專利名稱：一種提高真菌產(chǎn)纖維素酶酶活的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及在真菌纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)的過程中通過添加 法尼醇來提高纖維素酶的酶活。
背景技術(shù)：
纖維素酶是一種重要的資源，廣泛地應(yīng)用在食品、釀造、飼料、紡織等工業(yè)技術(shù)領(lǐng) 域，并且在纖維素生物質(zhì)資源化的工業(yè)技術(shù)中作用日益凸顯。當(dāng)前石化能源的日益匱乏和 環(huán)境污染的背景下，利用可再生纖維素生物質(zhì)獲得纖維基產(chǎn)品和能源顯然具有很大的潛力 和廣闊的市場前景。纖維素生物質(zhì)資源化過程中關(guān)鍵的一步是纖維素的生物轉(zhuǎn)化過程(纖 維素的酶解)，因而提高纖維素酶的酶活是非常重要的。真菌產(chǎn)纖維素酶的分泌量大，纖維 素酶酶系完整，是纖維素酶制劑的主要工業(yè)生產(chǎn)菌種。目前主要局限于利用傳統(tǒng)的方法來 提高纖維素酶的酶活，包括通過物理或者化學(xué)手段誘變菌種，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，以及利用分 子生物學(xué)的手段改造工程菌種等，這些手段在提高纖維素酶酶活方面取得了一定的成果。 但是有必要開發(fā)新的技術(shù)以提高纖維素酶的活力。群體密度感應(yīng)(quorum sensing)是微 生物化學(xué)交流的一種方式，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定的閾值時(shí)會(huì)激發(fā)和調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)， 比如外泌的纖維素酶等。法尼醇是真核生物化學(xué)交流的重要群體感應(yīng)信號分子，但是還未 見有利用法尼醇來提高纖維素酶酶活的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在通過真菌纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)的過程中添加法尼醇來提高纖維素酶的 酶活，在提高纖維素酶活力方面提供新的技術(shù)。本發(fā)明所述的提高真菌產(chǎn)纖維素酶酶活的方法如下(1)菌種產(chǎn)纖維素酶真菌，包括瑞氏木霉、斜臥青霉、擬康木霉、黑曲霉等。(2)發(fā)酵培養(yǎng)基使用纖維素物質(zhì)作為碳源，包括微晶纖維素0. 4 0. 7% ；麩皮2 4% ；稻草秸稈、 玉米秸稈、小麥秸稈等纖維素性生物質(zhì)2 4%。補(bǔ)加一定量的無機(jī)鹽溶液成分，其配方為 磷酸二氫鉀 2. 0 4. Og/Ι，硫酸銨 1. 0 2. Og/1, MgSO4 · 7Η20 0· 4 0. 5g/l, CaCl2 · 2H20 10 15mg/l 等，pH 5. 5。(3)發(fā)酵過程搖瓶發(fā)酵接種量8 11%，28°C 30°C振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為160 180rpm。
發(fā)酵罐接種量8 11 %，發(fā)酵溫度28°C 30°C，溶氧量20 %，發(fā)酵前期轉(zhuǎn)速為 200 250rpm，發(fā)酵后期轉(zhuǎn)速為150 170rpm。發(fā)酵前期加入法尼醇，法尼醇的加入量是0. 1 ImM。本發(fā)明依據(jù)群體密度感應(yīng)的機(jī)理，在纖維素酶生產(chǎn)發(fā)酵的過程中添加法尼醇，調(diào) 控真菌纖維素酶的分泌和提高纖維素酶的酶活力。實(shí)際操作簡便可行，效果明顯，為工業(yè)生產(chǎn)中提高纖維素酶的酶活力提供一種方法。
具體實(shí)施例方式以下將將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，目的在于幫助讀者更好的理 解本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)，但不作為對本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。實(shí)施例1 選用斜臥青霉為生產(chǎn)菌種，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基其配方如下微晶纖維素0.6% ；麩 皮3% ；玉米秸稈3%0無機(jī)鹽溶液成分磷酸二氫鉀3. Og/Ι，硫酸銨2. Og/1, MgSO4 · 7H20 0. 5g/l, CaCl2 · 2H20 15mg/l 等，pH 5. 