專(zhuān)利名稱(chēng)：一種抗uPAR人源化抗體及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗uPAR人源化抗體及其編碼基因。
背景技術(shù)：
尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator)及尿激酶型纖溶 MW^W^^^W (urokinase plasminogen activator receptor, uPAR)
系統(tǒng)在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。隨著uPA、uPAR在癌癥中的作用研究的日益 深入，其臨床意義很快受到重視。許多專(zhuān)家認(rèn)為uPA及uPAR是惡性腫瘤的特征，與腫瘤的 進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是一致的。抑制uPA和uPAR的表達(dá)可以減少多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。國(guó) 內(nèi)外許多研究表明，針對(duì)uPAR的抗體可有效地在胞外通過(guò)阻斷配體的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)uPAR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)途徑的抑制，對(duì)多種由uPAR過(guò)度表達(dá)或/和突變所引起的人體腫瘤，尤其是頭 頸部鱗狀細(xì)胞癌，結(jié)直腸癌，非小細(xì)胞型肺癌等有較好的療效。UPA是一種絲氨酸蛋白水解酶，基因定位于第10號(hào)染色體，其mRNA為2. 4kb，蛋白分子量為55000。uPA在細(xì)胞合成和分泌時(shí)為單鏈無(wú)活性的尿激酶原(Pro-uPA)，它與腫瘤 細(xì)胞表面特異性受體uPAR結(jié)合后，Pro-uPA被激活轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊远蜴I連接的A、B兩 條鏈組成的uPA，uPA的A鏈含有EGF樣功能區(qū)，該區(qū)和纖連蛋白及凝血酶原有很高的同源 性，可介導(dǎo)uPA和uPAR的結(jié)合。uPAR是由313個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈跨膜糖蛋白，基因 定位于第19號(hào)染色體，mRNA為1. 4kb，相對(duì)分子量為45000 55000。uPAR結(jié)構(gòu)包括3個(gè) 同源結(jié)構(gòu)域(D1、D2、D3)，其中Dl含有與uPA結(jié)合的抗原決定族。uPAR使uPA激活并定位 于細(xì)胞表面提供了在細(xì)胞之間及細(xì)胞與基質(zhì)連接處的局部集中機(jī)制，為表達(dá)uPAR的腫瘤 細(xì)胞提供了 uPA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解的有利環(huán)境。uPA與uPAR結(jié)合后可以促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，但其具體機(jī)制尚不完全明了。目 前普遍認(rèn)為，uPA與uPAR結(jié)合后，可以激活纖溶酶系統(tǒng)，使細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的多種成分 降解，引起蛋白裂解的級(jí)連反應(yīng)，基底膜產(chǎn)生灶性和直接的蛋白裂解，從而使腫瘤細(xì)胞穿透 正常組織屏障，引起腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，uPA與uPAR結(jié)合后還可以引起細(xì)胞形態(tài)改 變、細(xì)胞骨架重塑及特異性角蛋白磷酸化等效應(yīng)。Ploug認(rèn)為在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移引起的重組 事件中，uPAR常常被上調(diào)，與多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)相互作用，以利于蛋白水解酶降解 細(xì)胞外基質(zhì)。Andreasen等認(rèn)為，uPA不僅通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤浸潤(rùn)中發(fā)揮作用，并 在腫瘤細(xì)胞引起的組織重塑中發(fā)揮作用，還可以通過(guò)不依賴(lài)于纖維蛋白溶解酶系統(tǒng)的機(jī)制 引起腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，其中包括uPA、uPAR、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及生長(zhǎng)因子等多因素相互作 用，這種相互作用允許該系統(tǒng)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中，在時(shí)間和空間上重新組織，選擇性地 降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可與尿激酶型纖溶酶原激活物受體結(jié)合的抗體及 其編碼基因。
本發(fā)明所提供的抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕 鏈的氨基酸序列如序列表中序列1所示。上述抗體的重鏈可變區(qū)的編碼基因?yàn)槿缦?)、2)或3)所示1)其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；3)與序列表中序列4自5'末端起第157-171bp和261-283bp位核苷酸具有70% 以上的同源性且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；上述抗體的輕鏈的編碼基因?yàn)槿缦翴)、II)或III)所示I)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；II)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；III)與序列表中序列2自5'末端起第160-184bp和217_250bp位核苷酸具有 70%以上的同源性且編碼所述輕鏈的DNA分子；所述抗體由重鏈和輕鏈組成；所述重鏈由重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)組成；所述重 鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述重鏈恒定區(qū)的編碼基因?yàn)槿缦耡)、b) 或c)所示a)其核苷酸序列是序列表中序列10所示DNA分子；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈恒定區(qū)的DNA分子；c)與a)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述重鏈恒定區(qū)的DNA分 子。