專利名稱：H1n1病毒核酸高效提取試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種從生物樣品中分離核酸的試劑盒，尤其是從無細(xì)胞生物樣品 中快速純化Hmi病毒核酸的試劑盒。
背景技術(shù)：
流行性感冒是一種常見的呼吸道傳染病，引起該病的流感病毒抗原性復(fù)雜，根據(jù) 其核心蛋白抗原性不同分為甲、乙、丙三型，根據(jù)其表面抗原血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N) 的不同，同型病毒又分為若干亞型，各型之間無交叉免疫。甲型Hmi流感病毒已在世界范 圍內(nèi)傳播，且感染人數(shù)急劇增多，給人類帶來巨大災(zāi)害。從生物材料中高效、簡(jiǎn)便地分離純化得到完整、高純度的流感病毒核酸是研究流 感疾病的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的核酸純化方法步驟繁瑣，耗時(shí)長，提取效率低，已經(jīng)很難滿足高通量 的實(shí)驗(yàn)需求。同時(shí)傳統(tǒng)方法使用酚/氯仿等試劑對(duì)人體產(chǎn)生巨大毒害作用且污染環(huán)境。磁 珠在外加磁場(chǎng)的作用下可快速地分離核酸，簡(jiǎn)單、快捷、成本低廉且安全。目前已有很多公司生產(chǎn)出專門為核酸磁性分離純化而設(shè)計(jì)的配套自動(dòng)化系統(tǒng)，這 些儀器使得磁珠法純化核酸實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，極大地提高了樣品處理的通量，易于高通量的 篩選，同時(shí)也提高了提取操作的可重復(fù)性。本實(shí)用新型具有靈敏度高、成本低廉、操作簡(jiǎn)便快捷、省時(shí)省力等特點(diǎn)，可用于自 動(dòng)化核酸提取儀器。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述情況，本實(shí)用新型的目的在于提供一種能夠從無細(xì)胞生物樣本中快速高 效分離Hmi病毒核酸的試劑盒，并且適用于自動(dòng)化核酸提取儀器。該試劑盒操作簡(jiǎn)便，成 本低廉，靈敏度高，所提取的病毒核酸可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)用新型提供了一種通過磁性顆粒來純化Hmi病毒核酸的試劑盒，該試劑盒 有一個(gè)盒體，盒體內(nèi)包括磁力架以及多個(gè)小瓶，所述多個(gè)小瓶中分別裝有裂解緩沖液、結(jié)合 緩沖液、洗滌緩沖液I、洗滌緩沖液II、洗滌緩沖液III、洗脫緩沖液、蛋白酶K、磁珠溶液、助 沉劑。在含病毒的樣品中加入蛋白酶K、助沉劑及裂解緩沖液，使病毒裂解釋放核酸；加 入結(jié)合緩沖液和磁珠，樣品中的核酸與磁珠結(jié)合，然后在外加磁場(chǎng)條件下進(jìn)行分離，收集磁 珠-核酸復(fù)合物；加入洗滌緩沖液，去除未結(jié)合物質(zhì)；加入洗脫緩沖液，將結(jié)合在磁珠上的 核酸洗脫下來，回收洗脫液即為病毒核酸。其中助沉劑有助于提取病毒含量低的樣本，提 高了試劑盒靈敏度。本實(shí)用新型的有益效果是提供了一種高效的病毒核酸的試劑盒，該試劑盒成本 低廉、操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，可配合自動(dòng)化儀器，快速高通量提取病毒核酸。所提取的核酸可 直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖1為本實(shí)用新型的立體結(jié)構(gòu)圖。圖2為病毒含量與Ct值的相關(guān)性曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行詳細(xì)的說明。本實(shí)用新型提供了一種通過磁性顆粒來純化病毒核酸的試劑盒，該試劑盒有一個(gè) 盒體11，盒體11內(nèi)包括裂解緩沖液1、結(jié)合緩沖液2、洗滌緩沖液I 3、洗滌緩沖液II 4、洗 滌緩沖液III 5、洗脫緩沖液6、蛋白酶K 7、磁珠溶液8、助沉劑9及磁力架10，上述液體試劑 均分裝于小瓶?jī)?nèi)。