漿蛋白)。術語“僉成” 具有其常規(guī)含義，即人造的，與從天然來源例如從哺乳動物體內分離的相反。這類化合物具 有這樣的優(yōu)勢它們的制備和雜質分布可以完全控制。可用于本發(fā)明的形成抗轉移螯合的金屬絡合物的合適配體包括螯合劑，其中 2-6個、優(yōu)選2-4個金屬供體原子是這樣排列的使得5元或6元螯合環(huán)產生(通過具有連 接碳原子或非配位雜原子的金屬供體原子的非配位主鏈)；或包含與金屬離子強烈結合的 供體原子的單齒配位體，例如異腈類、膦類或二氮烯化物(diazenides)。可與金屬良好結 合成為螯合劑組成部分的供體原子類型的實例是胺、硫醇、酰胺、肟和膦。膦形成這類強 金屬絡合物，甚至單齒或二齒膦都形成合適的金屬絡合物。異腈和二氮烯化物的線性幾何 構型使它們自身不容易結合到螯合劑中，因此通常用作單齒配位體。合適的異腈的實例包 括簡單的烷基異腈例如叔丁基異腈，以及醚取代的異腈例如MIBI (即1-異氰基-2-甲氧 基-2-甲基丙烷)。合適的膦類的實例包括替曲膦和單齒膦類例如三(3-甲氧基丙基)膦。 合適的二氮烯化物的實例包括HYNIC系列配體，即胼取代的吡啶或煙酰胺。上述配體特別適合于絡合锝例如94mTc或99mTc,更充分的描述可參見Jurisson等 [Chem. Rev. ,99, 2205-2218 (1999) ] 0配體也可用于其它金屬，例如銅(64Cu或67Cu)、釩(例 如48V)、鐵(例如52Fe)或鈷(例如55Co)。其它合適的配體描述于Sandoz WO 91/01144，其包括特別適于銦、釔和釓的配體， 尤其是大環(huán)氨基羧酸酯配體和氨基膦酸配體。形成釓的非離子型(即中性)金屬絡合物的 配體是已知的并描述于US4885363。對于釓，特別優(yōu)選的是包括以下物質的螯合物DTPA、 乙二胺四乙酸(EDTA)、三亞乙基四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷_1，4，7， 10-四乙酸(DOTA)、10- (2-羥基丙基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷_1，4，7-三乙酸(D03A) 和這些物質的衍生物。當體內成像部分是放射性鹵素時，優(yōu)選的前體化合物是包含經歷親電或親核的放 射性鹵化或者經歷與帶標記的醛或酮的縮合的衍生物的那些。第一類的實例是(a)有機金屬衍生物例如三烷基錫烷(例如三甲基甲錫烷基或三丁基甲錫烷基) 或三烷基硅烷(例如三甲基甲硅烷基)，或有機硼化合物(例如硼酸酯(boronate ester) 或有機三氟硼酸酉旨(organotrifluoroborate))；(b)用于鹵素交換的非放射性烷基溴或者用于親核碘化反應的對甲苯磺酸烷基 酯、甲磺酸烷基酯或三氟甲磺酸烷基酯；
(c)向親核碘化活化的芳環(huán)(例如芳基碘鋝〗鹽芳基重氮物、芳基三烷基銨鹽或硝 基芳基衍生物)。前體優(yōu)選包括非放射性鹵原子，例如芳基碘或芳基溴(以允許放射性鹵素交 換)；有機金屬前體化合物(例如三烷基錫、三烷基甲硅烷基或有機硼化合物)；或有機前 體，例如三氮烯或用于親和取代的良好離去基團例如碘每 1鹽。對于放射性碘化，優(yōu)選的前體 包括有機金屬前體化合物，最優(yōu)選三烷基錫。前體和將放射性碘導入有機分子中的方法描述于Bolton [J. Lab. Comp. Radiopharm. ,45,485-528 (2002)]。合適的硼酸酯有機硼化合物和它們的制備方法描述于 Kabalka 等[Nucl. Med. Biol. ,29,841-843(2002)和巡，369-373 (2003)]。合適的有機三氟 硼酸酯和它們的制備方法描述于Kabalka等[Nucl. Med. Biol. ,31,935-938 (2004) ] 0可采用18F-氟化物與具有良好離去基團(例如烷基溴、烷基甲磺酸酯基或烷基甲 苯磺酸酯基)的前體中的合適化學基團進行反應，通過直接標記，進行放射性氟化反應。也 可通過N-鹵代乙?