擴(kuò)增上述任一所述編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對(duì)為如下引物對(duì)1) 一條引物序列如序列表中序列5所示，所述引物對(duì)中的另一條引物序列如序列 表中序列6所示；2) 一條引物序列如序列表中序列7所示，所述引物對(duì)中的另一條引物序列如序列 表中序列8所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述抗體的方法。本發(fā)明所提供的制備上述抗體的方法，是將上述任一所述編碼基因?qū)胨拗骷?xì)胞 中，培養(yǎng)，得到所述抗體。所述方法中，是通過(guò)重組表達(dá)載體將權(quán)利要求2或3所述編碼基因?qū)胨拗骷?xì)胞 中的；所述重組表達(dá)載體中既含有上述述重鏈可變區(qū)的編碼基因又含有上述輕鏈的編碼基 因，且所述重鏈可變區(qū)的編碼基因和所述輕鏈的編碼基因在所述重組載體中受同一啟動(dòng)子 的調(diào)控。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制尿激酶型纖溶酶原激活物受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑的抑制劑。本發(fā)明所提供的制尿激酶型纖溶酶原激活物受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑，其活性 成分為上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、 上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或上述任一所述表達(dá)盒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑。本發(fā)明所提供的抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制劑，其活性成分為上述抗體、上述任一 所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系 和/或上述任一所述表達(dá)盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物。本發(fā)明所提供的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物，其活性成分為上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系 和/或上述任一所述表達(dá)盒。上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或上述任一所述表達(dá)盒在制備抑制尿激酶型纖溶酶原 激活物受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或上述任一所述表達(dá)盒在制備抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的抑 制劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述抗體、上述任一所述編碼基因、上述任一所述重組載體、上述任一所述重組菌、上述任一所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或上述任一所述表達(dá)盒在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥 物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述腫瘤具體可為宮頸癌；上述腫瘤細(xì)胞具體可為宮頸癌HeLa細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明抗體具有良好的結(jié)合活性(親和力為1.49X10_8mol/L)和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)遷移能力。本發(fā)明的人源化抗體能更好與uPAR結(jié)合，從而保證了其抗腫 瘤效應(yīng)。本發(fā)明制備抗體的方法，能夠同時(shí)表達(dá)輕鏈和重鏈，使輕鏈和重鏈的表達(dá)比例更接 近1 1，產(chǎn)生更高比率的相互匹配雙鏈抗體。綜上，所述本發(fā)明抗體及其制備方法在預(yù)防 和/或治療腫瘤的領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。


圖1為輕鏈基因、重鏈可變區(qū)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖。圖2為抗uPAR人源化抗體的pIRES表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為抗uPAR人源化抗體的還原型SDS-PAGE檢測(cè)。圖4為抗uPAR人源化抗體與uPAR的親和力檢測(cè)圖。圖5為ELISA檢測(cè)抗體表達(dá)結(jié)果。圖6為免疫印跡分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、抗體的輕鏈編碼基因和重鏈可變區(qū)編碼基因的獲得根據(jù)計(jì)算機(jī)模擬，以鼠單克隆抗uPAR抗體為模板，對(duì)其鼠源FR表面基因進(jìn)行人源化改造而設(shè)計(jì)合成輕鏈序列L2和重鏈可變區(qū)序列S2Hb。輕鏈L2的氨基酸序列如序列表中 序列1所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；重鏈可變區(qū)S2Hb的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示。重鏈恒定 區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列9所示，重鏈恒定區(qū)的編碼基因序列如序列表中序列10所
