專利名稱：：具有阿魏酸酯酶活性的多肽和編碼該多肽的多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
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發(fā)明內(nèi)容可來(lái)源于結(jié)灰青β(Penicilliumaurantiοgriseum)。具體而言，本發(fā)明涉及選自下組的具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少60%同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中等嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的核苷酸序列；和(d)包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽的變體。本發(fā)明還涉及選自下組的分離的多核苷酸，其編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽(a)多核苷酸，其編碼包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少60%同一性的氨基酸序列的多肽；(b)多核苷酸，其在至少中等嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)多核苷酸，其包含與SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的核苷酸序列；和(d)多核苷酸，其編碼包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽的變體。本發(fā)明還涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、重組表達(dá)載體、重組宿主細(xì)胞，和產(chǎn)生具有阿魏酸酯酶活性的多肽的方法。本發(fā)明還涉及降解包含阿魏酸的材料的方法。本發(fā)明還涉及如下的植物，其包含編碼所述具有阿魏酸酯酶活性的多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生上述具有阿魏酸酯酶的多肽的方法，包括(a)在有益于下述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼所述具有阿魏酸酯酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。定義阿魏酸酯酶活性在本文中術(shù)語(yǔ)“阿魏酸酯酶活性”定義為EC3.1.1.73(IUBMBEnzymeNomenclature)中的酶活性。阿魏酸酯酶催化4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基團(tuán)從酯化的糖(其在“天然”底物中通常為阿拉伯糖)的水解。乙酸對(duì)硝基苯酯(p-Nitrophenolacetate)和阿魏酸甲酯是較不良的底物。本發(fā)明的多肽具有SEQIDNO2的成熟多肽的阿魏酸酯酶活性的至少20%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%，并且甚至最優(yōu)選至少100%。所述活性使用在標(biāo)題為“確定阿魏酸酯酶活性”的部分描述的方法確定。分離的多肽術(shù)語(yǔ)“分離的多肽”用于本文中指從來(lái)源分離的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，如通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定的，所述多肽為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純。基本上純的多肽術(shù)語(yǔ)“基本上純的多肽”在本文表示多肽制備物，所述多肽制備物含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%,更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的(associated)其它多肽材料。因此，優(yōu)選所述基本上純的多肽按存在于制備物中的全部多肽材料的重量計(jì)是至少92%純，優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，更優(yōu)選至少98%純，甚至更優(yōu)選至少99%純，最優(yōu)選至少99.5%純，并且甚至最優(yōu)選100%純。本發(fā)明的多肽優(yōu)選是基本上純的形式，即所述多肽制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多肽材料。例如，這能夠通過(guò)如下實(shí)現(xiàn)通過(guò)公知的重組方法或通過(guò)經(jīng)典純化方法制備多肽。成熟多肽術(shù)語(yǔ)“成熟多肽”在本文中定義為以其在翻譯和任何翻譯后修飾(如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后的最終形式存在的具有阿魏酸酯酶活性的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述成熟多肽是SEQIDN0:2的氨基酸1-M9。成熟多肽編碼序列術(shù)語(yǔ)“成熟多肽編碼序列”在本文中定義為編碼具有阿魏酸酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的方面，成熟多肽編碼序列為SEQIDNO1的核苷酸152-901。同一性兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“同一性”來(lái)描述。就本發(fā)明而言，兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性程度是使用如EMBOSS程序包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000,TrendsinGenetics16:276-277)(優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48:443-453)來(lái)測(cè)定的。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計(jì)算的(相同的殘基XlOO)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))就本發(fā)明而言，兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的同一性程度使用如EMBOSS程序包(EMBOSSTheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等，2000，見(jiàn)上)(優(yōu)選版本3.0.0或更新的版本)的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和mmsch，1970，見(jiàn)上)測(cè)定。使用的可選參數(shù)是缺口產(chǎn)生罰分為10，缺口延伸罰分為0.5，和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)同一性”的Needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比同一性并且是如下計(jì)算的(相同的脫氧核糖核苷酸XlOO)/(比對(duì)的長(zhǎng)度-比對(duì)中的缺口總數(shù))同源序列術(shù)語(yǔ)“同源序列”在本文中定義為用SEQIDNO:2的桔灰青霉阿魏酸酯酶或其片段，在tfasty檢索(Pearson，W.R.，1999，于BioinformaticsMethodsandProtocols,S.Misener和S.A.Krawetz編，185—219頁(yè))中給出小于0.001的E值(或預(yù)期分?jǐn)?shù))的預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)。或者，術(shù)語(yǔ)“同源序列”定義為與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，且具有阿魏酸酯酶活性的氨基酸序列。多肽片段術(shù)語(yǔ)“多肽片段”在本文定義為從SEQIDNO2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的多肽；其中所述片段具有阿魏酸酯酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，片段含有SEQIDNO:2的成熟多肽或其同源序列的至少220個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選至少240個(gè)氨基酸殘基，甚至更優(yōu)選至少250個(gè)氨基酸殘基，并且最優(yōu)選至少255個(gè)氨基酸殘基。亞序列術(shù)語(yǔ)“亞序列(subsequence)”在本文中定義為從SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的5'和/或3'端缺失了一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))核苷酸的核苷酸序列；其中所述亞序列編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，亞序列含有SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或其同源序列的至少660個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少730個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選至少750個(gè)核苷酸，并且最優(yōu)選至少780個(gè)核苷酸。等位變體(allelicvariant)術(shù)語(yǔ)“等位變體”在本文中表示占據(jù)相同染色體基因座的基因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過(guò)突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無(wú)變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。分離的多核苷酸術(shù)語(yǔ)“分離的多核苷酸”用于本文中指從來(lái)源分離的多核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選的方面，如通過(guò)瓊脂糖電泳測(cè)定的，所述多核苷酸為至少純，優(yōu)選至少5%純，更優(yōu)選至少10%純，更優(yōu)選至少20%純，更優(yōu)選至少40%純，更優(yōu)選至少60%純，甚至更優(yōu)選至少80%純，并且最優(yōu)選至少90%純?；旧霞兊亩嗪塑账嵝g(shù)語(yǔ)“基本上純的多核苷酸”用于本文指多核苷酸制備物，其不含其它外來(lái)的或不期望的核苷酸，并且處于適合于在遺傳工程蛋白質(zhì)生產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計(jì)至多10%，優(yōu)選至多8%，更優(yōu)選至多6%，更優(yōu)選至多5%，更優(yōu)選至多4%，更優(yōu)選至多3%，甚至更優(yōu)選至多2%，最優(yōu)選至多1%，并且甚至最優(yōu)選至多0.5%的與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)，如啟動(dòng)子和終止子。優(yōu)選基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)至少90%純，優(yōu)選至少92%純，更優(yōu)選至少94%純，更優(yōu)選至少95%純，更優(yōu)選至少96%純，更優(yōu)選至少97%純，甚至更優(yōu)選至少98%純，最優(yōu)選至少99%，并且甚至最優(yōu)選至少99.5%純的。本發(fā)明的多核苷酸優(yōu)選為基本上純的形式，即所述多核苷酸制備物基本上(essentially)不含與其天然或重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來(lái)源的，或它們的任何組合。編碼序列當(dāng)用于本文中，術(shù)語(yǔ)“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白產(chǎn)物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通常由開(kāi)讀框決定，所述開(kāi)讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子如GTG和TTG開(kāi)始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的核苷酸序列。cDNA:術(shù)語(yǔ)“cDNA”在本文中定義為能夠通過(guò)反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的(initial)、初級(jí)的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過(guò)一系列的步驟加工然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。這些步驟包括通過(guò)稱為剪接的過(guò)程去除內(nèi)含子序列。因而源自mRNA的cDNA缺乏任何內(nèi)含子序列。核酸構(gòu)建體術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”用于本文指單鏈或雙鏈的核酸分子，所述核酸分子分離自天然存在的基因，或?qū)⑺龊怂岱肿右员緛?lái)不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修飾以含有核酸的區(qū)段或所述核酸分子是合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)“表達(dá)盒”同義。調(diào)控序列(controlsequence)術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”在本文定義為包括對(duì)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸表達(dá)是必需或有利的所有組分。各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各個(gè)調(diào)控序列對(duì)于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最少的情況，調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號(hào)。調(diào)控序列可以和目的為引入特異性限制位點(diǎn)的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的核苷酸序列編碼區(qū)的連接?？刹僮鞯剡B接術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”在本文表示這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對(duì)于多核苷酸序列的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)多肽編碼序列的表達(dá)。