專利名稱：用于檢測幽門螺旋桿菌的強(qiáng)毒株的分子診斷試劑盒的制作方法
用于檢測幽門螺旋桿菌的強(qiáng)毒株的分子診斷試劑盒
背景技術(shù)：
幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)引起的感染是大的公共健康問題，因為其 控制非常昂貴。這種情況導(dǎo)致需要檢測與該病癥相關(guān)的風(fēng)險因子的工具。但是，目前尚無 商業(yè)上可獲得的檢測強(qiáng)毒株(virulentstrain)的微生物檢測。由于目前沒有可信賴的檢測幽門螺旋桿菌的實驗室工具，所以該細(xì)菌的根除治療 僅基于定性方法，并且沒有測定幽門螺旋桿菌的毒力的處理法或治療法?，F(xiàn)有方法僅僅指示微生物的存在與否，但不揭示感染菌株的性質(zhì)或特性。另一個 重要方面是，兒童群體中僅進(jìn)行了非常零星的內(nèi)窺鏡研究，所以關(guān)于該年齡組的感染數(shù)據(jù) 非常少。根據(jù)世界范圍內(nèi)的報告，由于各種原因，在20%至80%的病例中，根除治療是失 敗的，所述原因包括對于抗細(xì)菌試劑具有抗性的菌株的出現(xiàn)以及在選擇治療法之前缺乏易 感性研究。所述狀況意味著對于患者和衛(wèi)生系統(tǒng)的高健康成本。關(guān)于感染菌株的致病潛力 的明確信息的缺乏會阻礙患者的康復(fù)。已經(jīng)通過脲酶的反應(yīng)在遺傳水平上常規(guī)地鑒定了該細(xì)菌，所述脲酶允許胃粘膜的 定殖，這是因為，在存在脲、氫離子和水時，該酶催化銨和碳酸氫鹽的形成，其中和細(xì)菌周圍 的氫離子并允許它在胃上皮中存活(Hazell等人，1986 ；Mobley等人，1988 ；Megraud等人， 1989)。幽門螺旋桿菌具有不同的毒力因子，這些因子允許它定殖于胃的胃粘膜并使其逃 離宿主的防御機(jī)制。這些因子中有一些是物種特異性的，其它的則可變地存在。在所有菌 株中都存在的常規(guī)毒力因子是脲酶、螺旋結(jié)構(gòu)、鞭毛和粘附素，以及內(nèi)毒素(LPQ ；此外，精 氨酸酶參與免疫系統(tǒng)的逃逸。該細(xì)菌表達(dá)的粘附素識別來自上皮細(xì)胞的特異性糖。研究得 最廣泛的是N-乙酰神經(jīng)氨酰乳糖血凝素和蛋白BabA (血型抗原結(jié)合性粘附素)，后者允許 細(xì)菌結(jié)合至胃粘膜中的LewisLeB血型抗原。特異性蛋白(例如脂酶(粘蛋白酶)，其降解改變上皮表面疏水性的粘液)輔助該 細(xì)菌的定殖。這會使在胃粘膜中的運動成為可能，并且細(xì)菌蛋白酶水解宿主的免疫球蛋白 (Smoot，1997)。同時，細(xì)菌回避了免疫應(yīng)答，這是由于存在IgA分泌子的特異性蛋白酶，并 且LPS具有低免疫原性效力，其抑制來自宿主的有效免疫應(yīng)答(Muotiala等人，1992)。在嘗試確定哪種幽門螺旋桿菌的菌株具有更強(qiáng)的致病性以及在它們與感染的臨 床表現(xiàn)之間是否存在一定關(guān)系時，研究了不同的基因。本領(lǐng)域已知的是，毒力依賴于多種基 因，其中多數(shù)基因位于毒力島(pathogenicity iSland，PAI)。研究得最廣泛的基因是vacA 和 cagA、iceA、babA2 和 dupA (Zambon 等人，2003 ；Fatodez 等人，2002 ；Censini 等人，1996)。一些研究者已經(jīng)提出了對這些標(biāo)志物組合的分析；例如，vacA和cagA —起的分 析。在這個方面，具有si型vacA的信號序列的幽門螺旋桿菌菌株與較強(qiáng)的胃炎癥和胃潰 瘍病有關(guān)；是ml型中間區(qū)(middleregion)的vacA等位基因與更嚴(yán)重的上皮損傷有關(guān)(Pan 等人，1999)。其它研究者提出，cagA和iceA基因型將是用于鑒定具有胃潰瘍的患者的良 好標(biāo)志物組合(Fatodez等人，2002)。
涉及幽門螺旋桿菌的致病性的一種新基因是編碼蛋白BabAl和BabA2的基因，其 允許粘附素的合成的活化和去活化(Gerhard等人，1996)。在世界上的主要數(shù)據(jù)庫和專利局進(jìn)行了檢索。在以下部分討論了與本發(fā)明最密切 相關(guān)的文獻(xiàn)。在市場上可以獲得一種設(shè)計用于檢測幽門螺旋桿菌的基于MWGBiotech，Inc.的 微陣列技術(shù)的產(chǎn)品。該產(chǎn)品由1877個識別幽門螺旋桿菌菌株州9和沈695的寡核苷酸組 成。這些寡核苷酸中的1307個在兩種菌株中是重合的，有295個是幽門螺旋桿菌菌株26695 特異性的寡核苷酸；有278個是幽門螺旋桿菌菌株J99特異性的寡核苷酸。沒有相關(guān)的發(fā) 明專利申請。hvitek公司開發(fā)了一種用于檢測糞便中的幽門螺旋桿菌的cagA基因型的試劑 盒，其商品名為INVIGENEE ，其能夠確定是否存在該細(xì)菌的活性感染。該設(shè)備沒有相 關(guān)的發(fā)明專利申請。