7J\ ο通過(guò)引物對(duì)2L/2LR，采用重疊延伸PCR的方法，擴(kuò)增得到輕鏈的編碼基因序列；通 過(guò)引物對(duì)2H/2HR，采用重疊延伸PCR的方法，擴(kuò)增得到重鏈可變區(qū)的編碼基因序列。輕鏈(L)弓I物2L :CGGATCCGCT AGCCGCCACC ATGGACATCC AGATGACTCA GTCCCCATCTACTCTGTCTG CTTCCGT (序列 5)2LR :CG GAA TTC TCA GGAACT CCAGTAGCGC GAGAGGAAGC CTCGTACATC AGT (序列 6)重鏈(H)可變區(qū)引物2H =GTG TCT AGA GCC GCC ACC ATGGAGGTTC AGCTGGTTCA GTCCGGTGCT (序列 7)2HR =GTG GGA TCC ACT TAC CTGT CTTAGGCTCA ACCTTCTTGT CAACCTTAGT (序列 8)將擴(kuò)增得到的各片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，結(jié)果與預(yù) 期大小一致，L和H片段大小分別約為735bp和770bp (圖1，M.相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；A 泳道 2為輕鏈基因產(chǎn)物L(fēng)2 ；B 泳道2為重鏈可變區(qū)基因S2Hb)；將獲得的L2和S2Hb片段分別克隆入pMD18_T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑克隆、 提取質(zhì)粒并測(cè)序鑒定。結(jié)果表明，獲得片段的序列正確，將含有正確的L2的重組載體記作 PMD18-T/L2，將含有正確的S2Hb的重組載體記作pMD18_T/S2Hb。將輕鏈L2、重鏈可變區(qū)S2Hb、重鏈恒定區(qū)構(gòu)成的抗體記作Y2B。實(shí)施例2、抗體的表達(dá)與純化一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建pIRES雙表達(dá)載體購(gòu)自Clontech公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為631605 ;pMD18_T表達(dá)載體 購(gòu)自 Takara Bio Company，產(chǎn)品目錄號(hào)為D504CA.載體pIRES-Ant i_⑶20 (《抗⑶20嵌合抗體的表達(dá)和活性檢測(cè)》，中國(guó)生物工程雜 志(china biotechnology), 2005, 25 (7) :34_39.)(中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物 工程研究所)。將重組載體pMD18-T/L2和pIRES雙表達(dá)載體分別用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶(Nhe I和EcoRI)酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，回收純化目的片段；將輕鏈基因片段L2與載體片 段混勻，在連接試劑的作用下，16°C反應(yīng)12h。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑克隆、提取質(zhì)粒并測(cè) 序鑒定，結(jié)果該重組表達(dá)載體中基因的插入方向正確及插入序列正確，記作重組表達(dá)載體 PIRES/L2。克隆有重鏈恒定區(qū)基因的pMD18-T載體用BamH I和Not I酶切 pIRES-Anti-⑶20，回收重鏈恒定區(qū)片段，克隆于亦用BamH I和Not I酶切的pMD18_T載體， 測(cè)序鑒定，得到正確的克隆有重鏈恒定區(qū)基因的PMD18-T載體。以重組表達(dá)載體PIRES/L2為模板，用Xba I和Not I酶切，回收載體大片段，記 作片段1 ；以克隆有重鏈可變區(qū)基因的PMD18-T載體(即pMD18-T/S2Hb)為模板，用XbaI 和BamH I酶切，回收重鏈可變區(qū)片段，記作片段2 ；以克隆有重鏈恒定區(qū)基因的pMD18_T 載體為模板，用BamH I和Not I酶切，回收重鏈恒定區(qū)片段，記作片段3 ；將片段1、2和片 段3連接，得到重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑克隆、提取質(zhì)粒并測(cè)序鑒定。結(jié)果表明， 得到的重組表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)正確，插入的基因的方向及順序正確；抗體的輕重鏈基因共用同一個(gè)啟動(dòng)子，通過(guò)IRES序列連接，最終構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒。將陽(yáng)性重組表達(dá)載體記作pIRES-Anti-uPAR(圖 2)。二、載體轉(zhuǎn)化及抗體的表達(dá)293T細(xì)胞(293T人胚腎T細(xì)胞)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(American type culturecollection，ATCC,又稱(chēng)美國(guó)模式菌種收集中心)，產(chǎn)品目錄號(hào)為CRL-11268 ； Lipofectamine 2000 購(gòu)自 Invitrogen 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 12566014 ;HyQSFM4CH0 培養(yǎng)基 購(gòu)自HyClone公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為SH30518. 02 ；rProtein A層析柱購(gòu)自購(gòu)自GE Healthcare 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為17-5080-01。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為12100-046 ； 山羊抗人-IgG-HRP抗體購(gòu)自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為046K4801。將293T細(xì)胞按IX 106/ml分別接種于直徑為IOcm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中裝有 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5% CO2孵箱，培養(yǎng)。取5 μ g步驟一中得到的質(zhì)粒 pIRES-Ant i_uPAR轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，具體操作參照Lipofectamine 2000的試劑說(shuō)明。得到 重組細(xì)胞293T-pIRES-Anti-uPAR。將重組細(xì)胞293T-pIRES-Anti_uPAR用無(wú)血清DMEM培養(yǎng) 基培養(yǎng)，培養(yǎng)6 8h后吸出無(wú)血清培養(yǎng)基，代之以HyQSFM4CH0培養(yǎng)基。相同條件下繼續(xù)共 培養(yǎng)84h，間隔12h收取一次細(xì)胞上清，用ELISA法初步檢測(cè)抗體的表達(dá)。擴(kuò)大轉(zhuǎn)染體系，收 集細(xì)胞培養(yǎng)上清4 5L，調(diào)pH至6. 0 7. 0，用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，再用rProtein A層析 柱純化抗體，具體操作參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。ELISA法用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法1.