專利名稱：用于向細胞內遞送的二嵌段共聚物和其多核苷酸復合物的制作方法
用于向細胞內遞送的二嵌段共聚物和其多核苷酸復合物交叉參考本申請要求2008年5月13日提交的美國臨時申請案61/052，908、2008年5 月13日提交的美國臨時申請案61/052，914、2008年8月22日提交的美國臨時申請案 61/091，294、2008年11月6日提交的美國臨時申請案61/112，0M、2008年11月6日提交的 美國臨時申請案61/112，048,2008年12月12日提交的美國臨時申請案61/120，769,2008 年12月M日提交的美國臨時申請案61/140，779、2008年12月M日提交的美國臨時申請 案61/140，774和2009年4月21日提交的美國臨時申請案61/171，377(所有這些文獻的 內容以其全文通過引用合并入本文)的權益。關于聯邦政府資助的研究的聲明本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院給予的合同號5 ROl EB 2991-03下的政府資助下 進行的。政府具有本發(fā)明的某些權利。領域本發(fā)明涉及有機化學、高分子化學、生物化學、分子生物學和醫(yī)學領域。具體地其 涉及共聚物(例如，二嵌段共聚物)和其與多核苷酸的復合物，待用作將多核苷酸遞送入活 細胞的載體(vehicle)。
背景技術：
在某些情況下，給活細胞提供治療劑(例如，寡核苷酸)是有益的。在一些情況下， 此類多核苷酸至活細胞的遞送提供了治療益處。概述在一些實施方案中，本文中提供了包含至少兩個嵌段的共聚物，其中第一嵌段包 含至少一個親水性(例如，在大約生理pH下)的結構單元，第二嵌段包含多個疏水性部分。 在某些實施方案中，第二嵌段還包含以帶電荷或不帶電荷狀態(tài)存在的可帶電荷的種類，其 在生理PH是陰離子性的。然而，當pH處于該可帶電荷種類的大約pKa時，將存在以兩種形 式存在的可帶電荷種類的平衡分布，即大約50%將是陰離子性的，并且大約50%將不帶電 荷。PH離該可帶電荷種類的pKa越遠，則該平衡中將存在相應的偏移，從而在更高的pH值 下，陰離子形式將占優(yōu)勢，而在更低的PH值下，未帶電荷的形式將占優(yōu)勢。本文中描述的實 施方案包括在任何PH值下的共聚物的形式。在內體的pH值(內體pH)下，可帶電荷的種 類將主要以未帶電荷的形式存在。優(yōu)選地，在某些情況(其中將本文中描述的聚合物與細胞膜接觸)下，其將破裂膜 或使膜失去穩(wěn)定并且進入細胞內環(huán)境。在特定的實施方案中，本文中提供的聚合物是內體 裂解性的或使內體膜失去穩(wěn)定的。在某些實施方案中，本文中提供了細胞膜去穩(wěn)定化(例如，內體裂解性或內體膜 去穩(wěn)定化)的共聚物，其包含(a)第一嵌段，該第一嵌段為親水性嵌段，和(b)第二嵌段，該第二嵌段為膜去穩(wěn)定化的疏水性嵌段，其包含(i)在大約生理pH下為陰離子性的第一可帶電荷種類
(ii)在大約生理pH下為陽離子性的第二可帶電荷種類。在一些實施方案中，本文中提供了細胞膜去穩(wěn)定化(例如，內體裂解性或內體膜 去穩(wěn)定化)的共聚物，其包含(a)第一嵌段，該第一嵌段是包含在大約生理pH下為陽離子性的第一可帶電荷種 類的親水性嵌段，(b)第二嵌段，該第二嵌段為膜去穩(wěn)定化的疏水性嵌段，其包含⑴在大約中性pH下為陰離子性的第二可帶電荷種類；和(ii)在大約生理pH下為陽離子性的第三可帶電荷種類；和(c)與第一嵌段締合的寡核苷酸。在某些實施方案中，本文中提供了細胞膜去穩(wěn)定化(例如，內體裂解性或內體膜 去穩(wěn)定化)的共聚物，其包含(a)第一嵌段，該第一嵌段為親水性嵌段，(b)第二嵌段，該第二嵌段是包含丙烯酸殘基或烷基丙烯酸殘基的膜去穩(wěn)定化疏 水性嵌段。