該設(shè)備僅僅可能確定是否存在微生物，而不能確定其毒力。Maxim Biotech, Inc公司的產(chǎn)品“用于檢測幽門螺旋桿菌的MPCR試劑盒”和 MP-70080是使用多重PCR技術(shù)開發(fā)的。該試劑盒設(shè)計為使用多重PCR迅速檢測幽門螺旋桿 菌。該試劑盒中包含的引物擴(kuò)增基因cagA(358bp)、鞭毛蛋白(152bp)、脲C(3Mbp)和ARNr 16S(110bp)。該產(chǎn)品包括擴(kuò)增所需的所有反應(yīng)劑，聚合酶Taq和dNTP除外。該試劑盒包括 工作緩沖液、各個陽性對照、分子量標(biāo)志物、不含DNA酶的水和特異性引物。我們的發(fā)明中 沒有使用該試劑盒中的任何引物或基因。有64項發(fā)明專利申請與本發(fā)明相關(guān)。以下敘述與幽門螺旋桿菌檢測試劑盒最密 切相關(guān)的申請和現(xiàn)有專利的詳細(xì)信息與檢測脲酶的試劑盒相關(guān)的發(fā)明表1.與幽門螺旋桿菌檢測試劑盒相關(guān)的發(fā)明
權(quán)利要求
1.用于檢測幽門螺旋桿菌菌株毒力的方法和試劑盒，其中所述方法包括以下步驟(a)DNA提取步驟，(b)使用表1所示的引物通過多重PCR進(jìn)行序列擴(kuò)增的步驟，(c)顯示和數(shù)據(jù)分析步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于檢測幽門螺旋桿菌菌株毒力的方法和試劑盒，其中所述DNA 提取步驟由下列階段組成i.細(xì)胞裂解階段，ii.DNA制備階段，iii.DNA回收階段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2的用于檢測幽門螺旋桿菌菌株毒力的方法和試劑盒，其中在所 述DNA提取步驟中，具體而言在細(xì)胞裂解階段，使用棉球、蛋白酶K和CTAB/NaCl溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2的用于檢測幽門螺旋桿菌菌株毒力的方法和試劑盒，其中在所 述DNA提取步驟中，具體而言DNA制備階段是通過氯仿、異戊醇的混合物或苯酚、氯仿和異 戊醇的混合物進(jìn)行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2的用于檢測幽門螺旋桿菌菌株毒力的方法和試劑盒，其中在所 述DNA提取步驟中，具體而言在DNA回收階段，使用下列引物進(jìn)行目標(biāo)序列的擴(kuò)增a.幽門螺旋桿菌鑒定基因，幽門螺旋桿菌的16DNAr 正向 5' CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3'反向 5' CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3'，b.毒力基因 cag4 正向 5' TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3'； 反向5' GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3' vacAm等位基因1 正向 5' ATT TGG TCC GAG GTG GGA AAG T 3'， 反向 5' GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3' 基因dupA 正向 5' ACA AGG ACG ATT GAG CGA TGG GAA 3' 反向 5，TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT 3，，c.DNA質(zhì)量測定基因16S DNAr Eub 正向 5' GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3，， 反向 5，GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG 3，。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的用于檢測幽門螺旋桿菌菌株毒力的方法和試劑盒，其中該方法使 用陽性和陰性DNA提取物對照。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的用于檢測幽門螺旋桿菌菌株毒力的方法和試劑盒，其中所述陽性 DNA提取物對照是幽門螺旋桿菌ATCC43504，并且所述陰性DNA提取物對照是人類基因組。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的用于檢測幽門螺旋桿菌菌株毒力的方法和試劑盒，其中所述顯示 步驟必須使用濃度介于1. 2%至4%的瓊脂糖凝膠。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試劑盒，其中所述試劑盒除了對照之外還包含擴(kuò)增反應(yīng)物和適當(dāng)?shù)囊?