包被用0. 05M PH9. 0碳酸鹽包被緩沖液將抗體(一抗為山羊抗人IgG)稀釋 至蛋白質(zhì)含量為1 lOyg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0. lml，4°C過(guò)夜。次日， 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同)。2.加樣加一定稀釋的待檢樣品0. Iml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37°C孵育1 小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)。3.加酶標(biāo)抗體(二抗為山羊抗人IgG-HRP (山羊抗人IgG-辣根過(guò)氧化物酶))于 各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0. Iml0 37°C孵育0. 5 1小 時(shí)，洗滌。4.加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0. Iml, 370C 10 30分鐘。5.終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0. 05ml。6.結(jié)果判定可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程 度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ + ”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值 在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD 值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2. 1倍，即為陽(yáng)性。試劑(1)包被緩沖液(PH9. 60. 05M碳酸鹽緩沖液)=Na2CO3L 59克，NaHC032. 93克，加蒸 餾水至1000ml。(2)洗滌緩沖液(PH7. 4PBS) 0. 15M =KH2PO4O. 2 克，Na2HPO4 · 12Η202· 9 克，NaCl 8. 0 克，KCl 0. 2 克，Tween-200. 05% 0. 5ml，加蒸溜水至 1000ml。(3)稀釋液牛血清白蛋白(BSA)O. 1克加洗滌緩沖液至100ml或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5 10%使用。(4)終止液(2M H2S04)蒸餾水178. 3ml，逐滴加入濃硫酸(98% )21. 7ml。結(jié)果如圖5所示，圖5中，Al為空白對(duì)照，B1-B12為重組表達(dá)載體 pIRES-Anti-uPAR瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，不同細(xì)胞培養(yǎng)皿表達(dá)的Y2B抗體。結(jié)果表明構(gòu)建的 pIRES-Anti-uPAR在293T細(xì)胞獲得表達(dá)，得到目的蛋白Y2B抗體。盡管不同細(xì)胞培養(yǎng)皿表 達(dá)量有差異，這可能與轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞狀態(tài)和載體量等因素有關(guān)。用rProtein A層析柱純化抗體純化介質(zhì)HiTrap rProtein A FF，5ml，購(gòu)自GE公司，目錄號(hào)17-5079-01，詳細(xì)使用說(shuō)明書(shū)請(qǐng)參閱其公司提供的說(shuō)明書(shū)。操作1)清洗，用IM NaOH和ddH20先后清洗管道，將小濾器用0. IM NaOH煮沸IOmin后 再用ddH20浸泡1 2min ；2)設(shè)定程序，連接rProtein A親和層析柱；3)用20mM結(jié)合緩沖液(pH7. 0)平衡層析柱；4)將已制備好的細(xì)胞上清以1 2ml/min的流速上樣；細(xì)胞上清制備以12000g 離心15分鐘，取出上清，經(jīng)過(guò)0. 22um硝酸纖維素濾膜過(guò)濾除菌。5)上樣將要結(jié)束時(shí)用IM洗脫緩沖液(pH3. 0)洗脫目的蛋白；6)收集蛋白，用Trise堿(ρΗ9· 0)將其ρΗ調(diào)至7. 0，電泳檢測(cè)；7)按步驟1)清洗管道和小濾器。磷酸鈉鹽緩沖液(結(jié)合緩沖液)用作ProteinA純化的結(jié)合緩沖液。配制方法為 取 IM Na2HP0457. 7ml 和 IM NaH2P0442 . 3ml 混勻，即為 0. IM pH7. 0 的磷酸鈉鹽緩沖液 100ml， 再用蒸餾水稀釋至20Mm備用。檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(洗脫緩沖液)用作ProteinA純化的洗脫緩沖液。配 制方法為取0. IM檸檬酸186ml和0. IM檸檬酸鈉14ml混勻，即為0. IM ρΗ3· 0的檸檬酸鹽 緩沖液200ml。分別取15 μ 1純化抗體Υ2Β在12 %凝膠上進(jìn)行還原SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮 蘭R-250染色。結(jié)果顯示，純化所得抗體的重鏈的相對(duì)分子質(zhì)量分別為50 X 103，輕鏈的相 對(duì)分子質(zhì)量為25Χ103(圖3中，泳道3為抗體的重鏈和輕鏈，泳道1為蛋白相對(duì)分子質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn))，與預(yù)期結(jié)果一致。Rituxan(藥名美羅華)(通用名利妥昔單抗注射液)購(gòu)自上海羅氏制藥有限公 司，制造商F. Hoffmann-La Roche Inc.免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)分別取15 μ 1純化抗體在12%凝膠上進(jìn)行還原SDS-PAGE電 泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，取出膜用封閉液(含有5%脫脂奶粉的1XPBST)在室溫封閉 2h，用1 5000稀釋的羊抗人IgG-HRP抗體與之孵育2h (室溫)，再用1 XPBST洗膜3次。 最后用ECL顯色，用X線片進(jìn)行曝光。結(jié)果如圖6所示(1是標(biāo)準(zhǔn)品RituXan;3是Y2B抗 體)。結(jié)果表明獲得的Y2B抗體可與羊抗人IgG特異性結(jié)合。分子量大小與預(yù)期結(jié)果一致。實(shí)施例3、抗體的功能一、Biacore檢測(cè)人源化抗體Y2B與抗原的結(jié)合能力uPAR 蛋白購(gòu)自 R&D Systems，產(chǎn)品目錄號(hào)為 807-UK-100。Sensor Chip CM5 購(gòu)自 BD 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為 Br-1000-14 ;BD BioCoat Matrigel Invasi。