；c18F(CH2)3OH反應物的烷基化反應，產生-NH(CO)CH2O(CH2)318F衍生 物，來將18F導入。對于芳基系統(tǒng)，從芳基重氮鹽、芳基硝基化合物或芳基季銨鹽的18F-氟化 物親核置換是產生芳基-18F衍生物的合適途徑。18F標記的體內成像劑可通過如下方式獲得形成18F氟代二烷基胺，隨后當18F氟 代二烷基胺與含有例如氯、P(O)Ph3或活化酯的前體反應時形成酰胺。更多的放射性氟化方 法，尤其是適用于肽的放射性氟化方法，描述于WO 03/080544(其使用巰基偶聯(lián))和描述于 W004/080492 (其使用氨基氧基偶聯(lián))。18F標記衍生物合成途徑的更多細節(jié)描述于Bolton， J. Lab. Comp. Radiopharm.，45，485-528 (2002)。本發(fā)明方法的體內成像劑可通過試劑盒而容易地獲取。這樣的試劑盒包括合適的 前體化合物，優(yōu)選呈無菌無熱原形式，使得與無菌來源的體內成像部分的反應使用最少數 量的操作就產生所需的體內成像劑。這類考慮在放射性體內成像劑的情況下特別重要，尤 其是當放射性同位素具有相對短的半衰期時，可便于操作并因此降低對放射性藥物學家的
輻射劑量。重建這類試劑盒的反應介質優(yōu)選是生物相容性載體，如本文先前所定義，從而得 到包含所述體內成像劑的藥用組合物。在本發(fā)明的體內成像方法中，檢測步驟之后是產生圖像的步驟，該圖像表示由體 內成像部分所發(fā)射的信號。本發(fā)明方法中的這個產生步驟通過計算機來進行，計算機將重 建算法用于所獲取的信號數據以得到數據集。然后處理該數據集，產生顯示受試者體內目 標區(qū)域的圖像。這些圖像提供可用于遲發(fā)性抑郁癥的診斷方法的信息。診斷方法另一方面，本發(fā)明提供上述關于體內成像方法所定義的體內成像劑，用于遲發(fā)性 抑郁癥的診斷方法。此外，本發(fā)明提供用于診斷遲發(fā)性抑郁癥的方法，所述方法包括(a)如上定義的體內成像方法；和，(b)將步驟(a)所產生的圖像與體內圖像比較，該體內圖像表示當在非抑郁受試 者中進行所述體內成像方法時，所述體內成像劑的攝取模式(pattern of uptake) 0診斷方法的組織和受試者的合適和優(yōu)選的實施方案的定義同上述體內成像方法。
代表非抑郁受試者的圖像中，本文所述多肽或多核苷酸的水平變化(向上或向 下)表明，該受試者患有遲發(fā)性抑郁癥或處于發(fā)展遲發(fā)性抑郁癥的至少某些方面的危險 中。當在非抑郁受試者中進行所述體內成像方法時，通過以下方法得到代表所述體內 成像劑的攝取的圖像在非抑郁受試者的適當匹配組上進行如上定義的體內成像方法，并 且產生代表所有得到的圖像的平均水平的圖像。治療方法可將調節(jié)GABA能受體活性的化合物給予受試者，用于治療遲發(fā)性抑郁癥。因此， 本發(fā)明提供用于治療遲發(fā)性抑郁癥患者的方法，所述方法包括給予藥用組合物，所述藥用 組合物包含(a)藥物有效量的通過與多核苷酸或多肽選擇性締合而調節(jié)GABA能受體活性的 化合物，所述多核苷酸或多肽由GABA能受體基因所編碼，所述GABA能受體基因是上述有關 本發(fā)明體內成像方法所定義的優(yōu)選的GABA能受體基因；和，(b)生物相容性載體。生物相容性載體是廣泛的，如本說明書先前所定義。所選的具體生物相容性載體 部分是由有待給予的具體藥用組合物、以及用于給予組合物的具體方法而決定的。因此，有 各種各樣的合適藥用組合物制劑(參見例如Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 17版.1985))。適于給藥的制劑包括水和非水溶液、等滲無菌溶液，它們可含有抗氧化劑、 緩沖劑、抑菌劑和賦予制劑等滲性的溶質；以及水和非水無菌混懸劑，其可包含懸浮劑、增 溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。用于治療的給藥可通過使藥物化合物接觸有待治療的組織的任何常用途徑來進 行，這是本領域技術人員眾所周知的。