表達(dá)術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾和分泌。表達(dá)載體術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”在本文定義為線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。宿主細(xì)胞如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對(duì)于使用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的(susceptible)0修飾術(shù)語(yǔ)“修飾”在本文的意思是，對(duì)由SEQIDNO2的成熟多肽組成的多肽或其同源序列的任何化學(xué)修飾，以及對(duì)編碼這樣的多肽的DNA的遺傳操作。所述修飾可以是一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸側(cè)鏈的置換。人工變體當(dāng)用于本文中，術(shù)語(yǔ)“人工變體”的意思是具有阿魏酸酯酶活性的多肽，所述多肽由表達(dá)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的修飾的多核苷酸序列或其同源序列的生物體產(chǎn)生。所述修飾的核苷酸序列通過(guò)人為干預(yù)(humanintervention)，通過(guò)修飾公開(kāi)于SEQIDNO1的多核苷酸序列或其同源序列來(lái)獲得。發(fā)明詳述具有阿魏酸酯酶活性的多肽在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及包含下述氨基酸序列的分離的多肽，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽具有優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少65%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，甚至更優(yōu)選至少90%，甚至更優(yōu)選至少95%，且甚至更優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的成熟多肽相差十個(gè)氨基酸，優(yōu)選相差五個(gè)氨基酸，更優(yōu)選相差四個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選相差三個(gè)氨基酸，最優(yōu)選相差兩個(gè)氨基酸，并且甚至最優(yōu)選相差一個(gè)氨基酸。本發(fā)明的多肽優(yōu)選包含SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO:2的成熟多肽。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至對(duì)9，或其等位變體；或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段。在另一優(yōu)選的方面，多肽包含SEQIDNO2的氨基酸1至M9。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2的氨基酸序列或其等位變體，或它們的具有纖維素分解增強(qiáng)活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO2的成熟多肽組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDNO:2的氨基酸1至249或其等位變體，或它們的具有阿魏酸酯酶活性的片段組成。在另一優(yōu)選的方面，多肽由SEQIDN0:2的氨基酸1至249組成。在另一優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在優(yōu)選極低嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選低嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件、更優(yōu)選中-高嚴(yán)緊條件、甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件、和最優(yōu)選非常高嚴(yán)緊條件下與下列雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，(iii)(i)或(ii)的亞序列，或(iv)(i)、(ii)或(iii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈(J.Sambrook,E.F.Fritsch禾口T.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的亞序列含有至少100個(gè)連續(xù)的核苷酸或優(yōu)選至少200個(gè)連續(xù)的核苷酸。此外，所述亞序列可以編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDNO1的成熟多肽編碼序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。SEQIDNO1的核苷酸序列或其亞序列；以及SEQIDNO2的氨基酸序列或其片段，可用于設(shè)計(jì)核酸探針，以根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法從不同屬或種的菌株鑒定和克隆編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽的DNA。具體而言，可將這些探針用于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡方法與感興趣的屬或種的基因組或cDNA雜交，以鑒定并從其中分離相應(yīng)的基因。這些探針可明顯短于完整序列，但長(zhǎng)度上應(yīng)為至少14個(gè)，優(yōu)選至少25個(gè)，更優(yōu)選至少35個(gè)，并且最優(yōu)選至少70個(gè)核苷酸。然而，優(yōu)選所述核酸探針長(zhǎng)度上是至少100個(gè)核苷酸。例如，所述核酸探針長(zhǎng)度上可以是至少200個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少300個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少400個(gè)核苷酸，或最優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸。DNA和RNA探針二者均可使用。通常將探針標(biāo)記以檢測(cè)相應(yīng)的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)標(biāo)記)。將這些探針涵蓋于本發(fā)明中。因而，可從由這些其它菌株制備的基因組DNA或cDNA文庫(kù)中篩選DNA，所述DNA與上述探針雜交并且編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。可以通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，或通過(guò)其它分離技術(shù)分離來(lái)自這些其它菌株的基因組或其它DNA?？梢詫?lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA轉(zhuǎn)移至硝化纖維素(nitrocellulose)或其它合適的載體材料并且固定于其上。為了鑒定與SEQIDNO:1或其亞序列同源的克隆或DNA，將所述載體材料優(yōu)選用在Southern印跡中。9就本發(fā)明而言，雜交表示核苷酸序列在非常低至非常高的嚴(yán)緊條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述核酸探針對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列；包含SEQIDN0:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；或其亞序列?？墒褂美鏧射線片(X-rayfilm)檢測(cè)在這些條件下與核酸探針雜交的分子。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1的核苷酸152-901。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是編碼SEQIDNO:2的多肽的多核苷酸序列，或其亞序列。在另一優(yōu)選的方面，核酸探針是SEQIDNO:1。對(duì)于長(zhǎng)度至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，將非常低至非常高的嚴(yán)緊條件定義為在42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200yg/ml已剪切并且變性的鮭精DNA中，并且對(duì)于非常低和低嚴(yán)緊性為25%的甲酰胺、對(duì)于中和中-高嚴(yán)緊性為35%的甲酰胺、或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)緊性為50%的甲酰胺，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交和雜交最佳12至M小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)探針，使用2XSSC、0.2%SDS優(yōu)選在45°C(非常低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在50°C(低嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在55°C(中嚴(yán)緊性)，更優(yōu)選在60°C(中-高嚴(yán)緊性)，甚至更優(yōu)選在65°C(高嚴(yán)緊性)，并且最優(yōu)選在70°C(非常高嚴(yán)緊性)將載體材料最終洗滌三次，每次15分鐘。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將嚴(yán)緊條件定義為在比使用根據(jù)Bolton和McCarthy計(jì)算法(1962，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA48:1390)計(jì)算得出的Tm低大約5°C至大約10°C，在0.9MNaCl，0.09MTris-HClpH7.6,6mMEDTA,0.5%NP-40,IXDenhardt溶液，ImM焦磷酸鈉，ImM磷酸二氫鈉(sodiummonobasicphosphate)，0.ImMATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡步驟進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌最佳12至M小時(shí)。對(duì)于長(zhǎng)度大約15個(gè)核苷酸至大約70個(gè)核苷酸的短探針，將所述載體材料在6XSSC加0.1%SDS中洗滌一次15分鐘，并用6XSSC在比計(jì)算得出的Tm低5°C至10°C的溫度洗滌兩次，每次15分鐘。本發(fā)明還涉及由如下多核苷酸編碼的具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%，且甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性程度的核苷酸序列或由所述核苷酸序列組成，其編碼活性多肽。參見(jiàn)本文多核苷酸部分。本發(fā)明還涉及人工變體，所述人工變體包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(或幾個(gè))氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽；或其同源序列。優(yōu)選地，氨基酸改變對(duì)性質(zhì)是較不重要的(ofaminornature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性；通常為1至大約30個(gè)氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個(gè)殘基的小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或其它功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(poly-histidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結(jié)合域(bindingdomain)。保守取代的實(shí)例是在以下組之內(nèi)堿性氨基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、10酸性氨基酸組(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸組(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族氨基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變比活性(specificactivity)的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的，并且由例如H.Neuratt^PR.L.Hill,1979，于TheProteins,AcademicPress,NewYork中描述。最普遍發(fā)生的交換是Ala/^er、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾口Asp/Gly。除了20個(gè)基本氨基酸，非基本氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2_氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸殘基。有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸殘基?！胺翘烊话被帷痹诘鞍踪|(zhì)合成后已經(jīng)過(guò)修飾，和/或在它們的側(cè)鏈具有不同于基本氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸能夠以化學(xué)方法合成，并且優(yōu)選是商業(yè)上可得到的，包括六氫吡啶羧酸(pipecolicacid)、噻唑燒羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。可供選擇的是，氨基酸改變具有這樣的性質(zhì)以使多肽的物理化學(xué)性質(zhì)改變。例如，氨基酸改變可改進(jìn)多肽的熱穩(wěn)定性，改變底物特異性，改變最適PH等。能夠根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)來(lái)鑒定親本多肽中的必需氨基酸。在后一技術(shù)中，將單一丙氨酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基，并且測(cè)試所得突變分子的生物活性(即，阿魏酸酯酶活性)以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。