nChamber 購(gòu)自 BD 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為354480.用Biacore3000設(shè)備測(cè)定抗體Y2B與uPAR的親和力。配制不同pH值(4· 0，4· 5， 5 · 0和5. 5)的10mmol/L NaAc稀釋uPAR蛋白，在CM5芯片上做預(yù)濃縮，選擇最適pH值的 NaAc稀釋蛋白。將純化的抗體共價(jià)偶聯(lián)于CM5傳感芯片上，流動(dòng)相為HBS-EP (pH7. 4)，流速 20μ 1/min，取抗體五種濃度(0，12. 5，25、50和1 OOnmo 1/L)與uPAR蛋白結(jié)合親和力的檢 測(cè)。親和力用BiaCOre3000附帶軟件計(jì)算。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。將純化的抗uPAR人源化抗體Y2B與抗原uPAR結(jié)合，Biacore檢測(cè)其結(jié)合能力，結(jié)果顯示Y2B與抗原的親和力為1. 49 X lO—W/L (圖4)。二、腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)HeLa細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(American type culture collection，ATCC，又 稱(chēng)美國(guó)模式菌種收集中心)，產(chǎn)品目錄號(hào)為CCL-2 ；人IgG購(gòu)自購(gòu)自北京新經(jīng)科生物技術(shù)公 司，產(chǎn)品目錄號(hào)為30101 ；用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。用無(wú)血清DMEM水化侵襲室(invasion chamber), 孵育211(371，5%0)2)。棄無(wú)血清01^11，在侵襲室的孔室加入75(^1 DMEM(含10%血清)； 在插入(insert)室中加入475 μ 1 DMEM (含1 %血清)，然后向其中加入25 μ 1消化的HeLa 細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)> 105/500 μ 1)，最后分別向插入室中加入陰性對(duì)照人IgG和人源化抗體Υ2Β， 每個(gè)樣品均有兩個(gè)復(fù)孔，抗體終濃度均為lOOng/ml。孵育24h后，將未能穿透侵襲盒基底膜 的細(xì)胞用無(wú)菌棉簽擦去；穿透基底膜的細(xì)胞固定、染色、室溫晾干后，光鏡計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理在100倍顯微鏡下計(jì)算每個(gè)插入室中樣品的相應(yīng)3組細(xì)胞數(shù)。運(yùn)用 SPSS12. 0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，將Y2B組與人IgG組比較。若結(jié)果為 P < 0. 05，兩種處理效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示(表1)人IgG組與Y2B組 的P值小于0. 01，抗uPAR抗體Y2B與對(duì)照組人IgG組相比，差異顯著，對(duì)HeLa腫瘤細(xì)胞的 侵襲具有顯著的抑制作用。表1、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的t檢測(cè)結(jié)果
Hη細(xì)胞平均數(shù)(個(gè))
人 IgG 組8146±16.531
Υ2Β 組844.5±10.5**
I注與人IgG 組對(duì)比，**Ρ < 0. 01 ；序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所<120> 一種抗uPAR人源化抗體及其編碼基因<160>10
<210>1
<211>237
<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>1Val Ser Arg Ala Ala Thr Met Asp Phe Gln Val Gln lie lie Ser Phe151015Leu Leu lie Ser Ala Ser Val lie Met Ser Arg Gly Asp lie Gln Met202530Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr354045lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr lie His Trp Tyr Gln505560Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Pro Leu Met Tyr Glu Ala Ser Ser65707580Arg Ala Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr859095Glu Tyr Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Ser Asp Asp Phe Ala Thr100105110Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr115120125Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe130135140Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys145150155160Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val165170175Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln180185190Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser195200205Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His210215220Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg225230235<210>2<211>711<212>DNA<213>人工序列