盡管多于一種途徑可用于給予特定組合物，但是一種 特定途徑通?？杀攘硪煌緩教峁└苯雍透行У姆磻Ｔ诒景l(fā)明的實踐中，藥用組合物 可通過例如以下方式給予口服、鼻內、局部、靜脈內、腹膜內或鞘內?？蓪⑺幱媒M合物裝入 單劑量或多劑量的密封容器例如安瓿和小瓶中?？蓮纳鲜龇N類的無菌粉末、顆粒和片來制 備溶液劑和混懸劑。藥用組合物也可作為預制食物或藥物的一部分來給予?；衔锏摹八{ 物有效量”是在一段時間內在警試者中足以起到有益反應的劑量。任何患者的最佳劑量水 平將會因各種各樣的因素(包括所用的特異性調節(jié)劑的功效、患者的年齡、體重、身體活動 和膳食)的不同而異，也取決于與其它藥物的可能組合并取決于精神障礙的嚴重程度。劑 量大小也可由伴隨將特定藥用組合物給予特定受試者的任何不良副作用的存在、特性和程 度來決定。在確定有待給予的藥用組合物的有效量時，醫(yī)生可評價藥用組合物的循環(huán)血漿水 平、藥用組合物毒性和抗藥用組合物抗體的產生。一般而言，對于典型受試者，化合物的劑 量當量為約lng/kg至10mg/kg。為了給予，藥用組合物可以按照化合物的LD-50所決定的 速率和化合物在不同濃度時的副作用來給予，當用于群體(mass)和總體健康的受試者時。術語“調節(jié)GABA能警體活件”是指化合物對所述GABA能受體具有效應，其作用是 使所述受體的活性接近于在非抑郁受試者中所觀察到的活性。此外，上述關于本發(fā)明體內成像方法所定義的體內成像劑可用于決定是否實施如 上定義的治療方法的方法，所述決定方法包括
(a)如本文中定義的體內成像方法；和，(b)評價步驟(a)的體內成像方法所產生的圖像，以決定是否實施所述治療方法。篩詵方法另一方面，本發(fā)明提供鑒定與多核苷酸或多肽選擇性締合的化合物的篩選方法， 所述方法包括(i)使所述化合物與多肽或多核苷酸接觸，所述多核苷酸或多肽是由GABA能受體 基因所編碼的；和，(ii)測定所述化合物對所述多肽或所述多核苷酸的效應；其中所述GABA能受體基因是上述本發(fā)明體內成像方法所定義的基因，優(yōu)選編碼 GABA能受體的基因，所述GABA能受體選自=GABAa受體亞單位α工(GABRAl) ；GABAa受體亞單 位 a4(GABRA4) ；GABAa 受體亞單位 a5(GABRA5) ；GABAa 受體亞單位 33(GABRB3) ；GABAa 受體 亞單位 γ Jgabrgi^gabaa 受體亞單位 y2(gabrg2) ；gabaa 受體亞單位 P1(Gabrri) ；gabaa 受體亞單位δ (GABRD) ；GABAb受體2 (GABBR2)；或者，甘氨酸受體β (GLRB)?？捎糜谥委?、預防或診斷遲發(fā)件抑郁癥的“化合物”可以是牛物分子、小分子、話 體、反義mRNA、小干擾RNA或抗體。術語“牛物分子”、“小分子”、“抗體”、“反義mRNA”、“適 體”、“小干擾RNA”采用本說明書早前所提供的含義。按照其最廣泛含義，所述化合物與多肽或多核苷酸的“_”步驟是指使所述化合 物與所述多肽或多核苷酸彼此進行物理接觸。這可在體外或體內完成，更多細節(jié)如下所述?！癷i^lim^”是所述化合物與所述多核苷酸或所述多肽之間的任何特異性相 互作用。這樣的特異性相互作用包括所述化合物與所述多核苷酸或所述多肽的特異性結 合，并包括由所述化合物誘導的對所述多核苷酸或多肽的表達水平或活性的任何調節(jié)?；衔镄牟襟E可通過本領域眾所周知的方法來進行。這種眾所周知 的篩選方法的一個實例是，在測定步驟中所測的效應是所述化合物與所述多肽或多核苷酸 的結合。這樣的結合測定優(yōu)選涉及本文所述的分離的多肽或多核苷酸與一種或多種化合 物接觸，并允許有足夠時間讓多肽或多核苷酸與化合物形成結合復合物。術語“分離”是 指從其它細胞組分中分離出來，并且也可包括合成的多核苷酸和多肽?？梢允褂枚喾N已 建立的分析技術中的任一種來檢測所形成的任何結合復合物。