同樣參見(jiàn)Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理分析而測(cè)定，如通過(guò)以下這些技術(shù)如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，連同推定的接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)例如deVos等，1992，Science255=306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等，1992，F(xiàn)EBSLett.309:59_64。必需氨基酸的身份(identity)也能夠從與多肽的同一性分析來(lái)推斷，所述多肽與根據(jù)本發(fā)明的多肽相關(guān)。能夠使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，然后是有關(guān)的篩選方法，例如那些由Reidhaar-Olson禾ΠSauer,1988，Science241:53-57；Bowie禾ΠSauer,1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO95/17413；或W095/2^25公開(kāi)的那些方法來(lái)進(jìn)行并測(cè)試單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失、和/或插入。能夠使用的其它方法包括易錯(cuò)PCR、噬菌體展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30:10832-10837；美國(guó)專利5，223，409號(hào)；WO92/06204)和區(qū)域定向的誘變(Derbyshire等，1986，Gene46:145；Ner等，1988，DNA7:127)。誘變/改組方法能夠與高通量、自動(dòng)化的篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的、誘變的多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。能夠從宿主細(xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的DNA分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許快速測(cè)定感興趣的多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性，并且能夠應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。SEQIDNO2的成熟多肽(如SEQIDNO2的氨基酸1到M9)的氨基酸取代、缺失和/或插入的總數(shù)是10，優(yōu)選9，更優(yōu)選8，更優(yōu)選7，更優(yōu)選至多6，更優(yōu)選5，更優(yōu)選4，甚至更優(yōu)選3，最優(yōu)選2，并且甚至最優(yōu)選1。具有阿魏酸酯酶活性的多肽的來(lái)源本發(fā)明的多肽可以獲得自任何屬的微生物。就本發(fā)明而言，用于本文與給定的來(lái)源有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“獲得自”，意思是核苷酸序列編碼的多肽由所述來(lái)源產(chǎn)生，或由其中插入了來(lái)自所述來(lái)源的核苷酸序列的菌株產(chǎn)生。在優(yōu)選的方面，獲得自給定來(lái)源的多肽是胞外分泌的。本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽可以是細(xì)菌多肽。例如，所述多肽可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌多肽如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、梭菌屬(Clostridium)、地芽孢桿菌屬(GecAacillus)或海洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性；或革蘭氏陰性細(xì)菌多肽，如大腸桿菌、假單胞菌屬(pseudomonas)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、螺桿菌屬(Helicobacter)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、泥桿菌屬(Ilyobacter)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)或脲原體屬⑴reaplasma)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)、!牟lif(Bacillusamyloliquefaciens)lif(Bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、嗜熱月旨肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)或蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)多肽。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的似馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)、酉良月農(nóng)鏈球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(Streptococcusuberis)或馬鏈球菌獸痕亞禾中(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多月太。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)、除蟲(chóng)鏈霉菌(Streptomycesavermitilis)、天藍(lán)鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(Streptomycesgriseus)或淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)多月太。本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更優(yōu)選酵母多肽如假絲酵母屬(Candida)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉屬(Yarrowia)多肽，其具有阿魏酸酯酶活性；或更優(yōu)選絲狀真菌多肽如枝頂孢霉屬(Acremonium)、傘菌屬(Agaricus)、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、短梗霉屬(Aureobasidium)、Botryospaeria、擬錯(cuò)菌屬(Ceriporiopsis)、毛_殼屬(Chaetomidium)、金抱子菌屬(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼傘屬(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊殼屬(Corynascus)、隱叢赤殼菌屬(Cryphonectria)、隱球菌屬(Cryptococcus)、色二孢屬(Diplodia)、黑耳屬(Exidia)、Filibasidium,鐮孢屬(Fusarium)、赤霉屬(Gibberella)、全鞭毛蟲(chóng)屬(Holomastigotoides)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、耙齒菌屬(Irpex)>MSM(Lentinula)>Leptospaeria>^lifM(Magnaporthe)>Melanocarpus>多孔菌屬(Meripilus)、毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、新考瑪脂霉屬(Neocallimastix)、脈抱菌屬(Neurospora)、擬青霉屬(Paecilomyces)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、瘤胃壺菌屬(Piromyces)、Poitrasis、假黑盤(pán)菌屬(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉屬(Rhizomucor)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、柱頂孢屬(Scytalidium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、彎頸霉屬(Tolypocladium)、木霉屬(Trichoderma)、長(zhǎng)毛盤(pán)菌屬(Trichophaea)、輪枝孢屬(Verticillium)、包腳菇屬(Volvariella)或炭角菌屬(Xylaria)多肽，所述多肽具有阿魏酸酯酶活性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(Saccharomycesnorbensis)或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多月太。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的解纖維枝頂孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、曰本曲霉(Aspergillusjaponicus)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、嗜角質(zhì)金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、租金抱子菌(Chrysosporiumpannicola)、ChrysosporiumqueenslandicumΛChrysosporiumzonatum、桿抱狀德抱(Fusariumbactridioides)、禾谷德抱(Fusariumcerealis)、庫(kù)威,廉抱(Fusariumcrookwellense)、大刀,廉抱(Fusariumculmorum)、禾本禾斗德抱(Fusariumgraminearum)、禾赤德抱(Fusariumgraminum)、異抱德抱(Fusariumheterosporum)、合歡木德抱(Fusariumnegundi)、尖德抱(Fusariumoxysporum)、多枝德抱(Fusariumreticulatum)、粉紅德抱(Fusariumroseum)、接骨木德抱(Fusariumsambucinum)、膚色德抱(Fusariumsarcochroum)、擬分枝抱德抱(Fusariumsporotrichioides)、硫色,廉抱(Fusariumsulphureum)、圓德抱(Fusariumtorulosum)、擬絲抱,廉抱(Fusariumtrichothecioides)、壤片德抱(Fusariumvenenatum)、灰腐質(zhì)霉(Humicolagrisea)、特異腐質(zhì)毒(Humicolainsolens)、疏棉狀腐質(zhì)毒(Humicolalanuginosa)、白奉巴齒菌(Irpexlacteus)、^■€#(Mucormiehei)、口f%gig_(Myceliophthorathermophila)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、繩狀青霉(Penicilliumfuniculosum)、產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黃抱平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、哈茨木導(dǎo)(Trichodermaharzianum)、康寧木霉(Trichodermakoningii)、長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或綠色木霉(Trichodermaviride)多肽。在另一優(yōu)選的方面，所述多肽是青霉屬菌種的多肽。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，所述多肽是具有阿魏酸酯酶活性的桔灰青霉多肽。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，所述多肽是包含SEQIDNO:2的成熟多肽的多肽。可理解的是對(duì)于前述的種，本發(fā)明包含完全和不完全階段(perfectandimperfectstates)，和其它分類學(xué)的等同物(equivalent)，例如無(wú)性型(anamorph)，而無(wú)論它們已知的種名。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)容易地識(shí)別適合的等同物的身份(identity)。此外，可以使用上述的探針從其它來(lái)源，包括從自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分離的微生物鑒定和獲得這些多肽。用于從天然生境(habitat)分離微生物的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。隨后可通過(guò)相似地篩選這種微生物的基因組或cDNA文庫(kù)來(lái)獲得所述多核苷酸。一旦用所述探針檢測(cè)到編碼多肽的多核苷酸序列，就能夠使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的技術(shù)將所述多核苷酸分離或克隆(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，1989，見(jiàn)上)。本發(fā)明的多肽還包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中將另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通過(guò)將編碼另一個(gè)多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本發(fā)明的核苷酸序列(或其部分)來(lái)產(chǎn)生融合的多肽。產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，并包括連接編碼多肽的編碼序列以使它們?cè)陂喿x框中，并且使所述融合多肽的表達(dá)在相同啟動(dòng)子和終止子的控制下。融合多肽還可以包括切割位點(diǎn)。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位點(diǎn)，從融合蛋白釋放具有阿魏酸酯酶活性的多肽。切割位點(diǎn)的實(shí)例包括，但不限于，Kex2位點(diǎn)，其編碼二肽Lys-Arg(Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-76；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-WiIson等，1997,Appl.Environ.Microbiol.633488-3493；Ward等，1995，Biotechnology13:498—503;禾口Contreras等，1991，Biotechnology9:378-381)；Ile_(Glu或Asp)-Gly-Arg位點(diǎn)，其在精氨酸殘基后通過(guò)因子X(jué)a蛋白酶切割(Eaton等，1986，Biochem.25:505-512)；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys位點(diǎn)，其在賴氨酸后通過(guò)腸激酶切割(Collins-fcicie等，1995，Biotechnology13:982-987)；His-Tyr-Glu位點(diǎn)或His-Tyr-Asp位點(diǎn)，其通過(guò)GenenaseI切割(Carter等，1989，ProteinsStructure,Function,andGenetics6:240-248)；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser位點(diǎn)，其在Arg后通過(guò)凝血酶切割(Stevens，2003，DrugDiscoveryWorld4:35-48)；Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly位點(diǎn)，其在Gln后通過(guò)TEV蛋白酶切割Gtevens，2003，見(jiàn)上)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位點(diǎn)，其在Gln后通過(guò)遺傳工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，見(jiàn)上)。