<220><223><400>2gtgtctagag ccgccaccat ggattttcag gtgcagatta tcagcttcct gctaatcagt 60gctagcgtca taatgtccag aggagacatc cagatgactc agtccccatc tactctgtct 120gcttccgttg gcgaccgtgt taccatcact tgccgtgctt ctagctccgt ttcttacatc 180cactggtacc agcaaaagcc gggtcgtgct ccgaagccac tgatgtacga ggcttcctct 240cgcgctactg gagttccatc tcgcttctct ggttccggtt ctggcactga gtacactctg 300actatctcct ctctgcagag cgacgacttc gctacttact actgccagca gtggaactac 360ccattcactt tcggacaggg tactaagctg gagatcaagc gtactgttgc tgctccatct 420gttttcatct tcccaccgtc cgacgagcag ctgaagtctg gcactgcttc tgttgtctgc 480ctgctgaaca atttctaccc gcgcgaggct aaggttcagt ggaaggttga caacgctctg 540cagtccggta actcccagga gtctgttact gagcaggact ctaaggactc tacttactct 600ctgtcctcaa ctctgactct ctctaaggct gactacgaga agcacaagct gtacgcttgc 660gaggttactc accagggtct gtcctctcca gttactaagt ctttcaaccg t711<210>3<211>234<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>3Val Ser Arg Ala Ala Thr Met Gly Trp Ser Leu lie Leu Leu Phe Leu151015Val Ala Val Ala Thr Arg Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser202530Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys354045Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr lie His Trp Val Arg Gln505560Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp lie Gly Trp lie Phe His Gly Ser65707580Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr lie Thr859095Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg100105110Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Pro His Trp115120125Tyr Phe Asp Ala Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro Ala
130135140Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser145150155160Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe165170175Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly180185190Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu195200205Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr210215220lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn225230<210>4<211>702<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4gtgtctagag ccgccaccat gggttggagc ctcatcttgc tcttccttgt cgctgttgct 60acgcgtgtcc tgtccgaggt tcagctggtt cagtccggtg ctgaggttaa gaagccaggt 120tcctctgtta aggtttcttg caaggcttct ggctacactt tcaccgacta ctacatccac 180tgggttcgtc aggctccagg ccagggtctg gagtggatcg gttggatctt ccacggttct 240gacaacactg agtacaacga gaagttcaag tctaaggcta ctatcactgc tgacgagtcc 300acttctaccg cttacatgga gctgtcctct ctgcgttccg aggacactgc tgttttctac 360tgcgctcgtt ggggtccaca ctggtacttc gacgcttggg gtcgtggtac tctggttact 420gtttccccag cttctaccaa gggtccatcc gttttcccac tggctccgtc ctctaagtct 480actagcggcg gtactgccgc tctgggttgc ctggttaagg actacttccc agagccagtt 540actgtttcat ggaactcagg tgctctgact tctggcgttc acactttccc tgctgttctg 600cagtcctctg gtctgtacag cctgtcttcc gttgtcactg ttccgtccag ctctctgggt 660actcagacat acatctgcaa cgttaaccac aagccatcca ac702<210>5<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>5
cggatccgct agccgccacc atggacatcc agatgactca gtccccatct actctgtctg 60cttccgt67<210>6<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6cggaattctc aggaactcca gtagcgcgag aggaagcctc gtacatcagt50<210>7<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>7gtgtctagag ccgccaccat ggaggttcag ctggttcagt ccggtgct48<210>8<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>8gtgggatcca cttacctgtc ttaggctcaa ccttcttgtc aaccttagt49<210>9<211>330<212>PRT<213〉人工序列<220><223><400>9Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys151015Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr202530Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser354045
