專利名稱：用作味道調節(jié)劑的環(huán)脂肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及屬于環(huán)脂肽組的分子作為味道調節(jié)劑的用途，優(yōu)選用于含有至少一種 甜味劑的可食組合物。在優(yōu)選的實施方案中，將枯草菌表面活素(SUrfactin)用于本發(fā)明 的目的。此外，本發(fā)明涉及調節(jié)所述可食組合物的味道和/或回味的方法以及這些含有至 少一種環(huán)脂肽作為味道調節(jié)劑的組合物。
背景技術：
由于其兩性特性，枯草菌表面活素是作為生物表面活性劑的微生物來源的環(huán)脂 肽。對于化學分類，它們可以被命名為環(huán)脂縮酚酸肽，這是縮酚酸肽的特別形式。常常 通過真菌(例如，Metarhizium sp.或Cladobotryum sp.)和細菌(例如，丁香假單胞 菌(Pseudomonas syringae) (US 5，830，855)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) (EP 0761682 Bl))以環(huán)狀形式(環(huán)縮酚酸肽)來合成縮酚酸肽，并且其呈現(xiàn)出抗生素和致植物 病的特性。在縮酚酸肽中，通過肽-以及酯-鍵合來連接氨基酸和羥基酸。因此，縮酚酸肽 屬于heterodet肽，其特征在于該分子的凝聚中涉及肽鍵以及非肽鍵。EP 0761682B1描述 了從枯草芽孢桿菌制備環(huán)縮酚酸肽，并且其具有用于高脂血癥的治療用途。枯草菌表面活 素和其他環(huán)脂肽是可購得的。枯草菌表面活素由七個氨基酸的肽環(huán)和疏水性脂肪酸鏈組成，這使得該分子能 透過細胞膜。其具有特征性的“馬鞍”構象，其脂質尾使得可以透過膜。迄今為止已經知 道了多種變體分子分別為枯草菌表面活素Ap A2, A3、B1, B2, C1, C2和D。變體形式在脂質 尾的長度和分支因子上有所不同，而環(huán)肽保持基本不變，包括L-谷氨酸、L-亮氨酸、D-亮 氨酸、L-纈氨酸、L-天冬酰胺、D-亮氨酸和L-亮氨酸(枯草菌表面活素A)。僅僅對于后 一個氨基酸位置(L-Ieu)，描述了一些變化L-val (枯草菌表面活素B)或L-Ile (枯草菌 表舌素 C) (Stein, Τ.，Bacillus subtilis antibiotics !structures, syntheses and specific functions (枯草芽孢桿菌抗生素結構、合成和特定功能)，Mol. Microbiol. (2005),56(4) :845-857)。枯草芽孢桿菌產生枯草菌表面活素A、B和C，枯草菌表面活素 C是得到最徹底研究的變體。已知枯草菌表面活素具有對抗細菌、真菌和病毒的抗微生物 活性，并且還呈現(xiàn)出抗腫瘤和抗血栓形成(溶血纖維蛋白和抗凝血)活性。對于枯草菌表 面活素潛在治療應用的概述，參見Seydlov(5，G.和Svobodovci，J.，Review of surfactin chemical properties and the potential biomedical applications ( tt1 M7 素化學特性和潛在生化應用的概述)，Cent Eur. J. Med. (2008),3(2) : 123-133。其抗炎 特性是由于其對LPS-誘發(fā)的信號傳導的抑制作用引起的(Takahashi等，hhibition of lipopolysaccharide activity by a bacterial cyclic lipopeptide surfactin( 細 菌環(huán)脂肽枯草菌表面活素抑制脂多糖活性)，J. Antibiot. (2006),59(1) :35-43)。由于其 穩(wěn)定性，將枯草菌表面活素鈉用于化妝品工業(yè)中Woneda等，Surfactin sodium salt :an excellent biosurfactant for cosmetics (枯草菌表面活素鈉鹽極好的用于化妝品的生 物表面活性劑)，Cosmet. ki. (2001) ,52(2) :153-4)。根據例如US 7，011，969或US 5，227，294中所述的方法，可以從枯草芽孢桿菌獲得枯草菌表面活素。對于枯草菌表面活素C，由于其溶血作用引起的枯草菌表面活素的毒性得到了 最徹底的研究。僅僅在40至60 μ M的高濃度下才看到了溶血活性(Dehghan-Noudeh， G.