多核苷酸本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含編碼本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由該核苷酸序列組成。在一個(gè)優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO=I或由SEQIDNO=I組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列或由SEQIDNO=I的成熟多肽編碼序列組成。在另一優(yōu)選的方面，核苷酸序列包含SEQIDNO:1的核苷酸152-901或由SEQIDNO:1的核苷酸152-901組成。本發(fā)明還包含編碼如下多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQIDNO:2的氨基酸序列或其成熟多肽組成；由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，所述核苷酸序列不同于SEQIDNO:1或其成熟多肽編碼序列。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:1的亞序列，所述亞序列編碼具有阿魏酸酯酶活性的SEQIDNO2的片段。本發(fā)明還涉及突變的多核苷酸，其在SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變或由具有至少一個(gè)突變的SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列組成，其中突變的核苷酸序列編碼SEQIDNO2的成熟多肽。用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，且包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合?？赏ㄟ^(guò)例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特性的克隆DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)從這種基因組DNA克隆本發(fā)明的多核苷酸。參見(jiàn)，例如，Innis等，1990，PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增方法，如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、連接活化轉(zhuǎn)錄(LAT)和基于核苷酸序列的擴(kuò)增(NASBA)。可以從青霉屬菌種的菌株，或另外的或相關(guān)的生物體克隆所述多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽編碼區(qū)的等位基因變體或種變體(speciesvariant)。本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包含下述核苷酸序列或由其組成，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有優(yōu)選至少60%、更優(yōu)選至少65%、更優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少85%、甚至更優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至少95%、并甚至最優(yōu)選至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性程度，所述多核苷酸編碼活性多肽。修飾編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列對(duì)于合成與所述多肽基本上相似的多肽可為必需的。術(shù)語(yǔ)與所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。這些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于從其天然來(lái)源分離的多肽，例如，比活性、熱穩(wěn)定性、最適PH等方面不同的人工變體?？梢栽谧鳛镾EQIDNO:1的成熟多肽編碼序列存在的核苷酸序列，例如其亞序列的基礎(chǔ)上，和/或通過(guò)引入如下核苷酸取代來(lái)構(gòu)建變體序列所述取代不產(chǎn)生由核苷酸序列編碼的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲產(chǎn)生酶的宿主生物體的密碼子選擇；或者所述取代可產(chǎn)生不同的氨基酸序列。關(guān)于核苷酸取代的概述，參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ord等，1991，ProteinExpressionandPurification2:95一107。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這些取代能夠在對(duì)于分子功能重要的區(qū)域之外進(jìn)行，并且仍然產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于由本發(fā)明的分離的多核苷酸編碼的多肽活性關(guān)鍵的并且因此優(yōu)選不進(jìn)行取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法，如定位誘變或丙氨酸分區(qū)誘變(參見(jiàn)，例如，Cunningham和Wells，1989，見(jiàn)上)來(lái)鑒定。在后一技術(shù)中，將突變引入到分子中的每個(gè)荷正電的殘基處，并且測(cè)試所得突變分子的阿魏酸酯酶活性，以鑒定對(duì)于所述分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。底物-酶相互作用的位點(diǎn)也能夠通過(guò)分析三維結(jié)構(gòu)測(cè)定，通過(guò)如核磁共振分析、晶體學(xué)或光親和標(biāo)記這樣的技術(shù)來(lái)測(cè)定(參見(jiàn)，例如，deVos等，1992，見(jiàn)上；Smith等，1992，見(jiàn)上；Wlodaver等，1992，見(jiàn)上)。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸在非常低嚴(yán)緊條件下，優(yōu)選低嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中嚴(yán)緊條件，更優(yōu)選中-高嚴(yán)緊條件，甚至更優(yōu)選高嚴(yán)緊條件，并且最優(yōu)選非常高的嚴(yán)緊條件下，與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，()包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或()的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈，或它們的等位變體和亞序列(Sambrook等，1989，同上)，如本文所定義的。在一個(gè)優(yōu)選的方面，互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDNO1的成熟多肽編碼序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。本發(fā)明還涉及通過(guò)如下獲得的分離的多核苷酸(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高嚴(yán)緊條件下，將DNA的群體與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；和(b)分離雜交的多核苷酸，其編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述互補(bǔ)鏈?zhǔn)荢EQIDNO=I的成熟多肽編碼序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。核酸構(gòu)建體本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述分離的多核苷酸與一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))調(diào)控序列可操作地連接，所述調(diào)控序列在合適的宿主細(xì)胞中在與該調(diào)控序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)?？梢杂迷S多方式操作編碼本發(fā)明多肽的分離的多核苷酸以供多肽的表達(dá)。依賴于表達(dá)載體，在將多核苷酸的序列插入載體之前對(duì)其進(jìn)行操作可能是理想的或必需的。使用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。調(diào)控序列可以是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列，其是由用于表達(dá)編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞識(shí)別的核苷酸序列。啟動(dòng)子序列含有介導(dǎo)多肽的表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因獲得。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄，特別是在細(xì)菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下述獲得的啟動(dòng)子大腸桿菌Iac操縱子、天藍(lán)鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢桿菌α_淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(ViIla-Kamaroff等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:3727-3731),\)JsRtac(DeBoer1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA80:21—25)。另外的啟動(dòng)子在〃Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"TScientificAmerican，1980，242:74-94中；和在Sambrook等，1989，見(jiàn)上中描述。用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的合適啟動(dòng)子的實(shí)例是從下列酶的基因獲得的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(lihizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、鑲片鐮孢Daria(WC)00/56900)、鑲片鐮孢Quirm(W000/56900)、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(W096/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶I、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶II、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶III、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶IV、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi啟動(dòng)子(來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的啟動(dòng)子的雜合體)；和它們的突變的、截短的和雜合的啟動(dòng)子。在酵母宿主中，有用的啟動(dòng)子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(GALl)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH1，ADH2/GAP)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)、釀酒酵母金屬硫蛋白(CUPl)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的啟動(dòng)子由Romanos等，1992,Yeast8:423-488描述。調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。所述終止子序列與編碼所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地連接?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞優(yōu)選的終止子從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細(xì)胞色素C(CYCl)和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞其它有用的終止子由Romanos等，1992，見(jiàn)上描述。調(diào)控序列還可以是合適的前導(dǎo)序列，其是對(duì)于宿主細(xì)胞的翻譯重要的mRNA非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列可操作地連接于編碼多肽的核苷酸序列的5’-末端?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何前導(dǎo)序列用在本發(fā)明中。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的前導(dǎo)序列從如下酶的基因獲得釀酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(ADH2/GAP)。調(diào)控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是與核苷酸序列的3，末端可操作地連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時(shí)，宿主細(xì)胞將其識(shí)別為向轉(zhuǎn)錄的mRNA添加聚腺苷殘基的信號(hào)?？梢詫⒃谒x宿主細(xì)胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本發(fā)明中使用。