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser505560Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65707580Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys859095Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100105110Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro115120125Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130135140Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145150155160Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165170175Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu180185190His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195200205Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly210215220Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu225230235240Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr245250255Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn260265270Asn Tyr Lys Ala Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe275280285Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn290295300Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305310315320Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325330<210>10<211>1795<212>DNA
〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400>10gctagcaccaagggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg60ggcacagcggccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg120tggaactcaggcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca180ggactctactccctcagcag cgtggtgaca gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc240tacatctgcaacgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agcaacaggt300aagtggatccggagggaggg tgtctgctgg aagcaggctc agcgctcctg cctggacgca360tcccggctatgcagccccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg420gaggcctctgcccgccccac tcatgctcag ggagagggtc ttctggcttt ttccccaggc480tctgggcaggcacaggctag gtgcccctaa cccaggccct gcacacaaag gggcaggtgc540tgggctcagacctgccaaga gccatatccg ggaggaccct gcccctgacc taagcccacc600ccaaaggccaaactctccac tccctcagct cggacacctt ctctcctccc agattccagt660aactcccaatcttctctctg cagagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc720gtgcccaggtaagccagccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag780agtagcctgcatccagggac aggccccagc cgggtgctga cacgtccacc tccatctctt840cctcagcacctgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg900acaccctcatgatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg960aagaccctgaggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga1020caaagccgcgggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc1080tgcaccaggactggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc1140cagcccccatcgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccgtggg gtgcgagggc1200cacatggacagaggccggct cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc tgtaccaacc1260tctgtccctacagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat1320gagctgaccaagaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac1380atcgccgtggagtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaaggc cacgcctccc1440gtgctggactccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg1500tggcagcaggggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac1560acgcagaagagcctctccct gtctccgggt aaatgagtgc gacggccggc aagcccccgc1620tccccgggctctcgcggtcg cacgaggatg cttggcacgt accccgtgta catacttccc1680gggcgcccagcatggaaata aagcacccag cgctgccctg ggcccctgcg agactgtgat1740ggttctttccacgggtcagg ccgagtctga ggcctgagtg gcatgaggga ggcag179權(quán)利要求