蛋白質結合測定包括但不 限于測定共沉淀的方法、在非變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠上測定共遷移的方法和基于蛋白 質印跡測定共遷移的方法(參見例如Bennet和Yamamura，(1985) "Neurotransmitter, Hormone or Drug Receptor Binding Methods (神經遞質、激素或藥物受體的結合方法)” 載于 Neurotransmitter Receptor Binding (Yamamura, H. I.等編著，第 61-89 頁)。用于 這類測定的蛋白質可以是天然表達的、克隆的或合成的。結合測定也可用于例如鑒定與多 肽相互作用的內源蛋白。例如，在結合測定中可鑒定與多肽結合的抗體、受體或其它分子。 在許多情況下，在結合測定中的至少一種反應物包含可檢測標記。在該上下文中的術語“反 應物”包括化合物、多肽、多核苷酸或用于特異性檢測它們的任何抗體?！翱蓹z測標記”可以 是具有可檢測理化性質的任何物質。因此，可檢測標記的存在提供了結合反應物數量的檢 測指標。根據所用的具體可檢測標記，合適的檢測技術用于測定選擇性結合的可檢測標記 的數量。適用于本發(fā)明篩選方法的可檢測標記包括通過光譜法、光化學法、生化法、免疫化 學法、電學方法、光學或化學方法在體外可檢測的那些，包括
⑴磁珠(例如Dynabeads )；(ii)熒光染料(例如異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅、羅丹明等)；(iii)放射性標記(例如 3H、125I、35S、14C 或 32P)；(iv)酶(例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和ELISA中常用的其它酶)；和，(ν)量熱標記，例如膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)珠。檢測這些可檢測標記的方式是本領域技術人員眾所周知的。因此，例如，當可檢測 標記是放射性標記時，是指用于包括閃爍計數器或如在放射自顯影術中的照相膠片在內的 檢測。當可檢測標記是熒光標記時，可通過用合適波長的光激發(fā)熒光染料并檢測所得熒光， 對其進行檢測?？蓪晒膺M行目測，通過照相膠片、通過使用電子檢測器例如電荷耦合器件 (CCD)或光電倍增管等。類似的，可通過提供酶的合適底物并檢測所得反應產物，來檢測酶 學可檢測標記。本發(fā)明的篩選方法也可優(yōu)選在體外進行，其中所述多肽或多核苷酸在細胞中表達 并使細胞與化合物接觸。這類方法通常涉及進行基于細胞的測定，其中使化合物與表達本 文所述的多肽或多核苷酸的一個或多個細胞接觸，然后檢測轉錄產物、翻譯產物表達的增 加或減少或者催化產物的增加或減少。本文所述的多核苷酸在細胞中的表達水平可測定如 下通過用與所述多核苷酸的轉錄物(或互補核酸)特異性雜交的化合物，來測定細胞中表 達的mRNA?？赏ㄟ^裂解細胞并進行RNA印跡或者不裂解細胞而用原位雜交技術，進行測定?？墒褂妹庖邔W方法對多肽進行測定，其中用化合物探測細胞裂解物，所述化合物 是與所述多肽特異性結合的抗體?？赏ㄟ^測定酶的產物的產生或通過測定底物的消耗，測定多肽的催化活性?；钚?是指催化速率或者多肽結合底物(Km)或釋放催化產物(Kd)的能力?？砂凑胀ㄓ蒙治鲞M行多肽的活性分析。這類測定包括基于細胞的測定以及涉 及純化或部分純化的多肽或粗制細胞裂解物的體外測定。測定通常涉及提供已知數量的底 物并以時間的函數定量產物。也可進行篩選方法，其中所述接觸步驟包括將所述化合物給予遲發(fā)性抑郁癥的動 物模型。所用的動物模型通常是任何種類的哺乳動物。優(yōu)選動物的具體實例包括但不限于 靈長類動物、小鼠和大鼠。在一個實施方案中，將抑郁癥(慢性和急性)的大鼠模型(其中 大鼠經歷應激)用于篩選。在一個實施方案中，可使用無脊椎動物模型例如果蠅模型，篩選 本文所公開的人類基因的果蠅直向同源物的調節(jié)劑。在另一個實施方案中，包括基因敲除 技術在內的轉基因動物技術(例如作為與合適的基因打靶載體同源重組的結果)，或基因 過量表達，將會導致多核苷酸或多肽表達的缺失、減少或增加。發(fā)現由這些方法所產生的轉 基因動物可用作精神障礙的動物模型，并可用于篩選精神障礙的調節(jié)劑?？赏ㄟ^同源重組，將標記基因或其它異源基因插入到小鼠基因組的內源基因位 點，制備敲除細胞和轉基因小鼠。也可通過用多核苷酸突變形式取代內源多核苷酸，或通過 例如暴露給致癌劑而使內源多核苷酸突變，制備這樣的小鼠。在一個優(yōu)選的實施方案中，在上述任何實施方案中所述的篩選方法涉及使所述化 合物與所述多肽接觸，并測定所述化合物對所述多肽的效應。用于本發(fā)明的方法