在一個方面，本發(fā)明涉及共聚物(例如，二嵌段共聚物)，其包含第一嵌段，其包含在正常生理pH下為親水性的第一結構單元；第二嵌段，其包含在正常生理pH下為陽離子性的并且可以與第一結構單元相同或不同的第二結構 單元；在正常生理pH下為陰離子性的第三結構單元；疏水性增強部分，其中該疏水性增強部分共價連接至第二結構單元；或該疏水性增強部分共價連接至第三結構單元；或該疏水性增強部分包含在第二嵌段的第四結構單元中；或上述結構的任何組合；和第二嵌段在總電荷上基本上是中性的。在不同實施方案中，第一結構單元在正常生理pH ( S卩，大約生理pH)下為陽離子性 的，在正常生理PH下為陰離子性的，在正常生理pH下為中性的，或在正常生理pH下為兩性 離子性的。在一些實施方案中，共聚物的第一嵌段在正常生理PH下為聚陽離子性的，在正 常生理pH下為聚陰離子性的，在正常生理pH下為中性的，或在正常生理pH下為多兩性離 子性的。在另外的實施方案中，共聚物的第一嵌段在內體PH下具有與在正常生理pH下大 體相同的離子性質，例如，在內體PH下為聚陽離子性的，在內體pH下為聚陰離子性的，在內 體PH下為中性的，或在內體pH下為聚兩性離子性的。在一個方面，本發(fā)明涉及共聚物(例如，二嵌段共聚物)，其包含第一嵌段，其包含在正常生理pH下為陽離子性的第一結構單元；第二嵌段，其包含在正常生理pH下為陽離子性的并且可以與第一結構單元相同或不同的第二結構 單元；在正常生理pH下為陰離子性的第三結構單元；
疏水性增強部分，其中該疏水性增強部分共價連接至第二結構單元；或，該增強疏水性增強部分共價連接至第三結構單元；或，該疏水性增強部分包含在第二嵌段的第四結構單元中；或，上述結構的任何組合；和第二嵌段在總電荷上基本上是中性。在本發(fā)明的一個方面，第一結構單元包含陽離子氮種類(即，在正常生理pH下為 陽離子性的氮種類)。在本發(fā)明的一個方面，所述陽離子氮種類是銨種類。在本發(fā)明的一個 方面，第二結構單元與第一結構單元相同。在本發(fā)明的一個方面，所述陰離子種類包括羧酸 陰離子。在本發(fā)明的一個方面，第一嵌段還包括隨機散布在第一結構單元之間的電荷中性 的結構單元。在本發(fā)明的一個方面，第一和/或第二嵌段包含至少一個反應性或易于修飾 的基團。在本發(fā)明的一個方面，如果存在的話，則第四結構單元包括按重量計算占第二嵌段 的大約10%至大約60%。在某些實施方案中，第一聚合物嵌段大小為大約10，000道爾頓，或大約2，000道 爾頓至大約30，000道爾頓，或大約8，500道爾頓至大約13，000道爾頓。在一些實施方案 中，第一聚合物嵌段在絕對值上具有與待遞送的siRNA分子上的凈負電荷相似的凈正電 荷。在一些實施方案中，第二聚合物嵌段在分子量上與第一聚合物嵌段大致相等，或 是第一聚合物嵌段的大小的大約0. 2-5倍或大約1-3倍，并且在許多優(yōu)選實施方案中，第二 聚合物嵌段是第一聚合物嵌段的大小的大約2-3倍。在一些實施方案中，親水性的帶電荷的嵌段與至少一個核苷酸(包括多核苷酸， 例如siRNA)復合(在本文中可與例如通過一個或多個共價鍵、一個或多個離子相互作用、 其組合等與之“締合”或“連接”互換使用)。在本發(fā)明的一個方面，將多核苷酸嵌段通過任選地可切割的共價鍵連接至一個聚 合物嵌段。在本發(fā)明的一個方面，多核苷酸選自DNA、RNA和其天然及合成類似物。在本發(fā) 明的一個方面，多核苷酸是反義的。在本發(fā)明的一個方面，多核苷酸是RNA。在本發(fā)明的一 個方面，RNA選自mRNA、piRNA、miRNA和siRNA。在本發(fā)明的一個方面，RNA是siRNA。在本發(fā)明的一個方面，每一個結構單元獨立地從乙烯型單體(ethylenic monomer)衍生而來，共聚物的合成包括活性聚合。在本發(fā)明的一個方面，乙烯型單體是丙烯酸單體。在本文中在某些實施方案中提供了二嵌段共聚物，其具有化學式I