一種抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
2.權(quán)利要求1所述抗體的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述重鏈可變區(qū)的編碼基因?yàn)槿缦?1)、2)或3)所示1)其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；3)與序列表中序列4自5'末端起第157-171bp和261-283bp位核苷酸具有70%以上 的同源性且編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子；所述輕鏈的編碼基因?yàn)槿缦翴)、II)或III)所示I)其核苷酸序列是序列表中序列2所示DNA分子；II)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼所述輕鏈的DNA分子；III)與序列表中序列2自5'末端起第160-184bp和217-250bp位核苷酸具有70%以 上的同源性且編碼所述輕鏈的DNA分子；所述抗體中包括重鏈恒定區(qū)；所述重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列9所示； 所述重鏈恒定區(qū)的編碼基因?yàn)槿缦耡)、b)或c)所示a)其核苷酸序列是序列表中序列10所示DNA分子；b)在嚴(yán)格條件下與a)限定的DNA序列雜交且編碼所述重鏈恒定區(qū)的DNA分子；c)與a)限定的DNA序列具有70%以上的同源性且編碼所述重鏈恒定區(qū)的DNA分子。
4.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物對(duì)，其特征在于所述引物對(duì)為如下引物對(duì)1)一條引物序列如序列表中序列5所示，所述引物對(duì)中的另一條引物序列如序列表中 序列6所示；2)一條引物序列如序列表中序列7所示，所述引物對(duì)中的另一條引物序列如序列表中 序列8所示。
6.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。
7.一種制備權(quán)利要求1所述抗體的方法，是將權(quán)利要求2或3所述編碼基因?qū)胨拗?細(xì)胞中，培養(yǎng)，得到所述抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中，是通過(guò)重組載體將權(quán)利要求 2或3所述編碼基因?qū)胨拗骷?xì)胞中的；所述重組載體中既含有權(quán)利要求2或3所述重鏈 可變區(qū)的編碼基因又含有權(quán)利要求2或3所述輕鏈的編碼基因，且所述重鏈可變區(qū)的編碼 基因和所述輕鏈的編碼基因在所述重組載體中受同一啟動(dòng)子的調(diào)控。
9.一種抑制尿激酶型纖溶酶原激活物受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑、一種抑制腫瘤細(xì)胞 侵襲的抑制劑或一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物，其活性成分為權(quán)利要求1中所述抗體、權(quán) 利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求6中所述重組載體、權(quán)利要求6中所述重組菌、權(quán)利 要求6中所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和/或權(quán)利要求6中所述表達(dá)盒。
10.權(quán)利要求1中所述抗體、權(quán)利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求6中所述重組載 體、權(quán)利要求6中所述重組菌、權(quán)利要求6中所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求6中所述表達(dá)盒 在制備抑制尿激酶型纖溶酶原激活物受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑中的應(yīng)用；權(quán)利要求1中所述抗體、權(quán)利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求6中所述重組載體、權(quán)利要求6中所述 重組菌、權(quán)利要求6中所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求6中所述表達(dá)盒在制備抑制腫瘤細(xì)胞 侵襲的抑制劑中的應(yīng)用；權(quán)利要求1中所述抗體、權(quán)利要求2或3所述編碼基因、權(quán)利要求6中所述重組載體、權(quán)利要求6中所述重組菌、權(quán)利要求6中所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或權(quán)利要求 6中所述表達(dá)盒在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗uPAR人源化抗體及其編碼基因。該抗體，其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，其輕鏈的氨基酸序列如序列表中序列1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明抗體具有良好的結(jié)合活性(親和力為1.49×10-8mol/L)和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)遷移能力。本發(fā)明的人源化抗體能更好與uPAR結(jié)合，從而保證了其抗腫瘤效應(yīng)。本發(fā)明制備抗體的方法，能夠同時(shí)表達(dá)輕鏈和重鏈，使輕鏈和重鏈的表達(dá)比例更接近1∶1，產(chǎn)生更高比率的相互匹配雙鏈抗體。綜上，所述本發(fā)明抗體及其制備方法在預(yù)防和/或治療腫瘤的領(lǐng)域?qū)⒂袕V闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/13GK101798349SQ20091024231
公開(kāi)日2010年8月11日 申請(qǐng)日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月9日
發(fā)明者戴維·威孚, 曹誠(chéng), 米歇爾·瑞奇韋茲, 靳彥文 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所