等，Isolation, characterization and investigation of surface and haemolytic antivities of a lipopeptide biosurfactant produced by Bacillus subtilis ATCC6633(由枯草芽孢桿菌ATCC 6633產生的脂肽生物表面活性劑的分離、表征以及表面 和溶血活性的研究)，J. Microbiol. (2005)，43 :272-276)。只在每天 i. v.超過 100mg/kg 的高濃度的小鼠中才觀察到毒性(LD5tl)。口服攝入至多IOmg的枯草菌表面活素沒有顯示出 7SrfSJ"^3111 '(Hwang^,Lipopolysaccharide-binding and neutralizing activities of surfactin C in experimental models of septic shock(枯草菌表面活素在胺毒性休 克的實驗模型中的脂多糖結合和中和活性)，Eur. J. Pharmacol. (2007),556 :166-171)?？莶菥砻婊钏刈鳛榭墒辰M合物中的成分，尤其是作為調味劑或味道調節(jié)劑的用 途迄今為止還沒有描述或提出過。在鑒定有用的天然調味劑衍生物(如，例如，是天然糖類甜味劑衍生物的甜味劑， 如，例如，赤蘚糖醇、異麥芽糖醇、乳糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇)方面，最近已有重 大進展。在鑒定作為潛在甜味劑的天然萜類、類黃酮或蛋白質方面，最近也有進展。參見， 例如，Kinghorn等的題為“非致癌天然強甜味劑”的論文(Med. Res Rev (1998), 18 (5) 347-360)，討論了最近公開的天然材料比通常的天然甜味劑(如蔗糖、果糖、葡萄糖等)更 甜。相似地，在鑒定和商業(yè)化新人造甜味劑(如阿斯巴甜、糖精、安賽蜜-K、環(huán)氨酸鹽、三 氯蔗糖和阿力甜等)方面，最近也有進展；對于綜述，參見Ager等的論文，Commerical, Synthetic Nonnutritive Sweeteners (|§ ^lkSf 1 ) (Angew. Chem. Int. IS 輯，(1998) ,37(12) :1802-1817)。近些年來，在普通生物技術和更好地理解味道感知的基礎生物和生化現(xiàn)象方 面已經獲得了實質性的進展。例如，最近已經在哺乳動物中鑒定出參與味道感知的味 覺感受器蛋白。特別地，已經鑒定出被認為參與味道感知的兩個不同家族的G蛋白偶 聯(lián)感受器，T2R 和 T1R(參見，例如，Nelson 等，Cell (2001), 106 (3) :381-390 ；Adler 等， Cell (2000)，100(6) :693-702 ；Chandrashekar 等，Cell (2000)，100 :703-711 ；Matsunami 等，Nature (2000), 404 :552-553 ；Li 等，Proc Natl Acad Sci USA (2002) ,99 :4962-4966 ； Montmayeur 等，Nature Neuroscience (2001), 4 (S) :492-498 ；美國專利 6，462，148 ；和 PCT 公開 WO 02/06254，WO 00/63166, WO 02/064631 和 WO 03/001876，以及美國專利公開 US 2003-0232407 Al)。盡管T2R家族包括超過25個參與苦味感知的基因，但負責甜味感知的TlR家族 只包括三個成員，TlRl、T1R2 和 T1R3(參見 Li 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002), 99, 4962-4966)。最近，在WO 02/064631和WO 03/001876中公開了特定的TlR成員，在合適的 哺乳動物細胞系中共同表達時，裝配形成功能性味覺感受器。發(fā)現(xiàn)了 T1R2和T1R3在合適 的宿主細胞中的共同表達形成了功能性T1R2/T1R3 “甜”味感受器，其應答不同的味道刺激 物，包括天然產生和人造的甜味劑(參見，Li等，上文中所引用的)。提議將甜味劑感受器 T1R2和T1R3作為同型或異型寡聚物在人腸內分泌細胞中的表達作為用于味道感知調節(jié)劑 鑒定的模型測試系統(tǒng)(W0 08/014450 A2)。