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞優(yōu)選的聚腺苷酸化序列從如下酶的基因獲得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和aierman，1995，MolecularCellularBiology15:5983-5990描述。調(diào)控序列還可以是信號(hào)肽編碼序列，其編碼與多肽的氨基末端相連的氨基酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。核苷酸序列的編碼序列5’端可固有地包含信號(hào)肽編碼序列，該信號(hào)肽編碼序列與編碼分泌多肽的編碼序列區(qū)段一起天然地連接在翻譯閱讀框中。或者，編碼序列5’端可含有對(duì)于所述編碼序列為外源的信號(hào)肽編碼序列。外源信號(hào)肽編碼序列在編碼序列不天然地含有信號(hào)肽編碼序列時(shí)可為必需的。或者，外源信號(hào)肽編碼序列可以簡(jiǎn)單地取代天然信號(hào)肽編碼序列以增強(qiáng)多肽的分泌。然而，指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入所選宿主細(xì)胞的分泌途徑(即，分泌至培養(yǎng)基中)的任何信號(hào)肽編碼序列可在本發(fā)明中使用。對(duì)于細(xì)菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼17序列芽孢桿菌屬NCIB11837產(chǎn)麥芽糖淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT，nprS,nprM)和枯草芽孢桿菌prsA。另外的信號(hào)肽由Simonen和Palva，1993，MicrobiologicalReviews57109-137描述。對(duì)于絲狀真菌宿主細(xì)胞有效的信號(hào)肽編碼序列是從如下酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶V和疏棉狀腐質(zhì)霉脂肪酶。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞有用的信號(hào)肽從釀酒酵母α因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因獲得。其它有用的信號(hào)肽編碼序列由Romanos等，1992，見(jiàn)上描述。調(diào)控序列還可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽稱為酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情況下稱為酶原(zymogen))0前(多)肽通常是無(wú)活性的并且能夠通過(guò)從前多肽催化或自催化切割所述前肽而轉(zhuǎn)化為成熟活性多肽?？梢詮目莶菅挎邨U菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprT)、釀酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜熱毀絲霉漆酶(W095/33836)的基因獲得前肽編碼序列。當(dāng)信號(hào)肽和前肽序列二者均出現(xiàn)在多肽的氨基末端時(shí)，使前肽序列的位于緊接著(nextto)多肽氨基末端，并且使信號(hào)肽序列的位于緊接著前肽序列的氨基末端。同樣理想的是添加調(diào)節(jié)序列，其允許相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例是引起基因表達(dá)響應(yīng)化學(xué)或物理刺激物，包括調(diào)節(jié)化合物的存在而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些系統(tǒng)。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用ADH2系統(tǒng)或GALl系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶啟動(dòng)子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子作為調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列的其它實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因，和以重金屬(withheavymetal)擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼多肽的核苷酸序列與調(diào)節(jié)序列可操作地連接。表達(dá)載體本發(fā)明還涉及重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。本文所述的多種核酸和調(diào)控序列可以結(jié)合在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以包括一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))方便的限制位點(diǎn)以允許在這些位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的核苷酸序列?？晒┻x擇的是，可以通過(guò)在適當(dāng)?shù)挠糜诒磉_(dá)的載體中插入包含所述序列的核苷酸序列或核酸構(gòu)建體來(lái)表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸序列。在制備表達(dá)載體的過(guò)程中，將編碼序列置于載體中，從而將該編碼序列與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)用調(diào)控序列可操作地連接。重組表達(dá)載體可以是任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)，其能夠方便地進(jìn)行重組DNA步驟，并且能夠產(chǎn)生核苷酸序列的表達(dá)。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體(entity)存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體(minichromosome)或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復(fù)制的手段(means)?；蛘?，載體可以是一種當(dāng)被引入宿主細(xì)胞中時(shí)，整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單獨(dú)的載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒，其共同含有待引入宿主細(xì)胞基因組的完整DNA(totalDNA)，或可以使用轉(zhuǎn)座子(transposon)。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有一個(gè)或多個(gè)(或幾個(gè))選擇性標(biāo)記，其允許簡(jiǎn)單選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的細(xì)胞。選擇性標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性(prototrophytoauxotrophs)等。細(xì)菌選擇性標(biāo)記的實(shí)例是來(lái)自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性的標(biāo)記，所述抗生素抗性如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性。對(duì)于酵母宿主細(xì)胞合適的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPl和URA3。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草銨膦(phosphinothricin)乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niaD(硝酸還原酶)(nitratereductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase),sC(硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它們的等同物。優(yōu)選用在曲霉屬細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因禾口吸水鏈霄菌(Streptomyceshygroscopicus)的bar基因。本發(fā)明的載體優(yōu)選含有元件，其允許載體整合入宿主細(xì)胞基因組或允許載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組自主復(fù)制。為了整合入宿主細(xì)胞基因組，載體可依賴編碼多肽的多核苷酸的序列或用于通過(guò)同源或非同源重組整合入基因組的任何其它載體元件?；蛘?，載體可以含有額外的核苷酸序列，用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組整合入宿主細(xì)胞基因組染色體中的精確位置。為了增加在精確位置整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選含有足夠數(shù)量的核酸，如100至10，000堿基對(duì)，優(yōu)選400至10，000堿基對(duì)，并且最優(yōu)選800至10，000堿基對(duì)，其與相應(yīng)的目標(biāo)序列具有高度同一性以增強(qiáng)同源重組的概率。整合元件可以是任何序列，其與宿主細(xì)胞基因組中的目標(biāo)序列同源。此外，整合元件可以是非編碼或編碼的核苷酸序列。另一方面，可以將載體通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。為了自主復(fù)制，載體可以還包含復(fù)制起點(diǎn)，其使載體能夠在所述的宿主細(xì)胞中自主地復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)可以是介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子(r印licator)，其在細(xì)胞中發(fā)揮功能。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”在本文定義為能夠使質(zhì)?；蜉d體體內(nèi)復(fù)制的核苷酸序列。細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌中復(fù)制的質(zhì)粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的復(fù)制起點(diǎn)，和允許在芽孢桿菌屬中復(fù)制的質(zhì)粒pUBllO、pE194、pTA1060和ρΑΜβ1的復(fù)制起點(diǎn)。用于酵母宿主細(xì)胞中的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是2微米復(fù)制起點(diǎn)，ARSl,ARS4，ARSl和CEN3的組合，和ARS4和CEN6的組合。在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是AMAl和ANSI(Gems等，1991，Gene98:61-67;Cullen等，1987，NucleicAcidsResearch15:9163-9175；WO00/24883)。分離AMAl基因和構(gòu)建包含該基因的質(zhì)粒或載體能夠根據(jù)公開(kāi)于WO00/24883中的方法完成?？梢詫⒍嘤谝粋€(gè)拷貝的本發(fā)明的多核苷酸插入宿主細(xì)胞以增加基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。多核苷酸拷貝數(shù)的增加可通過(guò)如下方法獲得將至少一個(gè)額外拷貝的序列整合入宿主細(xì)胞基因組，或?qū)⒖蓴U(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因包括于多核苷酸，其中可通過(guò)在合適的選擇劑(selectableagent)存在下培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)選擇含有選擇性標(biāo)記基因的擴(kuò)增拷貝，從而也含有多核苷酸的額外拷貝的細(xì)胞。用于連接上述元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如，Sambrook等，1989，見(jiàn)上)。宿主細(xì)胞本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的分離的多核苷酸，將所述重組宿主細(xì)胞有利地用于多肽的重組產(chǎn)生。將包含本發(fā)明的多核苷酸的載體引入宿主細(xì)胞從而將所述載體作為染色體整合體或作為自復(fù)制的染色體外載體保持，如前文所述。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包含親本細(xì)胞的任何子代，其因?yàn)樵趶?fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變而與該親本細(xì)胞不同。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上會(huì)依賴于編碼多肽的基因及其來(lái)源。宿主細(xì)胞可以是在本發(fā)明的多肽的重組產(chǎn)生中有用的任何細(xì)胞，例如，原核或真核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞可以是任何革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌包括但不限于，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于，大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細(xì)菌宿主細(xì)胞可以是任何芽孢桿菌細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的芽孢桿菌屬細(xì)胞包括但不限于，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是地衣芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是枯草芽孢桿菌細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈球菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的鏈球菌屬細(xì)胞包括但不限于，似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是似馬鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是釀膿鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是乳房鏈球菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是馬鏈球菌獸瘟亞種細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞還可以是任何鏈霉菌屬細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施中有用的鏈霉菌屬細(xì)胞包括但不限于，不產(chǎn)色鏈霉菌、除蟲(chóng)鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是不產(chǎn)色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是除蟲(chóng)鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是天藍(lán)鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是灰色鏈霉菌細(xì)胞。