本文描述了對在遲發(fā)性抑郁癥患者腦組織中特異性差異表達的基因表達模式進 行的研究。與抑郁癥相關的大的癥狀譜反映出復雜的遺傳學基礎和這些受試者中復雜的基 因表達模式。此外，腦途徑或通路以及亞細胞途徑對于理解精神障礙的發(fā)展和診斷而言是 重要的。經選擇用于評價的腦區(qū)(前扣帶(cingulate) (AC)和伏隔核(nucleus accumbens) (NA))涉及抑郁癥的臨床癥狀。腦區(qū)中細胞結構的改變、關鍵性神經遞質或相關分子在腦區(qū) 的表達、以及腦區(qū)中的亞細胞途徑，都涉及到抑郁癥的發(fā)展。通過微陣列表達分析，獲取本發(fā)明所依據的數據。用于這類分析的陣列稱為“表達 芯片”。固定化DNA是從已知基因的mRNA逆轉錄而來的cDNA，而且至少在某些實驗中，與芯 片雜交的對照和樣品DNA分別是從正常和患病組織的mRNA逆轉錄而來的cDNA。如果一個 基因在某種疾病狀態(tài)中過量表達，則與對照cDNA相比有更多樣品cDNA與代表該表達基因 的點雜交。結果，該點發(fā)出的紅色熒光比綠色熒光的強度更大。一旦研究人員表征了涉及 多種疾病的多個基因的表達模式之后，就可使來自任何個體的患病組織的cDNA雜交，以確 定來自個體的基因的表達模式是否與已知疾病的表達模式匹配。如果是這樣，則可啟動適 用于該疾病的治療。微陣列方法的有用綜述可參見Nature Genetics，1999年1月增刊。與本發(fā)明最相 關的是Botwell的文章，在第25-32頁，其中描述了如何采用微陣列技術來獲取表達數據。 現在提供該技術的概述。DNA “ ΙΜΤ是將來自上千個不同基因的序列在固定位置上固定或連接的小的固 體支持物。支持物本身通常是顯微鏡載玻片，但也可以是硅片或尼龍膜。將DNA印刷、印漬 或甚至直接合成在支持物上。重要的是，微陣列中的基因序列以有序或固定方式連接在它 們的支持物上，因為陣列中各點的位置用于鑒定特定基因序列。各點本身可以是DNA、cDNA 或寡核苷酸。微陣列可由研究人員制備或來自市售，取決于例如可用的成本、時間和人力資 源的問題。Genechip 陣列是市售陣列，是使用結合了光版印刷和組合化學的技術而制備 的(www, affymetrix. com)。每個陣列上至多合成130萬個不同的寡核苷酸探針。每個寡核 苷酸位于陣列的特定區(qū)域，稱為探針室(probe cell)。每個探針室都含有成百上千個至數 百萬個給定寡核苷酸的拷貝。為了從mRNA得到cDNA，采用逆轉錄，這是DNA聚合酶(稱為逆轉錄酶)將單鏈核 糖核酸(RNA)轉錄成為雙鏈DNA的過程。通常，在該反應中，聚-T(胸苷)引物用作引物， 因為mRNA具有聚-A (腺苷)尾。輸入mRNA的質量是至關重要的，以獲得適用于微陣列分析的cDNA。尸體解剖采樣 中的RNA完整性可受到死亡前后(pre-mortem and post-mortem)事件的影響，也受到表達 水平與例如以下混淆因素之間相互關系的影響供體死亡年齡、死前低氧、瀕死事件和瀕死 期持續(xù)時間、腦pH、采樣前的死后時間間隔和RNA完整性(Stan等，2006 ；Brain Research ； 1123(1) :1-11)。因此，重要的是篩選RNA樣品，以選擇適用于微陣列分析的那些。在評價 RNA質量之前，對樣品可以進行簡單的pH測定，作為瀕死狀態(tài)的指標。然后，多種方法可用 于測定 RNA質量(Copois 等，2007 J Biotechnol ； 127 (4) :549_59)，其中之一就是 RNA 完整 性數(RIN，Agilent Technologies) 0使用在顯微制造的芯片上進行的電泳分離，分離RNA 樣品，然后通過激光誘導的熒光檢測來測定。