食品、飲料、令人愉快的產品、甜食、寵物食品、藥品或化妝品通常具有高含量的甜 味劑，就甜味劑相關疾病的發(fā)展而言，通常認為這是不利的。在此尤其是如肥胖癥、糖尿病、 心血管疾病等這些疾病主要是由于高熱量甜味劑引起的。存在很好的證據證明高熱量甜味 劑(例如，單糖、雙糖和寡糖，尤其是蔗糖)與較高水平的血漿三酰甘油相關，這是公認的心 血管疾病的風險因素。同樣，提高的糖攝入與促進糖尿病、肥胖癥或其他疾病的身體狀況相 關。在食品和飲料工業(yè)中，現(xiàn)有技術是用果糖替代那些引起麻煩的糖，如葡萄糖、蔗糖、海藻 糖等。在2005年，全球甜味劑市場正處于每年170百萬噸糖當量(為比較不同甜味劑量 的測量單位，考慮了它們的不同的甜味效能)的規(guī)模。該市場包括熱量甜味劑、高強度甜味 劑和多元醇。最重要的熱量甜味劑是精制糖或蔗糖；其他熱量甜味劑是高果糖玉米糖漿、葡 萄糖和右旋糖。高強度甜味劑是提供與糖相同的甜度但物質較少并因此熱量較低的產品。 它們提供35至10，000倍糖的甜度。也將它們稱為低熱量或節(jié)食甜味劑，或，如果它們不包 括任何熱量，也稱為非熱量甜味劑。除了安賽蜜-κ以外，其他重要的高強度甜味劑是糖精、 阿斯巴甜、環(huán)氨酸鹽、甜菊苷和三氯蔗糖。最后，多元醇是糖醇，其提供糖的主要部分和結 構，但可以標記為具有低于糖的熱量。例如，通常公認高果糖玉米糖漿(HFCQ作為甜味劑在焙烤制品(HFCS 90)、軟飲 料(HFCS 55)、運動飲料(HFCS 42)或在面包、谷類食品、調味品等中的使用。HFCS指的是 一組通過酶加工以提高它們的果糖含量并隨后與純玉米糖漿(100%葡萄糖)混合來達到 其最終形式的玉米糖漿。最常見類型的HFCS是HFCS 90(大約90%果糖和10%葡萄糖)； HFCS 55 (大約55%果糖和45%葡萄糖)；和HFCS 42 (大約42%果糖和58%葡萄糖)。然而，從最近的研究可以得出的結論是對血糖、胰島素、瘦素和饑餓素的作用，果 糖與蔗糖相比較，沒有呈現(xiàn)出差異?？傊瑢τ谝韵碌募僭O，幾乎不存在證據其對食欲或參 與脂肪貯存的代謝過程的作用，HFCS不同于蔗糖。減少例如包裝食品中的熱量甜味劑的另一種策略是使用無-或低-熱量人造甜味 劑，如安賽蜜-K、糖精、環(huán)氨酸鹽、阿斯巴甜、索馬甜或新橙皮苷DC、三氯蔗糖、紐甜或甜菊 糖苷。在此兩個方面有著主要影響。首先，這些化合物與糖類相比，具有截然不同的余味， 其次，長期討論這些甜味劑是否致癌。因此，理想的，并且本發(fā)明的目的是尋找具有如下特性的化合物能調節(jié)甜味，或 通過自身的甜味或基于其自身具有增強一種或多種本領域已知甜味劑的屬性調節(jié)弱甜味 劑或最可能是自身不具有甜味屬性但具有能增強可食組合物中所用的一種或多種本領域 已知甜味劑能力的增強劑來增強由本領域已知甜味劑產生的甜味。在本領域中，對于顯示出味道調節(jié)活性的化合物，已經制訂了幾個提案。WO 2006/138512公開了二 -芳族酰胺及其作為甜味調節(jié)劑、促味劑和味道增強劑的用途。US 7，175，872涉及用作味道調節(jié)劑的吡啶鹽-甜菜堿化合物。WO 2007/014879提出了用于增 強甜味的橙皮素。不過，本領域中仍然需要新的和改良的味道調節(jié)劑，作為調味劑，尤其是需要對于 以上列出的原因沒有或只有非常低的甜味劑潛能的化合物。本發(fā)明打算通過提供具有味道 調節(jié)特性的化合物來解決這些問題。發(fā)明概述
本發(fā)明涉及枯草菌表面活素和相關的環(huán)脂肽，優(yōu)選來自微生物來源，令人驚訝地 發(fā)現(xiàn)其具有味道調節(jié)特性。本發(fā)明的一個方面是一種或多種上述脂肽的用途，優(yōu)選枯草菌 表面活素C或不同枯草菌表面活素的混合物的用途，作為含有一種或多種天然或人造甜味 劑的可食組合物中的味道調節(jié)劑，甜味劑實例如上所述。本發(fā)明的另一個方面是調節(jié)上述 可食組合物的味道(包括余味)的方法，其包括將該組合物與味道調節(jié)量的一種或多種上 述脂肽混合，脂肽優(yōu)選枯草菌表面活素C或枯草菌表面活素的混合物。本發(fā)明的再另一個 方面涉及含有一種或多種天然和/或人造甜味劑和一種或多種所述脂肽的可食組合物，脂 肽優(yōu)選枯草菌表面活素C或枯草菌表面活素的混合物。