權利要求
1.一種共聚物，其包含(a)第一嵌段，其包含在正常生理PH下為親水性的第一結構單元；(b)第二嵌段，其包含(i)在正常生理PH下為陽離子性的并且可以與第一結構單元相同或不同的第二結構 單元；( )在正常生理PH下為陰離子性的第三結構單元；(iii)疏水性增強部分，其中該疏水性增強部分共價連接第二結構單元；該疏水性增強部分共價連接第三結構單元；該疏水性增強部分包含在第二嵌段的第四結構單元中；或其任何組合。
2.權利要求1的共聚物，其中第二嵌段在總電荷上基本為中性的。
3.權利要求1至2中任一項的共聚物，其中共聚物是二嵌段共聚物。
4.權利要求1至3中任一項的共聚物，其中第一結構單元是陽離子性的、陰離子性的、 中性的或兩性離子的。
5.權利要求4的共聚物，其中第一結構單元是陽離子性的。
6.權利要求1至5中任一項的共聚物，其中第一嵌段包含多個第一結構單元。
7.權利要求1至6中任一項的共聚物，其中第二嵌段包含多個第二結構單元、多個第三 結構單元和多個疏水性增強部分。
8.權利要求1至7中任一項的共聚物，其中所述正常生理pH是大約7.2至大約7. 4。
9.一種共聚物，其包含(a)第一嵌段，其包含在正常生理pH下為陽離子性的第一結構單元；(b)第二嵌段，其包含(i)在正常生理PH下為陽離子性的并且可以與第一結構單元相同或不同的第二結構 單元；( )在正常生理PH下為陰離子性的第三結構單元； (iii)疏水性增強部分，其中 該疏水性增強部分共價連接第二結構單元；或 該疏水性增強部分共價連接至第三結構單元；或 該疏水性增強部分包含在第二嵌段的第四結構單元中；或 其任何組合；和第二嵌段在總電荷上基本上是中性。
10.一種內體裂解性共聚物，其包含(a)第一嵌段，該第一嵌段為親水性嵌段；和 第二嵌段，該第二嵌段為膜去穩(wěn)定化疏水性嵌段，其包含 (i)在大約中性PH下為陰離子性的第一可帶電荷種類 ( )在大約中性PH下為陽離子性的第二可帶電荷種類。
11.一種內體裂解性共聚物，其包含(a)第一嵌段，該第一嵌段是包含在大約中性pH下為陽離子性的第一可帶電荷種類的親水性嵌段；(b)第二嵌段，該第二嵌段為膜去穩(wěn)定化的疏水性嵌段，其包含 (i)在大約中性PH下為陰離子性的第二可帶電荷種類；和( )在大約中性PH下為陽離子性的第三可帶電荷種類；和(c)與第一嵌段締合的寡核苷酸。
12.—種內體裂解性共聚物，其包含(a)第一嵌段，該第一嵌段為親水性嵌段，(b)第二嵌段，該第二嵌段是包含丙烯酸殘基或烷基丙烯酸殘基的膜去穩(wěn)定化疏水性 嵌段。
13.權利要求1至12的任一項的聚合物，其中第-
14.權利要求1至12的任一項的聚合物，其中第-大約30，000道爾頓。
15.權利要求1至12的任一項的聚合物，其中第一聚合物嵌段為大約8，500道爾頓至 大約13,000道爾頓。
16.權利要求1至15的任一項的聚合物，其中第二聚合物嵌段的分子量是第一聚合物 嵌段的分子量的大約1至3倍。
17.權利要求1、9、10、11或12至16中任一項的共聚物，其包含化學式I:-聚合物嵌段為大約10，000道爾頓。 -聚合物嵌段為大約2，000道爾頓至
18.權利要求13的共聚物，其中％是在正常生理pH下帶正電荷的殘基；在正常生理 PH下帶負電荷但在更低的pH下經歷質子化的殘基；在正常生理pH下為中性的殘基；或在 正常生理pH下為兩性離子性的殘基。