，任選地a.檢測反應(yīng)物和數(shù)據(jù)分析，b.細(xì)胞裂解反應(yīng)物，c.沉淀反應(yīng)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)物包括以下物質(zhì)a.具有針對幽門螺旋桿菌的特異性引物的多重PCR反應(yīng)物，b.目標(biāo)序列的擴(kuò)增對照。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)物，具體而言用于多重PCR的反應(yīng)物是a.反應(yīng)緩沖液b.熱穩(wěn)定酶Taq聚合酶，c.核苷酸，d.特異性引物，其針對幽門螺旋桿菌鑒定基因，幽門螺旋桿菌的16DNAr: 正向 5' CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3'反向 5' CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3'，e.毒力基因i.cagA 正向 5' TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3'； 反向5' GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3'ii.vacAm等位基因1 正向 5' ATT TGG TCC GAG GTG GGA AAG T 3'， 反向 5' GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3'iii.基因dupA 正向 5' ACA AGG ACG ATT GAG CGA TGG GAA 3' 反向 5，TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT 3'， 任選的 cagA 正向5' ACG ATA GGG ATA ACA GGC AAG C 3'； 反向5' GAT CCG TTC GGAT TTG ATT CCC 3'； cagA 正向5' TCAGAAATTTGGGGATCAGC 3'； 反向5' ACATGGGGAACTGGTTCTTG 3'； 任選的 vacAm1 正向5' GCA ATG CAG CAG CTA TGA TG 3'； 反向5' GCG CTC TTT GAA TTG CTC TT 3'；iv.vacAm 1 正向5' GCA ATG CAG CAG CTA TGA TG 3'；反向5' TAG GCG CTC TTT GAA TTG CT 3' f. DNA質(zhì)量測定基因16S DNAr Eub 正向 5' GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3'， 反向 5，GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG 3'。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)物的反應(yīng)緩沖液由下列組成Tris-HCl IOOmM, pH介于8. 5至9. 5 范圍內(nèi)，濃度介于480至560mM范圍內(nèi)的KCl，和濃度介于10至20mM范圍內(nèi)的MgCl2。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中用于序列擴(kuò)增的Taq聚合酶的濃度介于400至6000U范圍內(nèi)。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中二核苷酸的濃度介于15至30mM范圍內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中使用的引物具有以下特征a.幽門螺旋桿菌鑒定基因，幽門螺旋桿菌的16DNAr 正向 5' CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3'反向 5' CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3'，b.毒力基因i.cagA 正向 5' TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3'； 反向5' GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3'ii.vacAm等位基因1 正向 5' ATT TGG TCC GAG GTG GGA AAG T 3'， 反向 5' GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3'iii.基因dupA 正向 5' ACA AGG ACG ATT GAG CGA TGG GAA 3' 反向 5，TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT 3，，c.DNA質(zhì)量測定基因16S DNAr Eub 正向 5' GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3，， 反向 5，GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG 3，。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中使用的引物的濃度介于1至20pmol/l范圍內(nèi)。