在本說明書中，引用了許多文獻，在此將這些參考文獻(包括其中的科學論文、專 利和專利申請)的全部公開內容引入作為參考，出于至少部分地描述本領域普通技術人員 的知識的目的和出于公開例如化合物、結構(如T2R和TlR哺乳動物味覺感受器蛋白)和 一些方法的目的，這些方法例如是在細胞系中表達這些感受器的方法和使用所得到的細胞 系就味道調節(jié)活性來篩選化合物的方法。發(fā)明詳述就本發(fā)明的目的而言，以下術語應當具有以下所述的意思“可食組合物”以其最廣義來理解，包括但不限于食品、飲料、軟飲料、令人愉快的 產品、甜食、甜味劑、化妝品(如，例如，漱口水)、動物食品(如，寵物食品)和藥物或藥品?！拔兜勒{節(jié)劑”或“味道調節(jié)”指的是調節(jié)含有一種或多種天然和/或人造甜味劑 的可食組合物的味道(包括余味)的化合物/活性。味道調節(jié)劑可以在動物或人體內調節(jié)、 增強、促進、形成或誘發(fā)味道印象，并且優(yōu)選增強的甜味感。“天然”和“人造甜味劑”是對于可食組合物本領域已知和/或使用的那些甜味劑； 在之前的段落中已經給出其實例?！拔兜勒{節(jié)量”指的是能夠調節(jié)含有甜味劑的可食組合物味道的一種或多種化合 物的量。調節(jié)或提高可食組合物味道需要的味道調節(jié)劑的濃度當然取決于許多變量，包括 特定類型的可食組合物及其各種其他成分，尤其是其他天然和/或人造甜味劑的存在及其 濃度，品嘗組合物的人天然的遺傳變異性和個人偏好和健康狀況，特定化合物對這種甜味 化合物味道的主觀作用。因此，不可能明確說明確切的“有效量”。然而，可以通過本領域普通技術人員只使 用常規(guī)實驗來確定合適的有效量(參見，例如，US 7，175，872的實施例9和WO 2006/138512 A2的實施例53)。可以用于本發(fā)明中的環(huán)脂肽是式⑴的那些
權利要求
1.一種或多種根據式(I)的環(huán)脂肽作為甜味增強劑的用途，
2.如權利要求1中所要求的用途，其中在式(I)中，氨基酸是D-和L-氨基酸，特別地， 在序列LLDLLDL中(從位置1至7)。
3.如權利要求1或2中所要求的用途，其中使用至少一種另外的環(huán)脂肽，其不同于根據 式(1)的脂肽。
4.如權利要求1至3的一項或多項權利要求中所要求的用途，其中在式(I)中，位置7 的氨基酸由Val或Ile替換。
5.如權利要求1至4的一項或多項權利要求中所要求的用途，其中在式(I)中，位置 2、3、4、6和7的一個或多個氨基酸由來自包括Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp和Pro 的組的疏水性氨基酸替換和/或位置1和5的一個或多個氨基酸由來自包括Asp和Glu的 組的帶負電氨基酸替換。
6.如權利要求1至5的一項或多項權利要求中所要求的用途，用于可食組合物中。
7.如權利要求6中所要求的用途，其中可食組合物含有至少一種天然或人造甜味劑。
8.如權利要求6或7中所要求的用途，其中以0.Olmg至IOg環(huán)脂肽/kg可食組合物的 量來使用一種或多種環(huán)脂肽。
9.如權利要求6至8的一項或多項權利要求中所要求的用途，其中可食組合物進一步 包含單糖、雙糖或寡糖作為甜味劑。
10.如權利要求6至9的一項或多項權利要求中所要求的用途，其中可食組合物含有高 果糖玉米糖漿(HFCS)作為甜味劑。
11.如權利要求6至10的一項或多項權利要求中所要求的用途，其中可食組合物選自 冰淇淋、飲料、酸奶、甜點、涂抹醬和藥物組合物，優(yōu)選碳酸化醇和非醇飲料。
12.調節(jié)味道的方法，包括將權利要求1中所要求的環(huán)脂肽加入到可食組合物中的步馬聚ο
13.降低熱量甜味劑濃度的方法，包括將權利要求1中所要求的環(huán)脂肽加入到可食組 合物中的步驟。
14.包含權利要求1中所要求的環(huán)脂肽的可食組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種或多種環(huán)脂肽(如枯草菌表面活素A、B1和C及其衍生物和混合物)作為味道調節(jié)劑和/或甜味增強劑用于含有至少一種天然或人造甜味劑的可食組合物的用途?？墒辰M合物包括食品、飲料、藥品和化妝品，并且優(yōu)選含有單糖、雙糖或寡糖作為甜味劑。本發(fā)明進一步涉及所述含有環(huán)脂肽作為味道調節(jié)劑的可食組合物。
文檔編號A23L1/236GK102105070SQ200980129424
公開日2011年6月22日 申請日期2009年6月23日 優(yōu)先權日2008年6月24日
發(fā)明者H·津克, M·克羅恩 申請人:鹿特諾瓦營養(yǎng)品和食品有限公司