在另一個(gè)優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌細(xì)胞。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到芽孢桿菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Chang和Cohen，1979，MolecularGeneralGenetics168:111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見(jiàn)，例如，Young禾口Spizizen，1961，JournalofBacteriology81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，JournalofMolecularBiology56:209-221)，電穿孔(參見(jiàn)，例如，Shigekawa和Dower,1988，Biotechniques6:742-751)或接合(參見(jiàn)，例如，Koehler和Thorne，1987，JournalofBacteriology169:5271—5278)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到大腸桿菌細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Hanahan,1983，J.Mol.Biol.166:557-580)或電穿孔(參見(jiàn)，例如，Dower等，1988，NucleicAcidsRes.166127-6145)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈霉菌屬細(xì)胞例如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(參見(jiàn)，例如，Gong等，2004，R)liaMicrobiol.(Praha)49:399-405)，接合(參見(jiàn)，例如，Mazodier等，1989，J.Bacteriol.171:3583-3585)，或轉(zhuǎn)導(dǎo)(參見(jiàn)，例如，Burke等，2001，Proc.Natl.AcadSci.USA98:6289-6294)?？赏ㄟ^(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到假單胞菌屬細(xì)胞例如電穿孔(參見(jiàn)，例如，Choi等，2006，J.Microbiol.Methods64:391-397)或接合(參見(jiàn)，例如，Pinedo和Smets，2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通過(guò)如下方法實(shí)現(xiàn)將DNA引入到鏈球菌屬細(xì)胞例如天然感受態(tài)(naturalcompetence)(參見(jiàn)，例如，Perry和Kuramjtsu，1981，hfect.Immun.321295_1四7)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)，例如，Catt和Jollick,1991，Microbios.68:189-207)，電穿孔(參見(jiàn)，例如，Buckley等，1999，Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(參見(jiàn)，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用任何本領(lǐng)域已知的將DNA引入宿主細(xì)胞的方法。宿主細(xì)胞還可以是真核生物，如哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)、植物或真菌細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的方面，宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞?！罢婢庇迷诒疚陌ㄒ韵麻T(mén)子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)禾口接合菌門(mén)(Zygomycota)(如由Hawksworth等，于AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第八版，1995，CABInternational,UniversityPress，Cambridge，UK中所定義)以及卵菌門(mén)(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，見(jiàn)上，171頁(yè)中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等，1995，見(jiàn)上)。在一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞?！敖湍浮庇迷诒疚陌óa(chǎn)子囊酵母(ascosporogenousyeast)(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口屬于半知菌類(FungiImperfecti)(芽抱綱(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分類在未來(lái)可能改變，就本發(fā)明而言，會(huì)將酵母定義為如BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,禾口Davenport,R.R.編，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所述。在一個(gè)甚至更加優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或西洋蓍霉屬細(xì)胞。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是卡爾酵母、釀酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母或卵形酵母細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，酵母宿主細(xì)胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowialipolytica)細(xì)胞。在另一個(gè)更優(yōu)選的方面，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞?！敖z狀真菌”包括真菌門(mén)(Eumycota)和卵菌門(mén)的亞門(mén)(如由Hawksworth等，1995，見(jiàn)上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特征在于由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖組成的菌絲體壁。通過(guò)菌絲延伸進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過(guò)單細(xì)胞菌體的出芽生殖(budding)進(jìn)行，而碳分解代謝可以是發(fā)酵的。在一個(gè)甚至更優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(Bjerkandera)、擬蠟菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬(Coprinus)、革蓋菌屬(Coriolus)、隱球菌屬、Fi1ibasidium、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、Malbrancea、毛霉屬、毀絲霉屬、新考瑪脂霉屬、脈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Wilebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(Pleurotus)、裂褶菌屬、踝節(jié)菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(Trametes)或木霉屬細(xì)胞。在一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是泡盛曲霉、煙曲霉、臭曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉或米曲霉細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是桿孢狀鐮孢、禾谷鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾本科鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢或鑲片鐮孢細(xì)胞。在另一個(gè)最優(yōu)選的方面，絲狀真菌宿主細(xì)胞是黑刺煙管菌(Bjerkanderaadusta)>zFiffllif(Ceriporiopsisaneirina)>zFifa|1>Ceriporiopsiscaregiea>Ceriporiopsisgilvescens>Ceriporiopsispannocinta>Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、蟲(chóng)擬M菌(Ceriporiopsissubvermispora)、B譽(yù)角質(zhì)金包子菌、Chrysosporiumlucknowense、熱帶金抱子菌、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、IS金包子菌、Chrysosporiumqueenslandicum>Chrysosporiumzonatum、灰蓋鬼傘(Coprinuscinereus)、毛革蓋菌(Coriolushirsutus)、特異腐質(zhì)霉、疏棉狀腐質(zhì)霉、Malbrancheacirmamonea、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙脈孢菌、桔灰青霉、產(chǎn)紫青霉、黃子包平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、_畐射射脈菌(Phlebiaradiata)、朿Ij#偵Ij耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉、長(zhǎng)絨毛栓菌(Trametesvillosa)、變色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉或綠色木霉細(xì)胞。可以將真菌細(xì)胞通過(guò)涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁重建的方法以本身公知的方式轉(zhuǎn)化。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的合適方法在EP238023和Yelton等，1984，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮孢屬菌種的合適方法由Malardier等，1989，Gene78:147-156和WO96/00787描述?？梢允褂糜扇缦挛墨I(xiàn)描述的方法轉(zhuǎn)化酵母=Becker和Guarente，于Abelson,J.N.禾口Simon,Μ.I.編，GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,182-187頁(yè)，AcademicPress,Inc.,NewYork；Ito等，1983,JournalofBacteriology153:163；禾口Hinnen等，1978,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA75:1920o產(chǎn)生方法本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述細(xì)胞是青霉屬的，優(yōu)選為屬于桔灰青霉菌種的菌株，其細(xì)胞能夠在允許所述酶產(chǎn)生22的條件下產(chǎn)生所述多肽，并從培養(yǎng)物回收所述酶。這些種的菌株在許多培養(yǎng)物保藏機(jī)構(gòu)對(duì)于公眾能夠容易地取得，所述保藏機(jī)構(gòu)如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(theAmericanTypeCultureCollection)(ATCC)、德意志微生物禾口細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)(DSM)、真菌菌種保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures)(CBS)和農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)專利培養(yǎng)物保藏中心北區(qū)研究中心(AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection,NorthernRegionalResearchCenter)(NRRL)。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)如本文所述的重組宿主細(xì)胞；和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列或同源序列，和(b)回收所述多肽。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含突變核苷酸序列，其在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中具有至少一個(gè)突變，其中所述突變核苷酸序列編碼多肽，所述多肽包含SEQIDNO2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成，和(b)回收所述多肽。在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過(guò)在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌到培養(yǎng)基中，其能夠從細(xì)胞裂解物(Iysate)回收?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的對(duì)于所述多肽是特異性的方法來(lái)檢測(cè)多肽。