生物分析儀軟件產生電泳圖譜和凝膠類圖像 并顯示出結果，例如樣品濃度和所謂的核糖體比(18S與28S核糖體條帶之比)。使用RIN軟件算法進行RNA完整性數據的標準化解釋，該算法允許基于從1到10的計數系統(tǒng)，對真 核的總核RNA(riboeukaryotic total RNA)進行分類，其中1是降解最多的分布類型，而10 是最完整的。DNA微陣列技術促進了對DNA序列信息的鑒定和分類，以及這些新基因的功能分 配。微陣列是通過利用給定mRNA分子與其來源的DNA模板特異性結合或雜交的能力而起 作用的。術語“M”是指互補的單鏈核酸結合或退火成一個雙鏈分子的過程。通過使用 含有多種DNA樣品的陣列，就可以通過測定與陣列上各位點結合的mRNA數量，而在單一實 驗中測定細胞內成百上千個基因的表達水平。借助于計算機，就可準確測定出結合在微陣 列各點上的mRNA數量，產生細胞中基因表達的分布圖。W^tlSI^^W—MtiisTi jssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of Hybridization and the strategy of nucleic acid assays (雜交原則禾口核酸測定策略的 綜述)，，(1993)。通常，選擇嚴格性條件是在指定離子強度、pH下，比特定序列的熱解鏈溫 度(Tm)低約5-10°C。Tm是(在指定離子強度、pH和核濃度下)在平衡時，50%探針與靶 標雜交形成靶序列的溫度(當靶序列過量存在時，在Tm下，在平衡時有50%探針被占據)。 “嚴格件”條件將是以下哪㈣條件其中鹽濃度小于約1. OM鈉離子，通常約0. 01-1. OM鈉離 子濃度(或其它10種鹽)，在pH 7.0-8. 3，溫度至少約為30°C (對于短探針，例如10-50個 核苷酸)和至少約為60°C (對于長探針，例如大于50個核苷酸)。嚴格性條件也可通過加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺而達到。對于選擇性或特異性雜 交，陽性信號至少是背景的2倍，任選是背景雜交的10倍。示例性的嚴格性雜交條件可以 如下50%甲酰胺、5X SSC和SDS，在42°C孵育，或5X SSC、1 % SDS，在65°C孵育，并在 0. 2XSSC和0. 1 % SDS中在65°C洗滌。這樣的洗滌可以進行5、15、30、60、120分鐘或更長時 間。在嚴格性條件下彼此不雜交的核酸仍然是基本相同的，如果它們所編碼的多肽基 本相同時。這發(fā)生在例如當使用遺傳密碼所能允許的最大密碼子簡并而產生核酸拷貝時。 在這類情況下，核酸通常在適度的嚴格性雜交條件下雜交。示例性的“適度的嚴格性雜交條 件”包括在40%甲酰胺、IM NaClU % SDS的緩沖液中，在37°C雜交，并在IXSSC中在45°C洗 滌。這樣的洗滌可以進行5、15、30、60、120分鐘或更長時間。陽性雜交至少是背景的2倍。 普通技術人員將會容易地理解，可使用替代性雜交和洗滌條件以提供類似的嚴格性條件。雜交步驟完成之后，將微陣列放入由一些激光器、專用顯微鏡和照相機組成的“閱 讀器”或“掃描儀”中。實例包括 Packard BioChip 成像器、Molecular Dynamics Avalanche 和Genetic Microsystems GMS 418陣列掃描儀。熒光標簽受到激光器的激發(fā)，顯微鏡和 照相機共同工作而產生數字化陣列圖像。典型的微陣列實驗產生上千個數據點，這表明需 要用于存儲和處理數據的成熟技術。所使用的工具可包括對來自閱讀器的數據進行圖像 分析的軟件，存儲和鏈接信息的數據庫，以及將單個克隆(clone)的數據與網絡數據庫例 如GenBank鏈接的軟件。GenBank序列數據庫是開放性入口，是所有公眾可得的核苷酸序 列和它們的蛋白質翻譯的注釋集合(http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/sites/entrez ？ db =核苷酸)。該數據庫是在國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI))產生的，作為國際核苷酸序列數據庫合作項目(InternationalNucleotide Sequence Database Collaboration,或 INSDC)的部分。微陣列目前已用于分析采自患有遲發(fā)性抑郁癥患者腦的尸體解剖樣品的mRNA表 達譜。選擇前扣帶和伏隔核用于分析，因為已知這些腦區(qū)與抑郁癥的病理生理學相關。與 正常個體相比，在經診斷患有抑郁癥的患者的所選腦區(qū)中，在mRNA水平上，已經顯示了與 GABA能系統(tǒng)有關的基因表達的改變(以下實施例中的表2和表4)?，F在詳細描述用于獲 取本發(fā)明所依據數據的具體方案。實施例簡述實施例1描述了用于對來自抑郁和非抑郁受試者的前扣帶樣品進行轉錄組學分 析的方法。實施例2描述了用于對來自抑郁和非抑郁受試者的伏隔核樣品進行轉錄組學分 析的方法。
實施例實施例1 前扣帶轉錄組學實施例1⑴樣品詵擇冷凍腦組織(貯存在-80°C )是來自10名遲發(fā)性抑郁癥患者的額葉皮層，并且與 10名精神病學上健康的對照受試者在年齡、性別、死后時間間隔和瀕死狀態(tài)上相匹配。所 有受試者都是突然死亡，瀕死狀態(tài)的平均持續(xù)時間約7小時(Li等，Hum Mol Genet 13, 609-616(2004))。選擇這些數字是為了在微陣列上，在> 士2SD的常規(guī)顯著性水平上足以 檢測組間差異，或使用基于DIGE的蛋白質組學分析。抑郁受試者全都患有DSM-IV重性抑郁 癥，而且病例記錄回顧證明了這一點，而且他們沒有其它精神病。篩選了對照的病例記錄， 以確保他們沒有任何精神疾病。所有受試者接受尸檢和神經病理學檢查，沒有人具有與癡 呆相符的變化。通過作為瀕死狀態(tài)標志評價pH，篩選組織的適用性。在-80°C貯藏庫中獲取樣 品，再切碎(subdissected)，融化并通過使用UltraTurrax勻漿器以全速勻漿10秒而制備 10%勻漿(例如1克組織加9ml水)。使用經含水標準品標定的氯化銀電極，測定樣品的 pH。實施例1 (ii)微陣列分析評價之后，有限的樣品組可用于分析(參見下表1)。從該樣品組，選擇膝下前扣帶 回皮層(subgenual anterior cingulate cortex)(參見圖 1)并在 _20°C進行顯微解剖。 將這些樣品凍存在-80°C，然后經處理用于RNA分析。為了 RNA的制備，將樣品融化，通過 使用UltraTurrax勻漿器以全速勻漿10秒而制備10%勻漿。測定樣品pH，再用基于胍的 提取(TriZOL)來提取RNA，并在分離之后在柱(RNEasy，Qiagen)上純化，以除去低分子量 RNA。使用Agilent生物分析儀，根據清晰的18/26S核糖體條帶，測定RNA的質量。表1 經提取用于微陣列分析的前扣帶RNA樣品
樣品號RIN -k微陣列ACl6. 5是
18
權利要求
1.一種用于判定受試者是否患有或易患遲發(fā)性抑郁癥的體內成像方法，所述方法包括 下列步驟(i)將體內成像劑給予所述受試者，其中所述體內成像劑包含與多核苷酸或多肽選擇 性締合的化合物，所述多核苷酸或多肽是由GABA能受體基因所編碼，并且其中所述化合物 用體內成像部分標記；( )讓所述體內成像劑與在所述受試者組織中表達的所述多核苷酸和/或所述多肽 選擇性締合；(iii)通過體內成像方法檢測由所述體內成像部分所發(fā)射的信號；和，(iv)產生圖像，該圖像代表所述信號的位置和/或數量。
2.權利要求1的體內成像方法，其中所述GABA能受體基因是編碼以下受體的基 因GABAa受體亞單位Q1 (GABRAl) ；GABAa受體亞單位α 4 (GABRA4) ；GABAa受體亞單位 α 5 (GABRA5) ；GABAa 受體亞單位 β 3 (GABRB3) ；GABAa 受體亞單位 Y (GABRGl) ,GABAa 受體亞 單位 y2(GABRG2) ；GABAa 受體亞單位 P1(GABRRl) ；GABAa 受體亞單位 δ (GABRD) ；GABAb 受 體2(GABBR2)；或者，甘氨酸受體β (GLRB)。