5。取3環(huán)平板上活化好的菌種，接種在液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)3天，搖床轉(zhuǎn)速 為180rpm，作為種子。將上述種子接種發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量10%，30°C振蕩培養(yǎng)3天，搖床轉(zhuǎn) 速為180rpm。發(fā)酵培養(yǎng)第3天時(shí)加入法尼醇，培養(yǎng)基中法尼醇的終濃度為ImM。不同的發(fā) 酵時(shí)間點(diǎn)取樣，測定纖維素酶酶活。濾紙酶活的定義在50°C，相應(yīng)pH條件下，Imin水解濾 紙纖維素底物，產(chǎn)生出相當(dāng)于Iymol葡萄糖的還原糖量，為一個(gè)酶活力單位，以IU/mL(IU/ g)表示。濾紙酶活測定時(shí)選用的濾紙為whatman公司的Nol濾紙，還原糖的檢測使用DNS 法。以第8天的發(fā)酵樣品為例，添加法尼醇的培養(yǎng)基中斜臥青霉產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活是 4. ^IU/mL，其活力較一般情況下斜臥青霉產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活提高了約46%。實(shí)施例2:選用瑞氏木霉為生產(chǎn)菌種，使用的發(fā)酵培養(yǎng)基其配方如下微晶纖維素0.5% ； 麩皮3. 5 % ；稻草秸稈粉3 %。無機(jī)鹽溶液成分磷酸二氫鉀3. Og/Ι,硫酸銨1. Og/1, MgSO4 · 7H20 0. 5g/l, CaCl2 · 2H20 10mg/l 等，ρΗ5· 5。取3環(huán)平板上活化好的菌種，接種在液體培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)4天，搖床轉(zhuǎn)速 為ISOrpm，作為種子。將上述種子接種發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量10%，30°C振蕩培養(yǎng)4天，搖床 轉(zhuǎn)速為180rpm。發(fā)酵培養(yǎng)第4天時(shí)加入法尼醇，培養(yǎng)基中法尼醇的終濃度為0. 5mM。不同 的發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)取樣，測定纖維素酶酶活。以第5天的發(fā)酵樣品為例，添加法尼醇的培養(yǎng)基中 瑞氏木霉產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活是3. 56IU/mL，其活力較一般情況下瑞氏木霉產(chǎn)纖維素酶 的濾紙酶活提高了約30%。
權(quán)利要求
1.一種提高真菌產(chǎn)纖維素酶酶活的方法，其特征在于，在真菌纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)過程 中通過添加法尼醇的手段提高纖維素酶的酶活。
2.權(quán)力要求1所述的一種提高真菌產(chǎn)纖維素酶酶活的方法，其特征在于，使用的菌種 是青霉屬、曲霉屬、木霉屬等產(chǎn)纖維素酶、淀粉酶、幾丁質(zhì)酶等糖苷酶的真菌。
3.權(quán)力要求1所述的一種提高真菌產(chǎn)纖維素酶酶活的方法，其特征在于，真菌纖維素 酶發(fā)酵生產(chǎn)過程中添加法尼醇，包括發(fā)酵的前期、中期和后期添加法尼醇，發(fā)酵培養(yǎng)基中法 尼醇的濃度是0. 1 ImM。
全文摘要
本發(fā)明涉及提高纖維素酶酶活的新技術(shù)方法。本發(fā)明通過在真菌纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)過程中添加法尼醇的手段提高纖維素酶的酶活。通過添加法尼醇可以使瑞氏木霉產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活提高約30％，使斜臥青霉產(chǎn)纖維素酶的濾紙酶活提高了約46％。本發(fā)明涉及的方法簡單易行，提高纖維素酶酶活的效果明顯，并且該發(fā)明適用范圍廣，可用于多種真菌發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶工業(yè)。
文檔編號C12R1/885GK102108347SQ20091024307
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者呂迪, 莊國強(qiáng), 張洪勛, 郭紅光, 馬安周 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心