這些檢測(cè)方法可包括特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，酶測(cè)定法(enzymeassay)可用于測(cè)定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過(guò)常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。本發(fā)明的多肽可以通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的方法純化以獲得基本上純的多肽，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(pr印arative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS_PAGE或提取(參見(jiàn)，例如，ProteinPurification，J.-C.Janson禾口LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。植物本發(fā)明還涉及植物，例如，轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其包含分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼本發(fā)明的具有阿魏酸酯酶活性的多肽，從而以可回收的量表達(dá)和產(chǎn)生所述多肽。多肽可從植物或植物部分回收?；蛘?，同樣可以將含有該重組多肽的植物或植物部分用于改進(jìn)食品或飼料的質(zhì)量，例如，改進(jìn)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、適口性(palatability)和流變性質(zhì)(rheologicalproperties)，或用于破壞抗?fàn)I養(yǎng)因子。轉(zhuǎn)基因植物可以是雙子葉的(雙子葉植物)或單子葉的(單子葉植物)。單子葉植物的實(shí)例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadowgrass)(藍(lán)草(bluegrass)，早熟禾屬(Poa))；飼用牧草(foragegrass)如羊茅屬(Festuca)、黑麥草屬(Lolium)；寒地型牧草(temperategrass)，如Agrostis(剪股穎屬)；和谷類，例如，小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。雙子葉植物的實(shí)例是煙草(tobacco)，豆類(legumes)，如羽扇豆(lupins)，馬鈴薯，糖甜菜(sugarbeet),豌豆,豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(familyBrassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rapeseed)和緊密相關(guān)的模型生物體擬南芥(Arabidopsisthaliana)。植物部分的實(shí)例是莖(stem)、愈傷組織(callus)、葉(Ieaf)Jg(root)、果實(shí)(fruit)、種子(seed)和塊莖(tuber)，以及包含這些部分的獨(dú)立組織，例如，表皮(epidermis)、葉肉(mesophyll)、薄壁組織(parenchyme)、維管組織(vasculartissue)、分生組織(meristem)。具體的植物細(xì)胞區(qū)室(compartments)，如葉綠體(chloroplast)、質(zhì)夕卜體(apoplast)、線粒體(mitochondria)、液泡(vacuole)、過(guò)氧化物酶體(peroxisome)和細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)也被認(rèn)為是植物部分。此外，任何植物細(xì)胞，無(wú)論什么組織來(lái)源，都被認(rèn)為是植物部分。同樣地，植物部分，如為了促進(jìn)本發(fā)明的應(yīng)用而分離的具體組織和細(xì)胞也被認(rèn)為是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和種皮(seedcoat)0同樣包括于本發(fā)明范圍內(nèi)的還有植物部分、植物細(xì)胞和植物的子代。表達(dá)本發(fā)明多肽的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞可以依照本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)如下構(gòu)建所述植物或植物細(xì)胞將編碼本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))表達(dá)構(gòu)建體并入植物宿主基因組或葉綠體基因組，并且將所得的修飾植物或植物細(xì)胞繁殖為轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞。表達(dá)構(gòu)建體便利地是包含編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與在選擇的植物或植物部分中表達(dá)該核苷酸序列所需的適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作地連接。此外，表達(dá)構(gòu)建體可以包含對(duì)于鑒定在其中整合了該表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞有用的選擇性標(biāo)記和將該構(gòu)建體引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依賴于使用的DNA引入方法)。調(diào)節(jié)序列的選擇，例如啟動(dòng)子和終止子序列和任選地信號(hào)或轉(zhuǎn)運(yùn)序列的選擇，舉例來(lái)說(shuō)，基于期望何時(shí)、何處以及如何表達(dá)多肽而確定。例如，編碼本發(fā)明多肽的基因的表達(dá)可以是組成型的或誘導(dǎo)型的，或可以是發(fā)育、階段或組織特異性的，并且基因產(chǎn)物可以靶向特定的組織或植物部分例如種子或葉。調(diào)節(jié)序列由例如Tague等，1988，PlantPhysiology86:506所述。對(duì)于組成性表達(dá)，可以使用35S_CaMV、玉米泛素1和稻肌動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子(Franck等，1980,Cell21:285_294，Christensen等，1992,PlantMo.Biol.18:675-689；Zhang等，1991,PlantCell3:1155-1165)。器官特異性啟動(dòng)子可以是例如來(lái)自貯藏庫(kù)組織(storagesinktissue)例如種子、馬鈴薯塊蓮和果實(shí)的啟動(dòng)子(Edwards&Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或來(lái)自代謝庫(kù)組織(metabolicsinktissue)例如分生組織的啟動(dòng)子(Ito等，1994，PlantMol.Biol.24:863-878)，種子特異性啟動(dòng)子諸如來(lái)自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶谷蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)啟動(dòng)子(Wu等，1998，PlantandCellPhysiology39:885-889)，來(lái)自豆球蛋白(legumin)B4和蠶豆(Viciafaba)的未知種子蛋白基因的蠶豆啟動(dòng)子(Conrad等，1998，JournalofPlantPhysiology152:708-711)、來(lái)自種子油體蛋白(oilbodyprotein)的啟動(dòng)子(Chen等，1998，PlantandCellPhysiology39:935-941)，來(lái)自歐洲油菜(Brassicanapus)的貯藏蛋白napA啟動(dòng)子，或本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何其它種子特異性的啟動(dòng)子，例如，在TO91/14772中所描述的。此外，啟動(dòng)子可為葉特異性的啟動(dòng)子，如來(lái)自稻或番茄的rbcs啟動(dòng)子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology102:991-1000)，小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(adeninemethyltransferase)基因啟動(dòng)子(Mitra和Higgins，1994，PlantMolecularBiology洸85-93)，或來(lái)自稻的aldP基因啟動(dòng)子(Kagaya等，1995，MolecularandGeneralGenetics248:668-674)，或傷口誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如馬鈴薯pin2啟動(dòng)子(Xu等，1993，PlantMolecularBiology22:573-588)。同樣地，所述啟動(dòng)子可通過(guò)非生物的處理誘導(dǎo)，所述非生物的處理諸如溫度、干旱或鹽度變化，或通過(guò)外源施加的激活所述啟動(dòng)子的物質(zhì)誘導(dǎo)，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(planthormones)如乙烯、脫落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellicacid)，和重金屬。啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件也可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明多肽在植物中的較高表達(dá)。例如，啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件可以是內(nèi)含子，其置于啟動(dòng)子和編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列之間。例如Xu等，1993，見(jiàn)上，公開(kāi)了使用稻肌動(dòng)蛋白1基因的第一內(nèi)含子以增強(qiáng)表達(dá)。選擇性標(biāo)記基因和表達(dá)構(gòu)建體的任何其它部分可以選自本領(lǐng)域內(nèi)可用的那些。將核酸構(gòu)建體根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)并入植物基因組，所述常規(guī)技術(shù)包括土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射(microinjection)、粒子轟擊、生物射彈轉(zhuǎn)化和電穿孔(Gasser等，1990，Science244:1293；Potrykus,1990，Bio/Technology8535；Shimamoto等，1989,Nature338274)。目前，根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(genetransfer)，是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因雙子葉植物的優(yōu)選方法(為了參考，見(jiàn)Hooykas和khilperoort，1992，PlantMolecularBiology19:15-38)，而且它也可以用于轉(zhuǎn)化單子葉植物，雖然對(duì)于這些植物常常使用其它的轉(zhuǎn)化方法。目前，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物的優(yōu)選的方法，是用粒子(用轉(zhuǎn)化DNA涂覆的微觀的金或鎢粒子)轟擊胚愈傷組織(embryoniccalli)或發(fā)育中的胚(developingembryos)(Christou,1992,PlantJournal2:275-281;Shimamoto,1994,CurrentOpinionBiotechnology5:158-162；Vasilφ,1992,Bio/Technology10667-674)。轉(zhuǎn)化單子葉植物的可供選擇的方法是基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，如由Omirulleh等，1993，PlantMolecularBiology21:415-4所描述的。轉(zhuǎn)化之后，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法選擇并入了表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化體并且再生成為完整植株。通常設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化方法用于通過(guò)如下方法在再生期間或在后續(xù)世代中選擇性消除選擇基因例如，使用帶有兩種獨(dú)立的T-DNA構(gòu)建體的共轉(zhuǎn)化或通過(guò)特異性重組酶位點(diǎn)特異性地切除選擇基因。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，其包括(a)在有益于產(chǎn)生多肽的條件下培養(yǎng)包含多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。組合物本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多肽的組合物。所述組合物可以包含本發(fā)明的多肽作為主要酶成分，例如，單成分組合物。或者，所述組合物可以包含多種酶活性，例如乙酰木聚糖酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-葡聚糖酶、鹵素過(guò)氧化物酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果膠分解酶、肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase)、過(guò)氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。合適地選擇在本發(fā)明的組合物中使用的酶，使得其對(duì)底物具有協(xié)同活性。優(yōu)選地，所述底物是或來(lái)源于植物，例如小麥(如麥麩)、甜菜(如糖甜菜)或玉米(如玉米穗軸)。可以依照本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備多肽組合物，并且可以是液體或干組合物的形式。例如，所述多肽組合物可以是顆粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域內(nèi)已知方法將包括于所述組合物中的多肽穩(wěn)定化。下面給出的是本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選的用途的實(shí)例。本發(fā)明的多肽組合物的劑量和使用該組合物的其他條件可以基于本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法確定。用途本發(fā)明還涉及使用具有阿魏酸酯酶活性的多肽，或其組合物的方法本發(fā)明具有阿魏酸酯酶活性的多肽可用于數(shù)種應(yīng)用以降解或轉(zhuǎn)化來(lái)源于植物的底物，例如，生物質(zhì)底物，如包含阿魏?；〈哪揪厶堑纳镔|(zhì)底物，即，包含具有阿魏酰側(cè)基的木聚糖的底物，如包含半纖維素的底物。