3.權利要求1或2的體內成像方法，其中所述受試者是完整的哺乳動物體體內。
4.權利要求1-3中任一項的體內成像方法，其中所述組織是腦組織。
5.權利要求4的體內成像方法，其中所述腦組織是在前扣帶中。
6.權利要求5的體內成像方法，其中所述GABA能受體基因是GABBR2、GABRG1或GABRRl 的編碼基因。
7.權利要求6的體內成像劑，其中所述GABA能受體基因是GABBR2或GABRRl的編碼基因。
8.權利要求4的體內成像方法，其中所述腦組織是在伏隔核中。
9.權利要求8的體內成像方法，其中所述GABA能受體基因是GABRA4、GABRB3或GABRG2 的編碼基因。
10.權利要求9的體內成像方法，其中所述GABA能受體基因是GABRB3的編碼基因。
11.權利要求1-10中任一項的體內成像方法，其中所述體內成像部分選自(i)放射性金屬離子；( )順磁性金屬離子；(iii)發(fā)射Y射線的放射性鹵素；(iv)發(fā)射正電子的放射性非金屬；和，(ν)超極化NMR-活性核。
12.權利要求11的體內成像方法，其中所述體內成像部分是(i)、(iii)或(iv)之一。
13.一種用于遲發(fā)性抑郁癥診斷的方法，所述方法包括(a)權利要求1-12中任一項的體內成像方法；和，(b)將步驟(a)產生的圖像與體內圖像比較，所述體內圖像代表當在非抑郁受試者中 進行所述體內成像方法時，所述體內成像劑的攝取模式。
14.一種用于遲發(fā)性抑郁癥患者治療的方法，所述方法包括給予藥用組合物，所述藥用 組合物包含(a)藥物有效量的通過與多核苷酸或多肽選擇性締合而調節(jié)GABA能受體活性的化合物，所述多核苷酸或多肽由GABA能受體基因所編碼，所述GABA能受體基因同權利要求2的 方法中所定義；和，(b)生物相容性載體。
15.權利要求1、2、11或12中任一項的方法中定義的體內成像劑，所述體內成像劑用于 權利要求13中定義的診斷方法。
16.權利要求1、2、11或12中任一項的方法中定義的體內成像劑，所述體內成像劑用于 決定是否實施權利要求14中定義的治療方法的方法中，所述決定方法包括(a)權利要求1-12中任一項的體內成像方法；和，(b)評價步驟(a)的體內成像方法所產生的圖像，以決定是否實施所述治療方法。
17.一種用于鑒定與多核苷酸或多肽選擇性締合的化合物的篩選方法，所述方法包括(i)使所述化合物與多肽或多核苷酸接觸，所述多核苷酸或多肽同權利要求1、2、6、7、 9或10中任一項的方法中所定義；和，( )測定所述化合物對所述多肽或所述多核苷酸的效應。
18.權利要求17的篩選方法，其中所述效應是所述化合物與所述多肽或所述多核苷酸 的結合。
19.權利要求17或18的篩選方法，其中所述多肽或多核苷酸是分離的。
20.權利要求17或18的篩選方法，其中所述多肽或多核苷酸在體外細胞中表達。
21.權利要求17或18的篩選方法，其中所述接觸步驟包括將所述化合物給予遲發(fā)性抑 郁癥的動物模型，并且其中所述多肽或所述多核苷酸在所述動物模型的組織中表達。
22.權利要求21的篩選方法，其中所述遲發(fā)性抑郁癥動物模型是遲發(fā)性抑郁癥的靈長 類動物模型、小鼠模型或大鼠模型。
23.權利要求17-22中任一項的篩選方法，其中所述化合物與所述多肽接觸。
全文摘要
已經證明了在患有遲發(fā)性抑郁癥的患者腦中核酸的差異表達。本發(fā)明提供可用于判定遲發(fā)性抑郁癥的方法。本發(fā)明也提供用于鑒定用于治療、預防或診斷遲發(fā)性抑郁癥的化合物的篩選方法。
文檔編號C12Q1/68GK102099489SQ200980128132
公開日2011年6月15日 申請日期2009年5月15日 優(yōu)先權日2008年5月15日
發(fā)明者A·托馬斯, C·莫里斯, D·希斯科克, P·漢森 申請人:通用電氣健康護理有限公司