17.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中試劑盒中所有反應(yīng)物以兩種物理形式存在a.脫水、無菌且凍干的，或者b.液體且無菌的。
18.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中目標(biāo)序列的擴(kuò)增對照是a.陽性對照來自幽門螺旋桿菌菌株ATCC43504的DNA，b.陰性對照人類DNA。
19.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述引物是預(yù)先標(biāo)準(zhǔn)化的a.幽門螺旋桿菌鑒定基因，幽門螺旋桿菌的16DNAr正向 5' CTG GAG AGA CTA AGC CCT CCA 3'反向 5' CAT TAC TGA CGC TGA TTG 3'，b.毒力基因i.cagA 正向 5' TCA GA AAT TTG GGG ATC AGC 3'；反向5' GGG GAA CTG GTT CTT GAT TG 3'ii.vacAm等位基因1 正向 5' ATT TGG TCC GAG GTG GGA AAG T 3'，反向 5' GCT AGG CGC TCT TTG AAT TGC T 3'iii.基因dupA 正向 5' ACA AGG ACG ATT GAG CGA TGG GAA 3'反向 5，TGG CTA GTT TGA GGT CTT AGG CGT 3，，c.DNA質(zhì)量測定基因16S DNAr Eub 正向 5' GCA CAA GCG GTG GAG CAT GTG G 3，，反向 5，GCC CGG GAA CGT ATT CAC CG 3，。
20.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述毒力基因、物種鑒定基因和DNA提取物質(zhì)量基因一齊擴(kuò)增。
21.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中由于擴(kuò)增以25 μ 1的體積、介于58至65°C的溫度、35至45個循環(huán)進(jìn)行，使用擴(kuò) 增珠子載體。
22.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中可以以濃度為Ing的DNA使用所述試劑盒。
23.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述試劑盒包括允許測定所提取的DNA的質(zhì)量的引物。
24.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述試劑盒測定不同樣品包括體液、組織或糞便中不同幽門螺旋桿菌菌株的存 在和毒力。
25.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述試劑盒允許鑒定毒力基因cagA，vacAm等位基因1和dupA基因。
26.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述試劑盒允許使用基因16S DNAr鑒定幽門螺旋桿菌。
27.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述試劑盒允許使用基因16S DNArEub的顯示來測定DNA質(zhì)量。
28.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試 劑盒，其中所述試劑盒可以包括不含核酸酶的超純水。
29.根據(jù)權(quán)利要求9的用于檢測不同類型樣品中幽門螺旋桿菌菌株的存在和毒力的試劑盒，其中所述試劑盒含有使用者手冊。
全文摘要
本發(fā)明公開了試劑盒，其形式為能夠用于同時檢測幽門螺旋桿菌的4種基因，即1種鑒定基因(rDNA16S Hpy)和3種毒力基因(cagA、vacAm1、dupA)的產(chǎn)品和方法。此外，該試劑盒涉及測定DNA提取物質(zhì)量的引物組合(Eub基因)。
文檔編號C12P19/34GK102099486SQ20098012757
公開日2011年6月15日 申請日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月26日
發(fā)明者A·加西亞坎西諾, C·岡薩雷斯科雷亞, N·特拉巴爾費爾南德斯 申請人:康塞普西翁大學(xué)