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明還涉及使用具有阿魏酸酯酶活性的多肽處理包含經(jīng)阿魏酰基取代的木聚糖的材料。所述材料可為任何包含纖維素生物質(zhì)或木素纖維素生物質(zhì)的材料。在另一優(yōu)選的方面，用木聚糖降解酶進(jìn)一步處理包含經(jīng)阿魏?；〈哪揪厶堑牟牧?。所述木聚糖降解酶可選自下組木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合。具有阿魏酸酯酶的多肽在多種應(yīng)用中是有用的修飾含阿魏?；膭?dòng)物飼料以改進(jìn)可消化性(digestability)；在生物質(zhì)降解或轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的糖在產(chǎn)生例如下述物質(zhì)中的一般應(yīng)用燃料和/或飲用乙醇；用于紙漿或紙脫木質(zhì)化(delignification)的操作助劑(processingaid)；用于紡織品的酶法煮煉系統(tǒng)(enzymaticscouringsystem)的組分；飼料應(yīng)用(例如，供單胃動(dòng)物(monogastricanimal)的飼料)；食物應(yīng)用(例如，烘烤，與其他酶功能組合促進(jìn)焙烤食物的物理性質(zhì))；以及與其他酶功能組合用于洗衣洗滌劑應(yīng)用。確定阿魏酸酯酶活性阿魏酸酯酶(FAE)活性以IU(國(guó)際單位)測(cè)定，其定義為每分鐘從阿魏酸對(duì)硝基苯酯(pNP-阿魏酸酯)釋放的pNP的微摩爾量。使用96-孔微孔板分光光度讀數(shù)器(spectrophotometric96-wellmicroplatereader)，pNP的量相對(duì)于在相同條件下pNP標(biāo)樣運(yùn)行來(lái)定量。材料pNP-阿魏酸酯二甲亞砜(DMSO)(Sigma154938)50mM乙酸鈉緩沖液，pH5.01.OMTris-HCl緩沖液，pH8.0對(duì)硝基苯酚稀釋酶試劑以得到<15%的pNP-阿魏酸酯到pNP的轉(zhuǎn)化率。起始的稀釋物在1.5mL微離心管中制備，使用50mM乙酸鈉緩沖液，pH5.0。然后將試樣稀釋物轉(zhuǎn)移至96-孔板上，并使用50mM乙酸鈉緩沖液，pH5.0作為稀釋劑制備兩倍系列稀釋物。從原始的IOmM儲(chǔ)液(在50mM乙酸鈉緩沖液，pH5.0中)稀釋于乙酸鈉緩沖液，pH5.0中制備下述濃度的pNP標(biāo)樣0.25,0.2,0.1、0.05、0.02mM。使用的稀釋劑是乙酸鈉緩沖液，PH5.0。底物儲(chǔ)液由0.IM完全溶解于DMSO中的pNP-阿魏酸酯組成。儲(chǔ)液可冷卻儲(chǔ)藏兩周。在使用前，將儲(chǔ)液在50mM乙酸鈉緩沖液，pH5.0中稀釋IOOx以制備ImMpNP-阿魏酸酯。所述ImMpNP-阿魏酸酯(在乙酸鈉緩沖液中)是渾濁(cloudy)且為淡黃色的。pNP標(biāo)樣100μLpNP標(biāo)樣+100μL乙酸鈉緩沖液(50mM，ρΗ5·0)。試劑對(duì)照200μL乙酸鈉緩沖液(50mM，ρΗ5·0)。底物對(duì)照100μL底物(ImMpNP-阿魏酸酯)+100μL乙酸鈉緩沖液(50mM，ρΗ5·0)。試樣對(duì)照100μL酶試樣+100μL乙酸鈉緩沖液(50mM，pH5.0)試樣100μL底物(ImMpNP-阿魏酸酯)+100μL酶試樣。所述測(cè)定法在室溫下)進(jìn)行。在時(shí)間0點(diǎn)向酶試樣添加ImMpNP-阿魏酸酯。在30分鐘的時(shí)點(diǎn)向每個(gè)孔添加50μLTris-HCl緩沖液(1Μ，ρΗ8·0)，混合并立即在405nm(A405)和MOnm(AMO)讀取吸光度。釋放的產(chǎn)生的pNP在A405測(cè)定，而背景渾濁度(cloudiness)在A540測(cè)定。對(duì)每個(gè)對(duì)照或試樣將A540(渾濁度)從A450中減去。將由試劑對(duì)照(RC)獲得的平均吸光度值從每個(gè)由底物對(duì)照(SC)和樣品對(duì)照(EC)獲得的吸光度值中減去，以獲得校正的底物對(duì)照(SCei)和校正的試樣對(duì)照(ECei)。然后，將SCiJpECei*!^從試樣吸光度中減去以獲得校正的試樣值(Sei)。SC校正==SC原始EC校正==EC原始S校正=S原始—SC校正校正基于校正的試樣吸光度值Sei，使用由pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的線性方程確定釋放的pNP。使用的單位為IU(國(guó)際單位)，定義為每分鐘釋放的pNP微摩爾數(shù)，除以反應(yīng)混合物中酶的濃度(以mg/mL表示)，得到IU/mg酶mmolpNP/L反應(yīng)混合物=micromolpNP/mL反應(yīng)混合物IU/mg=(micromolpNp/mL反應(yīng)混合物/10min)/(mg酶/mL反應(yīng)混合物)實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)使用4-硝基苯基2-0-￠)-阿魏酰-a-L-阿拉伯呋喃糖苷或4_硝基苯基5-(0)-(E)-阿魏酰-α-L-阿拉伯呋喃糖苷研究示于SEQIDNO2的桔灰青霉阿魏酸酯酶的特異性；兩個(gè)合成底物，其分別具有連接于甲基α-阿拉伯呋喃糖苷2-位和5-位的阿魏酸殘基。所述底物根據(jù)Mastihubova等，TetrahedronLett.44(2003)，1671-1673制備。通過(guò)使用檢測(cè)游離阿魏酸的釋放的TLC來(lái)測(cè)定阿魏酸酯酶的活性。條件為pH5.5(50mM乙酸鹽緩沖液)，底物濃度10mg/mL。溫度為30°C，而酶劑量為0.ImgEP/mL。在1、4和48小時(shí)后取樣，并施于TLC板上。TLC洗脫液疋tOAc+Ι滴AcOH，顯色劑:1MH2SO4,然后加熱。在pH5.5，所述阿魏酸酯酶對(duì)5_位和2位均顯示良好的活性，但對(duì)5_取代底物的反應(yīng)更快。實(shí)施例2示于SEQIDNO:2的桔灰青霉阿魏酸酯酶的比活性通過(guò)使用pNP-乙酸酯和pNP丁酸酯來(lái)研究。為了測(cè)定底物特異性，單位為在pH6.0，溫度37°C，底物為ImM的條件下，每分鐘釋放的PNP微摩爾數(shù)。將20yL適當(dāng)稀釋于0.01%TritonX-100中的酶分配到微滴定板(例如，NUNC269620)的孔中。對(duì)每個(gè)底物制備IOOmM底物的儲(chǔ)液。將IOOmMpNP-乙酸酯(SigmaN8130)溶解于DMS0，并將IOOmMpNP丁酸酯(SigmaN9876)用異丙醇稀釋。就在分析之前，將儲(chǔ)液在測(cè)定緩沖液(50mM磷酸、50mM乙酸和50mM硼酸，50mMKCl,ImMCaCl2^O.01%TritonX-100，用NaOH調(diào)整為pH6.0)中稀釋至ImM。將120yLImM底物添加至微滴定板中的酶。將板密封，并在37°C以750rpm振蕩溫育15分鐘。在溫育時(shí)間后，添加100μL終止試劑(stopreagent)(終止試劑是2.OMTrispH8.0于水中)并立即在微滴定板分光光度計(jì)中(microtiterplatespectrophotometer)測(cè)定405nm的吸光度。發(fā)現(xiàn)所述酶和其他乙酰木聚糖酯酶類似地從pNP-乙酸酯釋放pNP。還發(fā)現(xiàn)所述酶與從PNP-乙酸酯釋放pNp相比以大約兩倍的速率從pNP-丁酸酯釋放pNP。這些結(jié)果顯示，該酶可適應(yīng)(accommodate)底物識(shí)別位點(diǎn)中的乙?；约岸∷?butyrate)和阿魏酸(ferulate)。權(quán)利要求1.一種具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，選自下組(a)多肽，其包含與SEQIDNO2的成熟多肽具有至少60%同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在至少中等嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列，(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列，或(iii)⑴或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈；(c)由如下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列具有至少60%同一性的核苷酸序列；和(d)包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽的變體。2.權(quán)利要求1的多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸在至少中等嚴(yán)緊條件下與以下雜交(i)SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列；(ii)包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列的基因組DNA序列；或(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈。3.權(quán)利要求1或2的多肽，其由如下多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含SEQIDN0:1的核苷酸序列或其編碼具有阿魏酸酯酶活性的片段的亞序列，或由SEQIDNO:1的核苷酸序列或其編碼具有阿魏酸酯酶活性的片段的亞序列組成。4.權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的多肽，其由如下多核苷酸編碼所述多核苷酸包含SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列，或由SEQIDNO1的成熟多肽編碼序列組成。5.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽是變體，所述變體包含取代、缺失和/或插入一個(gè)或多個(gè)(幾個(gè))氨基酸的SEQIDNO2的成熟多肽。6.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述成熟多肽是SEQIDNO2的氨基酸1到249。7.權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述成熟多肽編碼序列是SEQIDN0:1的核苷酸152到901。8.一種分離的多核苷酸，包含編碼權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所述的多肽的核苷酸序列。9.權(quán)利要求8的分離的多核苷酸，在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中包含至少一個(gè)突變，其中所述突變體核苷酸序列編碼SEQIDNO:2的成熟多肽。10.一種核酸構(gòu)建體，包含權(quán)利要求8或9的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列，所述調(diào)控序列在表達(dá)宿主中指導(dǎo)多肽的產(chǎn)生。11.一種重組表達(dá)載體，包含權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體。12.—種重組宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體。13.權(quán)利要求12的重組宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為真菌或細(xì)菌宿主細(xì)胞。14.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所述的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞以其野生型的形式產(chǎn)生所述多肽；和(b)回收所述多肽。15.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所述的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，其包括核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含編碼所述多肽的核苷酸序列；和(b)回收所述多肽。16.一種產(chǎn)生包含突變體核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述突變體核苷酸序列編碼具有阿魏酸酯酶活性的多肽，所述方法包括(a)在SEQIDNO:1的成熟多肽編碼序列中引入至少一個(gè)突變，其中所述突變體核苷酸序列編碼多肽，所述多肽包含SEQIDN0:2的成熟多肽或由SEQIDNO2的成熟多肽組成；和(b)回收所述包含突變體核苷酸序列的多核苷酸。17.通過(guò)權(quán)利要求16的方法產(chǎn)生的突變體多核苷酸。18.—種產(chǎn)生多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生所述多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞包含權(quán)利要求16的突變體多核苷酸，所述多核苷酸編碼所述多肽；和(b)回收所述多肽。19.一種產(chǎn)生權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所述的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其包含編碼所述多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。20.一種轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物細(xì)胞，其由編碼權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所述的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化。21.一種降解包含阿魏?；牟牧系姆椒?，包括用權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所述的多肽處理所述材料。22.權(quán)利要求21的方法，進(jìn)一步包括用木聚糖降解酶處理所述包含阿魏?；牟牧?。23.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述木聚糖降解酶選自下組木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶及其組合。24.權(quán)利要求21到23任一項(xiàng)所述的方法，其中所述包含阿魏?；牟牧鲜莿?dòng)物飼料。25.權(quán)利要求21到對(duì)任一項(xiàng)所述的方法，其中所述包含阿魏?；牟牧鲜抢w維素生物質(zhì)或木素纖維素生物質(zhì)。26.一種組合物，包含權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)所述的多肽，以及一種或多種其他的選自下組的酶阿拉伯呋喃糖苷酶、葡聚糖酶、果膠酶、蛋白酶、乙酰木聚糖酯酶、鼠李半乳糖醛酸酶和木聚糖酶。全文摘要本發(fā)明涉及具有阿魏酸酯酶活性的分離的多肽，以及編碼所述多肽的多核苷酸。本發(fā)明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生和使用所述多肽的方法。文檔編號(hào)C12N15/31GK102066409SQ200980122411公開(kāi)日2011年5月18日申請(qǐng)日期2009年4月17日優(yōu)先權(quán)日2008年4月17日發(fā)明者伊娃·H·漢森,克里斯特爾·T·喬根森,克里斯琴·B·R·M·克羅格,多米尼克·A·斯科夫倫德,瑪麗·斯特林格申請(qǐng)人:諾維信公司