19.權利要求1、9、10、11或12中任一項的共聚物，其包括化學式II
20.權利要求1、9、10、11或12中任一項的共聚物，其包括化學式I
21.權利要求1、9、10、11或12中任一項的共聚物，其包括化學式II
22.包含化學式I的共聚物
23.權利要求18的共聚物，其中％是在正常生理pH下帶正電荷的殘基；在正常生理 PH下帶負電荷但在更低的pH下經歷質子化的殘基；在正常生理pH下為中性的殘基；或在 正常生理pH下為兩性離子性的殘基。
24.包括化學式II的共聚物
25.包括化學式II的共聚物
26.權利要求17至19或21至M中任一項的共聚物，其中I-A1-Y1-A是甲基丙烯酸 C1-6 二烷基氨基(C1-6)烷基酯，甲基丙烯酸C1-6烷基氨基C1-6烷基酯，丙烯酸氨基C1-6 烷基酯、乙基丙烯酸[ethaCrylate]Cl-6 二烷基氨基(C1-6)烷基酯、乙基丙烯酸C1-6烷基 氨基C1-6烷基酯、乙基丙烯酸氨基C1-6烷基酯、丙烯酸C1-6 二烷基氨基(C1-6)烷基酯、 丙烯酸C1-6烷基氨基(C1-6)烷基酯或丙烯酸氨基(C1-6)烷基酯的殘基。
27.權利要求17至19、21至M或沈中任一項的共聚物，其中R3-A2-Y2-A是甲基丙烯 酸C1-6 二烷基氨基(C1-6)烷基酯、甲基丙烯酸C1-6烷基氨基(C1-6)烷基酯、丙烯酸氨 基(C1-6)烷基酯、乙基丙烯酸C1-6 二烷基氨基(C1-6)烷基酯、乙基丙烯酸C1-6烷基氨基 (C1-6)烷基酯、乙基丙烯酸氨基(C1-6)烷基酯、丙烯酸C1-6 二烷基氨基(C1-6)烷基酯、丙 烯酸C1-6烷基氨基(C1-6)烷基酯或丙烯酸氨基(C1-6)烷基酯的殘基。
28.權利要求17至19、21至M或沈至27中任一項的共聚物，其中R4-A3-Y3-Q3是C1-6 烷基丙烯酸的殘基。
29.權利要求17至19、21至M或沈至觀中任一項的共聚物，其中K-A4-Y4-A是丙 烯酸C1-6烷基酯、甲基丙烯酸C1-C6烷基酯或乙基丙烯酸C1-C6烷基酯的殘基。
30.包括化學式III的共聚物
31.權利要求17至30中任一項的共聚物，其中ν w的比率為大約1 1至大約1 3。
32.權利要求1至31中任一項的共聚物，其中還包含治療劑。
33.權利要求32的共聚物，其中所述治療劑與所述共聚物締合。
34.權利要求33的共聚物，其中所述治療劑是siRNA。
35.權利要求33的共聚物，其中所述治療劑是多肽。
36.權利要求34或35中任一項的共聚物，其中所述治療劑共價地連接至所述共聚物。
37.權利要求34或35中任一項的共聚物，其中所述治療劑通過離子相互作用與所述共 聚物締合。
38.包含多種權利要求1至37中任一項的共聚物的組合物。
39.權利要求38的組合物，其中所述多種共聚物具有大約1.2的多分散性指數(PDI)。
全文摘要
本文中描述了共聚物以及制備和利用此類共聚物的方法。此類共聚物具有至少兩個嵌段具有在生理pH下是親水的至少一個單元的第一嵌段，和具有疏水性基團的第二嵌段。該第二嵌段還具有在大約生理pH下是陰離子性的基團的至少一個單元。所述共聚物可破裂細胞膜，包括細胞外膜、細胞內膜、囊泡、細胞器、內體、脂質體或紅細胞。優(yōu)選地，在某些情況下，共聚物破裂膜并且進入細胞內環(huán)境。在特定的實例中，共聚物是內體裂解性的。
文檔編號C12N15/11GK102083878SQ200980122888
公開日2011年6月1日 申請日期2009年5月13日 優(yōu)先權日2008年5月13日
發(fā)明者A·J·康弗汀, A·S·霍夫曼, A·加爾, C·L·杜瓦爾, D·貝諾伊特, P·S·斯泰頓, P·約翰遜 申請人:華盛頓大學, 菲澤爾克斯公司