使用時(shí)，按照以下具體步驟操作取Hmi甲型流感病毒陽性標(biāo)本的培養(yǎng)病毒(4X 106COpieS/ml)，進(jìn)行10倍梯度稀 釋，然后用本試劑盒提取病毒RNA，同時(shí)用Roche High Pure Viral RNA Kit作為對(duì)照。(1)向1.5ml去RNA酶離心管中加入5μ1蛋白酶Κ，2μ1助沉劑和ΙΟΟμΙ裂解緩 沖液，加入100 μ 1病毒稀釋液，充分混勻，55°C水浴10分鐘。(2)向離心管內(nèi)先加入300μ1結(jié)合緩沖液，再加入20μ1磁珠(使用前充分混 勻)，室溫下柔和充分混勻10分鐘。(3)將離心管置于磁力架上1分鐘，使管內(nèi)磁珠吸附到一邊，用加樣槍移走管內(nèi)液 體，取下離心管。(4)向離心管內(nèi)加入250 μ 1洗滌緩沖液I，使磁珠重新懸浮，利用磁力架吸附磁 珠，1分鐘后移走管內(nèi)液體，取下離心管。(5)向離心管內(nèi)加入250 μ 1洗滌緩沖液II，使磁珠重新懸浮，利用磁力架吸附磁 珠，1分鐘后移走管內(nèi)液體，保持離心管置于磁力架上，使磁珠繼續(xù)被吸附。(6)從離心管的另一側(cè)緩慢加入275 μ 1洗滌緩沖液III，盡量不要沖起磁珠，1分鐘 后移走管內(nèi)液體，取下離心管。(7)向離心管內(nèi)加入50 μ 1洗脫緩沖液，使磁珠重新懸浮，55°C水浴5分鐘，其間輕 輕晃動(dòng)使RNA洗脫出來。(8)將離心管置于磁力架1分鐘，使磁珠被吸附，將洗脫液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管， 即為純化的RNA。取上述RNA提取液2μ 1作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見下表和圖 2。 表中為不同稀釋度時(shí)RNA的熒光定量PCR Ct值。Ct值越低，核酸量及純度越高。 本試劑盒提取結(jié)果在低拷貝時(shí)略優(yōu)于對(duì)比試劑盒，產(chǎn)品檢測(cè)下限達(dá)到40COpieS/ml。本試劑盒效果優(yōu)于對(duì)比試劑盒，且成本低廉，操作簡(jiǎn)便、快速，亦可配合自動(dòng)化儀 器使用。
權(quán)利要求一種H1N1病毒核酸高效提取試劑盒，其特征在于該試劑盒有一個(gè)盒體(11)，盒體(11)內(nèi)包括磁力架(10)以及多個(gè)小瓶，所述多個(gè)小瓶中分別裝有裂解緩沖液(1)、結(jié)合緩沖液(2)、洗滌緩沖液Ⅰ(3)、洗滌緩沖液Ⅱ(4)、洗滌緩沖液Ⅲ(5)、洗脫緩沖液(6)、蛋白酶K(7)、磁珠溶液(8)、助沉劑(9)。
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種H1N1病毒核酸高效提取試劑盒，從無細(xì)胞生物樣品中快速分離病毒核酸。本試劑盒有一個(gè)盒體，盒體內(nèi)包括小瓶分裝的裂解緩沖液、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液I、洗滌緩沖液II、洗滌緩沖液III、洗脫緩沖液、蛋白酶K、磁珠溶液、助沉劑及磁力架。用本試劑盒中裂解緩沖液裂解病毒釋放核酸，使磁珠吸附核酸形成復(fù)合物，在外加磁場(chǎng)作用下進(jìn)行分離，經(jīng)洗滌緩沖液洗滌去除雜質(zhì)，然后洗脫回收核酸。本試劑盒操作簡(jiǎn)便、安全，成本低廉，可配合自動(dòng)化核酸提取儀器進(jìn)行高效的病毒核酸提取，所提取的核酸完整、純度高，可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12R1/93GK201648402SQ20092027175
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2009年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月19日
發(fā)明者趙海峰 申請(qǐng)人:北京金麥格生物技術(shù)有限公司